OBIECTIVE GENERALE

Realizarea unei cercetari complexe interdisciplinare, prin interconectarea domeniilor biologic (genetica), biochimic (biologie moleculara) si veterinar (asigurarea sigurantei alimentare). Aplicarea unor metode moderne de biologie moleculara pentru imbunatatirea radicala a conceptelor procesului de identificare si cuantificare a organismelor modificate genetic (soia modificata genetic) in alimente.

Informare privind Organismele Modificate Genetic

1. CE SUNT ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC (OMG) SI ALIMENTELE

OBTINUTE DIN OMG?

OMG = organisme in care materialul genetic a fost modificat (ADN), intr-un mod care nu se produce prin mecanisme naturale („tehnologii moderne”, „tehnologie genetica”, „tehnologie de recombinare a ADN”, „inginerie genetica”). Gene individuale, selectate datorita calitatilor lor, sunt transferate de la un organism la altul, chiar si intre specii diferite.

Rezulta crearea de plante modificate genetic, ale caror seminte sunt apoi utilizate la cultivare (culturi modificate genetic).

2. DE CE SE PRODUC ORGANISME MODIFICATE GENETIC ?

OMG se produc si se comercializeaza pentru a aduce avantaje producatorului si consumatorului de alimente obtinute din OMG. Avantajele inseamna: preturi mai mici, beneficii mai mari privind durabilitatea si/sau valoarea nutritiva. Obiectivul initial a fost acela de protejare a culturilor, prin crearea rezistentei impotriva bolilor si daunatorilor la plante (insecte si virusuri), sau prin crearea unei mai bune tolerante la erbicidele utilizate in agricultura.

- Rezistenta impotriva insectelor s-a obtinut prin incorporarea in planta utilizata ca materie prima pentru alimente, a unei gene ce induce producerea unei toxine, gena prelevata de la un microorganism (Bacillus thuringiensis - BT). Aceasta toxina este utilizata de mult timp ca un insecticid conventional in agricultura, fiind netoxic pentru consumul uman. Culturile MG care produc permanent aceasta toxina, s-au dovedit a avea nevoie de cantitati mult mai mici de alte insecticide, folosite pentru situatii specifice, cand presiunea unor populatii mari de daunatori este mare.

- Rezistenta impotriva virusurilor se obtine prin introducerea de gene de la anumite virusuri care provoaca bolile plantelor. Cresterea rezistentei impotriva virusurilor face plantele mai putin vulnerabile la boli cauzate de acestea, marind astfel productivitatea.

- Toleranta la erbicide se obtine prin introducerea unei gene de la o bacterie care manifesta rezistenta la unele erbicide. In situatii in care a fost imperativa utilizarea erbicidelor, cantitatile necesare de ierbicid au fost mult mai mici.

3. ALIMENTELE PRODUSE DIN OMG („ALIMENTE NOI”) SE EVALUEAZA DIFERIT DIN PUNCTUL DE VEDERE AL SIGURANTEI ALIMENTULUI, FATA DE ALIMENTELE TRADITIONALE?

Consumatorii considera, in general, ca alimentele traditionale, unele cu istorie de mii de ani, sunt sigure. Atunci cand se realizeaza alimente noi, obtinute prin metode naturale, unele dintre caracteristicile cunoscute de la alimentele traditionale se modifica, in bine sau in rau. Autoritatile din domeniul controlului oficial al alimentului efectueaza curent analize de risc pentru alimentele traditionale. Este, desigur, nevoie de metode adecvate de analiza a riscului pentru alimentele noi. Toata lumea este de acord ca sunt necesare metode specifice de analiza a riscului si de aceea au fost elaborate metode specifice, riguroase, pentru OMG si pentru alimentele noi, obtinute din OMG, in relatia lor cu sanatatea animalelor si a omului, precum si cu mediul. Asadar, evaluarea la punerea pe piata a alimentelor este foarte diferita in cazul alimentelor traditionale, fata de cele noi, obtinute din OMG.

OMS are un program special pentru asistarea autoritarilor nationale in identificarea alimentelor care trebuie sa fie supuse evaluarii riscului, inclusiv pentru cele obtinute din OMG.

4. CUM SE DETERMINA RISCUL POTENTIAL AL OMG SI AL ALIMENTELOR DIN OMG PENTRU SANATATEA OMULUI?

Prin evaluarea sigurantei alimentelor obtinute din OMG se au in vedere:

(a) efectele directe asupra sanatatii (toxicitate),

(b) tendintele de a provoca reactii alergice (alergenicitate);

(c) componentele specifice care ar putea avea proprietatea nutritionale sau toxice;

(d) stabilitatea genelor inserate;

(e) efectele nutritionale asociate modificarii genetice;

(f) orice efecte nedorite ce ar putea rezulta prin transferul genetic.

5. CARE SUNT PRINCIPALELE PROBLEME DE INTERES PENTRU SANATATEA OMULUI LEGATE DE OMG ?

In urma discutiilor teoretice care au acoperit o arie larga de aspecte, cele trei puncte principale de dezbatere sunt: alergenicitatea, transferul genetic si transferul natural al genelor transferate artificial, la celelalte culturi.

- Alergenicitatea: nu au fost evidentiate efecte alergice legate de alimentele noi (MG) comercializate pana in prezent.

- Transferul de gene din alimentele noi (MG) in organismul uman sau la bacterii aflate in intestinul uman: daca este posibil si, daca da, materialul genetic transferat poate afecta sanatatea oamenilor? Acest subiect este important indeosebi pentru genele care induc rezistenta la substante chimice, in acest caz, la antibiotice, daca transferul de gene ar fi posibil. Cu toate ca probabilitatea acestui transfer este foarte mica, expertii Fondului pentru Alimentatie si Agricultura –FAO si expertii OMS au recomandat neutilizarea proceselor de transfer al genelor de rezistenta la antibiotice la noile OMG.

- Transferul natural in culturi si amestecarea semintelor provenite din culturile naturale, cu cele din transfer genetic, ar putea afecta siguranta alimentelor. Acest risc este real si a fost demonstrat atunci cand, urme de orez aprobat a fi utilizat doar pentru nutreturi, au fost decelate in produsele de orez pentru consum uman, obtinute din culturi care nu fusesera modificate genetic in mod voluntar, in SUA. S-au adoptat strategii nationale pentru reducerea mixarii, prin separarea clara a perimetrelor cu culturi (OMG si culturi conventionale).

In acest moment se pun la punct la nivel mondial detaliile pentru: monitorizarea post punere pe piata a OMG si alimentelor noi din OMG, supravegherea continua a sigurantei alimentelor obtinute din OMG.

6. CUM SE DERULEAZA O ANALIZA A RISCULUI PENTRU MEDIU?

Analizele de risc acopera atat un anumit OMG, cat si mediul care il gazduieste. Procesul de analiza a riscului include evaluarea caracteristicilor OMG, efectele si stabilitatea sa in mediu, combinate cu caracteristicile ecologice ale mediului in care va fi introdus acest OMG. Analiza are in vedere si efectele neasteptate, ce ar putea rezulta in urma procesului de insertie genetica.

7. CE PROBLEME PRIVIND OMG PREOCUPA IN LEGATURA CU MEDIUL?

- abilitatea OMG de a „scapa” si, eventual, de a introduce gene noi in populatiile salbatice, naturale;

- persistenta genei in mediu, dupa recoltarea culturilor de plante MG;

- susceptibilitatea organismelor ne-tinta (ex.: insecte care nu sunt daunatoare) la proprietatile produsului modificat genetic;

- stabilitatea genelor;

- reducerea nedorita a gamei de alte plante, cu impact asupra biodiversitatii;

- utilizarea crescuta a substantelor chimice in agricultura.

Aspectele de siguranta a mediului legate de OMG variaza in functie de conditiile locale.

Investigatiile au avut in vedere:

- efectele negative potentiale asupra insectelor utile sau o inducere mai rapida a rezistentei unor insecte;

- potentialul de a genera noi patogeni ai plantelor;

- consecintele potential negative asupra biodiversitatii si vietii salbatice;

- scaderea practicilor foarte importante de rotare a culturilor;

- transferul rezistentei sau tolerantei crescute artificial la erbicide de la OMG la alte plante, daunatoare.

8. ALIMENTELE NOI, OBTINUTE DIN OMG SUNT SIGURE?

Obtinerea de OMG diferite presupune utilizarea de gene diferite inserate si tehnici diferite de transfer genetic. Alimentele obtinute difera intre ele si siguranta lor se analizeaza de la caz la caz, fara a putea emite generalitati despre siguranta tuturor alimentelor din OMG.

Alimentele noi din OMG care se comercializeaza in prezent pe piata mondiala au trecut faza analizelor de risc si nu prezinta riscuri pentru sanatatea populatiei. Nu exista inregistrate pana in prezent informatii din care sa fi rezultat efecte negative asupra sanatatii omului, ca urmare a consumului de alimente din OMG, informatii provenind din foarte multe tari. Analiza continua a riscului, bazata pe principiile Codex Alimentarius si,

acolo unde este cazul, monitorizarea post punere pe piata, trebuie sa stea la baza evaluarii sigurantei alimentelor obtinute din OMG.

9. CUM ESTE REGLEMENTATA LA NIVEL NATIONAL PROBLEMA OMG SI A ALIMENTELOR OMG, IN LUME?

Modurile in care autoritatile nationale au reglementat aceasta problema sunt diferite. In unele tari problema nu este acoperita cu reglementari. Tarile care au elaborat o legislatie se concentreaza mai ales pe analiza riscurilor pentru sanatatea consumatorilor. Tarile care au legislatie pentru alimente OMG acopera si OMG, in general, avand in vedere atat sanatatea, problemele de mediu, cat si problema practic a de control si de comert (posibilitatile de testare si cerintele privind etichetarea). Este evident ca aceasta problema este in evolutie continua.

ROMANIA – a adoptat legislatia UE in materie de OMG:

Hotararea 256/2006 privind hrana pentru animale si alimentele modificate genetic – transpune Regulamentul 1829/2003 privind hrana pentru animale si alimentele modificate genetic.

Hotararea 173/2006 privind trasabilitatea si etichetarea organismelor modificate genetic si trasabilitatea alimentelor si hranei pentru animale obtinute din organisme modificate genetic – transpune Regulamentul 1830/2003 privind trasabilitatea si etichetarea organismelor modificate genetic si trasabilitatea alimentelor si hranei pentru animale, obtinute din organisme modificate genetic.

10. CE TIPURI DE ALIMENTE DIN OMG SE COMERCIALIZEAZA IN PREZENT PE PLAN INTERNATIONAL?

Pe piata se afla acum toate cele trei tipuri de OMG pentru infiintare de culturi de plante:

- rezistente la atacurile insectelor;

- rezistente la infectiile virale;

- cu toleranta crescuta la erbicide.

Toate genele utilizate pentru aceste modificari provin de la microorganisme.

11. CE SE INTAMPLA CAND ALIMENTE OBTINUTE DIN OMG SUNT COMERCIALIZATE INTERNATIONAL?

Exista deja un numar de reglementari internationale, dar se lucreaza la elaborarea de protocoale pentru OMG. Comisia Codex Alimentarius este un organism mixt OMS / FAO responsabil pentru elaborarea standardelor, codurilor de practica, ghidurilor si recomandarilor care constituie Codex Alimentarius = codul international al alimentului. Codex a elaborat in 2003 - 2004 si principiile pentru analiza riscurilor pentru om al alimentelor obtinute din OMG. Principiile Codex sunt mentionate, in mod special, in Acordul Sanitar si Fito- Sanitar (SPS) al Organizatiei Mondiale a Comertului (WTO) si pot fi utilizate ca referinta in disputele internationale ce se pot ivi.

Protocolul de Biosecuritate de la Cartagena (CPB), un tratat pentru mediu, reglementeaza circulatia transfrontaliera a OMG vii (LMOs). Elementul esential al Protocolului de Biosecuritate (CPB) este cerinta ca exportatorii sa solicite acordul importatorilor, inainte ca primul transport de OMG vii care urmeaza a fi „eliberate” in mediu, sa fie pregatit pentru livrare.

UE a elaborat reglementari privind OMG si alimentele produse din OMG, transpuse deja in legislatia romaneasca.

12. PRODUSELE OBTINUTE DIN OMG DE PE PIATA INTERNATIONALA AU FOST SUPUSE UNEI ANALIZE A RISCULUI?

Toate produsele obtinute din OMG aflate pe piata internationala au fost supuse unor analize a riscului.

Analizele efectuate au fost foarte riguroase, au respectat principiile de baza privind sanatatea umana si mediul si nu au pus in evidenta riscuri pentru sanatatea omului.

13. DE CE S-A CREAT ACEST INTERES DEOSEBIT AL UNOR POLITICIENI, GRUPURI DE INTERES PUBLIC, CONSUMATORI, ASUPRA ALIMENTELOR DIN OMG, INDEOSEBI IN EUROPA?

Inca de la introducerea pe piata, pe la mijlocul anilor ’90, a unui aliment OMG major (boabe de soia rezistente la erbicide), s-a declansat si un interes crescand al politicienilor, activistilor si consumatorilor din Europa, mai ales, asupra subiectului. Au contribuit o serie de factori:

La sfarsitul anilor ’80, inceputul anilor ’90, rezultatele decadei din domeniul cercetarilor moleculare au ajuns la urechile publicului. Pana in acel moment, publicul nu era constient, in general, de potentialul acestor cercetari. Exista perceptia publica privind legatura dintre tehnologia moderna si crearea de specii noi. Intrebarea cea mai frecventa a consumatorilor este: „ce am eu de castigat din chestia asta?”. Cand este vorba de medicamente, consumatorii accepta mult mai repede tehnologiile noi, considerandu-le benefice pentru sanatate. In cazul primului produs MG introdus pe piata europeana, acesta nu parea sa aduca un beneficiu direct, vizibil, consumatorului (nu era mai ieftin, nu conferea o protectie directa, nu avea un gust mai bun). Potentialul semintelor de OMG de a duce la cresterea impresionanta a recoltelor/suprafata cultivata, ar fi dus la scaderea preturilor. Cu toate acestea, atentia publica s-a concentrat asupra riscului din ecuatia „risc / beneficiu”.Increderea consumatorilor europeni in alimentele de pe piata a fost afectata serios, in urma unor evenimente nedorite care s-au produs in a doua jumatate a anilor ’90, nelegate insa de problema OMG si a alimentelor noi (vezi crizele dioxina, Encefalopatie Spongiforma Bovina, etc.). Acest lucru a avut impact asupra discutiilor despre acceptabilitatea alimentelor din OMG. Consumatorii au avut indoieli chiar si asupra validitatii analizelor de risc (sanatate si mediu), concentrandu-se asupra eventualelor efecte pe termen lung. Alte subiecte de dezbatere de catre organizatiile consumatorilor au fost: alergenicitatea si rezistenta la antibiotice. Temerile consumatorilor au afectat chiar discutiile privind necesitatea etichetarii alimentelor obtinute din OMG, dorind a se permite „alegerea bazata pe informatie”. In acelasi timp, s-a demonstrat practic ca este dificila detectarea urmelor de OMG in alimente: deci cantitatile foarte mici de OMG in alimente nu pot fi detectate adesea.

14. CUM AU AFECTAT ACESTE TEMERI COMERTUL IN UE CU ALIMENTE DIN OMG?

Impactul a fost major. A e 323e47d xistat un Moratoriu privind punerea pe piata UE a acestor produse. A fost elaborata legislatie detaliata si cuprinzatoare inca din anii ‘90. Procedura de aprobare pentru OMG vii (seminte pentru culturi) cere parcurgerea unor etape dificile. Intre 1991 si 1998, a fost aprobata punerea pe piata UE a unui numar de 18 OMG-uri,

prin decizii ale Comisiei. In prezent 31 de OMG-uri sunt autorizate pentru punerea pe piata.

Unele state membre au invocat clauze de salvgardare, impunand bariere temporare pentru introducerea pe pietele lor, de exemplu pentru semintele de rapita pentru ulei, modificate genetic. Comitetul stiintific a analizat si a concluzionat ca restrictiile impuse nu se justifica.

UE, prin organismele sale a impus legislatie referitoare la: trasabilitate, etichetare, procedurile de autorizare, monitorizare, supraveghere, testare, etc.

Toate acestea au un singur scop: cresterea increderii consumatorului.

15. CE SE INTAMPLA IN CELELALTE REGIUNI ALE GLOBULUI, IN CEEA CE PRIVESTE ALIMENTUL OBTINUT DIN OMG?

- Desi diferite de la o tara la alta, dezbaterile se concentreaza asupra acelorasi teme, ca acelea prezentate anterior: riscuri, raport cost / beneficiu, mediu, sanatate, etc.

- Nu exista consens privind trasabilitatea, etichetarea.

- S-a realizat armonizarea viziunilor privind analiza riscului (protocolul de la Cartagena pentru Biosecuritate - CPB), ceea ce arata cresterea nivelului de intelegere a problemei. Recent, criza umanitara din sudul Africii, a ridicat problema utilizarii cerealelor obtinute din OMG pentru a suplini nevoia de alimente. Guverne din regiune au exprimat temeri privind siguranta acestor alimente. Unele dintre ele au fost de acord cu distribuirea ajutoarelor acordate, in anumite conditii, iar altele le-au refuzat, solicitand inlocuirea lor

cu cereale non OMG.

16. REACTIILE OAMENILOR DIN DIVERSELE REGIUNI ALE GLOBULUI, FATA DE ALIMENTELE OMG SUNT LEGATE DE ATITUDINILE DIFERITE FATA DE ALIMENTE ?

Atitudinile privind alimentul, in general, sunt diferite in functie de zona geografica. In afara considerentelor de ordin nutritional, atitudinea fata de aliment are adesea conotatii sociale si istorice, uneori chiar religioase, rituale. Modificarile tehnologice ale alimentelor si proceselor de productie pot genera reactii negative ale consumatorilor, in special acolo unde comunicarea privind eforturile intreprinse pentru analiza riscului si eforturile pentru evaluarea raportului cost / beneficiu nu exista sau este de slaba calitate.

17. CE EVOLUTII SUNT DE ASTEPTAT IN PERIOADA URMATOARE IN DOMENIUL OMG?

Este de asteptat ca lista cu viitoarele OMG sa includa plante cu rezistenta crescuta la boli si seceta, capabile sa furnizeze recolte cu niveluri nutritionale sporite, specii de peste cu caracteristici de crestere ameliorate si plante sau animale capabile sa produca proteine cu importanta medicala, cum ar fi chiar pentru realizarea de vaccinuri. FAO si OMS desfasoara continuu activitati privind evolutiile din acest domeniu.

Acest material utilizeaza un text de la Organizatia Mondiala a Sanatatii, pentru a oferi raspunsuri la intrebarile care se pun privind natura OMG si siguranta alimentelor ce contin OMG.

In aceste conditii cercetarea desfasurata in laboratorul nostru este orientata pentru testarea produselor alimentare care contin soia modificata genetic, de pe piata din Bucuresti.

OBIECTIVELE FAZEI DE EXECUTIE

Caracterizarea moleculara a plantei de soia modificata genetic

1.Scurta identificare

Denumire GTS 40-3-2

Solicitant Monsanto Canada Inc.

Denumirea speciei    Glycine max L. (soia)

Noi particularitati    Toleranta la glifosat, substanta activa a ierbicidului

RoundupR

Metoda propusa Acceleratia particulelor (biolistics)

Propunere de utilizare Productia de soia pentru hrana animalelor

(mai mult faina degresata prajita sau fulgi) si

pentru consum uman ( mai mult ca ulei,

fractiuni proteice si fibre dietetice)

2. Informatii primare

Soiul GTS 40-3-2 a fost dezvoltat de catre Monsanto Canada Inc. Pentru a permite utilizarea glifosatului ca o alternativa a sistemului de control al buruienilor in productia de soia.

Dezvoltarea GTS 40-3-2 s-a bazat pe tehnologia de ADN recombinat, prin introducerea unei forme tolerante de glifosat la enzima 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfat sintaza (EPSPS), izolata din tulpina CP4 a Agrobacterium tumefaciens, in varietatea de soia comerciala 'A5403' ( Asgrow Seed Company)

3.Descrierea noii particularitati;Toleranta la glifosat

Glifosatul, ingredientul activ al ierbicidului RoundupR, este un ierbicid sistemic aparut recent folosit in toata lumea ca un agent de control neselectiv al buruienilor.Glifosatul actioneaza ca un inhibitor competiriv al 5-enol-piruvilshikimate-3-fosfat sintaza (EPSPS), o enzima esentiala a caii biochimice implicata in obtinerea de aminoacizilor aromatici ca fenilalanina, tirozina si triptofan (fig. 1). Inhibarea EPSPS rezulta in reprimarea cresterii si moartea plantei.

Fig.1 – EPSPS catalizeaza reactia shikimate-3-fosfatului si fosfoenolpiruvatului (PEP) la

5-enolpiruvilshikimate-3-fosfat (EPSO) si fosfat. EPSP este un intermediar in sinteza aminoacizilor aromatici.Ca o consecinta a inhibarii caii biochimice, sinteza proteinelor este intrerupta, planta murind.

Inserarea genei de toleranta la glifosat codifica pentru o versiune bacteriologica ( derivata din tulpina CP4 a Agrobacterium tumefaciens) a acestei enzime esentiale, omniprezenta in plante, ciuperci si microorganisme, insensibile la glifosfat. Asadar poate indeplini necesitatile metabolice ale aminoacizilor aromatici ai plantei.

Gena EPSPS este sub ordonarea unui puternic promotor constitutiv din Virusul Mozaic de Conopida (P-CaMV E35S) si se termina cu nopalin-sintaza (T-nos) derivata din Agrobacterium tumefaciens (Fig.2).

Codarea secventiala a ADN-ului derivat dintr-o planta pentru peptida de transit de cloroplast (CTP4 din Petunia Hibrida) a fost clonata la capatul 5’ a genei de toleranta la glifosat.

Fig. 2 – Reprezentarea schematica a casetei genetice a plantei de soia Roundup Ready

Peptida indicatoare fusionata cu gena EPSPS usureaza importul unei noi enzime de translatie in cloroplaste, unde atat calea shikimate cat si cea a glifosatului sunt determinate.Odata ce importarea este indeplinita, peptida de tranzit este indepartata si degradata rapid de catre o proteaza specifica. EPSPS este singura tinta fiziologica a glifosatului in plante si nici o alta enzima utilizatoare de PEP nu este inhibata de glifosat.

Sinteza EPSP este ubicuitara in natura si nu se asteapta sa fie toxica sau alergenica.

Atunci cand a fost supusa analizei comparative cu secvente de polipeptide toxice sau alergenice, secventa de aminoacizi ai enzimei nu a prezentat o omologie semnificativa cu o alta toxina sau alergen cunoscut.

4. Metoda de dezvoltare

Varietatea de soia comerciala A5403 ( asgrow Seed Co.) a fost transformata prin procedeul de bombardare cu particule de aur, cu vectorul plasmid PV-GMGT04 recoltat din Escherichia coli. PV –GMGT04 contine codarea genetica a CP4 EPSPS pentru toleranta glifosatului, gena GUS pentru producerea β glucuronidazei ca marker selectabil, si gena nptII pentru rezistenta la antibiotice (kanamicina).Transformantul initial selectat prezenta doua pozitii de integrare, una cu marker-ul selectabil GUS si altul cu gena de toleranta la glifosat.

Aceste doua pozitii separate ulterior independent in urmatoarea generatie sexuala, si linia GTS 40-3-2, in urma analizelor, a fost gasita cu un singur sit de insertie, in care numai gena tolerantei la glifosat este integrata.

5. Stabilitatea insertiei caracteristicilor prezentate

Informatiile initiale (Padgette et al., 1995, 1996) indicau ca GTS 40-3-2 contine o singura caseta genetica functionala CP4 EPSPS, constand in promotorul Virusului Mozaicului Conopidei (CaMV) E35S, o peptida de transit a cloroplastului, secventa de codare CP4 EPSPS, si indicatorul tnos.

Nu a fost gasita inserarea nici unei regiuni de codare din exteriorul genei de fusiune a vectorului plasmid initial.Generatiile ulterioare au demonstrat ca nu a mai fost nici o segregare a genei de fuziune descrisa mai sus, prezentand faptul ca linia GTS 40-3-2 a fost homozigota pentru gena de fuziune.Analizele de ADN de-a lungul a sase generatii au demonstrat ca insertia a fost stabila.

Studii mai recente au demonstrat ca pe parcursul integrarii ADN-ului inserat au avut loc cateva rearanjari si ca, in aditie la insertia functionala primara, samanta de soia Roundup Ready 40-3-2 contine doua mici segmente nefunctionale de ADN inserat de 250bp si respectiv 72 bp.

Incepand cu anul 1993 cercetatorii au aratat faptul ca:

1) genomul liniei GTS 40-3-2 contine doua insertii ADN;

2) o prima insertie ADN din plasmida PV-GTGT04, localizata pe un fragment de restrictie Hind III de 5,8 kb, contine o portiune din promotorul E35S, secventa care codifica CP4 EPSPS si aproape tot elementul 3’NOS de terminare a transcriptiei;

3) un al doilea insert care hibrideaza slab cu o sonda moleculara intacta CP4;

4) EPSPS este localizat pe un fragment de restrictie Hind III de 900kb. Intensitatea slaba a semnalului la hibridare se afla numai o mica parte din gena CP4 EPSPS;

Genomul liniei 40-3-2 nu contine nici o alta secventa detectabila din ADN al plasmidei vector. Vectorul PV - GMGT04 a fost introdus in plantele de soia prin metoda accelerarii particulelor. Plasmida folosita, nu este mobila si nu are capacitatea de a fi transferata dupa ce a fost integrata in cromozomul plantei. Prezenta genelor inserate in planta poate fi determinata prin tehnicile Southern Blotting si/sau PCR.

Introducerea ADN in tesutul vegetal prin metoda accelerarii particulelor a fost descrisa in 1988 de catre CHRISTON J. ADN-ul a fost precipitat pe particule microscopice de aur folosind solutia de fosfat de calciu si apoi a fost uscat cu un jet de azot. Particulele invelite in ADN au fost suspendate in etanol si apoi imprastiate pe o membrana purtatoare. Pentru accelerarea membranei, a fost utilizata energia eliberata de explozia unei picaturi de apa plasate intre cei doi poli ai unui condensator. Membrana este oprita de un ecran de stopare, care lasa sa treaca numai particulele invelite in ADN. Particulele strabat peretii celulelor tinta, iar ADN care patrunde in citoplasma se integreaza in cromozomi.

In timpul procesului de transformare, ADN plasmidial se poate rupe intr-unul sau mai multe locuri inainte de a se integra in ADN din celula soiei. Celulele sunt incubate in mediul de cultura care contine citochinina si auxina, pentru a se induce formarea lastarilor. Lastarii care se dezvolta din celulele transformate exprima fenotipul codificat de genele prezente in ADN integrat in genomul celulei vegetale. ADN utilizat contine o gena himera pentru expresie in celula vegetala si o gena marker care codifica proteina ß-glucuronidaza (GUS) (JEFFERSON et al., 1986).

Expresia proteinei GUS serveste ca dovada a transformarii. Este detectata printr-o metoda de colorare, in care enzima GUS converteste un substrat (5-bromo-4-cloro-3-indolil ß-D-glucuramide) intr-un precipitat albastru. Tesutul vegetal care se coloreaza in albastru dupa reactia histochimica contine proteina GUS. Lastarii GUS pozitivi au fost crescuti pana la maturitate, iar plantele descendente au fost evaluate pentru toleranta la glifosat (prin stropirea cu Roundoup Ready) si exprimarea genei (FIG. 3).

Fig. 3 Harta plasmidului care include elemente genetice ale vectorului PV-GMGT04 utilizat in transformarea soiului de soia Roundup Ready in lina GTS 40-3-2

Da sau nu plantelor transgenice?

In ceea ce priveste posibilitatea toxicitatii unor produse alimentare obtinute din organisme modificate genetic, aici lucrurile nu sunt excluse, date fiind unele accidente aparute in urma consumului unor alimente provenite din materii prime insuficient controlate, fiind necesare studii extrem de laborioase asupra clarificarii acestor aspecte. De altfel, atat pe plan international cat si national au fost elaborate o serie de documente legislative care reglementeaza utilizarea organismelor modificate genetic pentru obtinerea de alimente de uz uman, fiind unanim acceptata ideea etichetarii obligatorii a produselor de acest tip. Se ofera consumatorului, in acest fel, posibilitatea de optiune in vederea utilizarii sau nu a produselor obtinute dlin materii prime de origine transgenica.

De asemenea, pentru a elimina posibilitatea ca anumite substante produse de organismele modificate genetic sa produca alergii dar, in acelasi timp sa nu se excluda utilizarea acestora, multe institutii nationale sau internationale iau masuri pentru elaborarea de teste rapide si eficiente de identificare a posibililor compusi alergeni sau daunatori.

EPILOG

Mauro Albrizio de la Biroul European de Mediu a specificat: „Dreptul de a consuma produse nemodificate genetic va fi compromis daca aceste culturi modificate genetic se vor extinde la scara larga. Comisia Europeana trebuie sa accepte ca nimeni nu vrea alimente modificate genetic si ca autoritatile publice nationale au toate drepturile sa isi protejeze consumatorii si mediul.”

In acest context realizarea obiectivelor fazei de cercetare permite supravegherea in domeniul introducerii in mediu a organismelor modificate genetic si respectiv continutul acestora in alimente prin implementarea unor metodologii de varf, la nivelul standardelor Uniunii Europene.

In urma realizarii acestei faze se pot obtine rezultate foarte valoroase cu aplicabilitate in siguranta si securitarea alimentara:

din punct de vedere a sigurantei alimentare: i) rezultatele vor servi producatorilor de alimente de origine animala in vederea unei etichetari corecte a produselor in conformitate cu cerintele Comunitati Europene; ii) monitorizarea obligatorie post-market; iii); informarea corecta a consumatorilor; iv)obligativitatea trasabilitatii si etichetarii in toate stagiile introducerii pe piata.

din punct de vedere economic: i) stabilirea valorii economice de introducere in mediu a organismelor modificate genetic si utilizarea acestora in productia de alimente; ii) formarea de personal inalt calificat in domeniu care sa faca fata cerintelor Europene; iii) posibilitatea realizarii trasabilitatii produselor va fi un nou pas in asigurarea lantului alimentar total si a securitatii alimentare.

din punct de vedere sanitar-veterinar si siguranta alimentelor: i) reducerea riscului folosirii in produsele alimentare a proteinelor vegetale provenite din soiuri modificate genetic; ii) continutul in OMG conform legislatiei Europene.

din punct de vedere stiintific: i) permite executarea de cercetari la nivelul genomului pentru toate soia modificata genetic; ii) stabilirea unor protocoale de analiza PCR si Real Time PCR pentru identidicarea si cuantificarea SMG; iii)realizarea unui ghid care sa cuprinda metodologia de lucru specifica fiecareia din tehnicile noi introduse in studiu care sa poata fi folosit de institutiile de profil; iv) publicarea si comunicarea de articole originale in publicatii nationale si internationale;

In acesta etapa a proiectuli ne propunem optimizarea unor protocoale de lucru bazate pe tehnici moderne de biologie moleculara pentru identificarea si cuantificarea SMG din produse alimentare de origine animala. Rezultatele atat intermediare cat si finale vor fi difuzate prin intermediul revistelor stiintifice interne si internationale, prin elaborare de lucrari stiintifice si participare la diferite sesiuni stiintifice atat in tara cat si in strainatate.

REZUMATUL FAZEI

S-au analizat un numar de 118 probe provenite din reteaua de hipermarketuri din Bucuresti. Probele au fost constituite din produse alimentare vegetale (soia) sau produse alimentare de origine animala care contin proteina vegetala (soia). Toate probele au fost analizate pentru screening prin tehnica PCR conventional, iar probele pozitive au fost cuantificate prin tehnica Real Time PCR. In capitolul “selectie probe” sunt prezentate rezultatele pentru 30 de tipuri de alimente analizate.

DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA

ACTIVITATEA II.1

Desemnare de primeri pentru amplificarea PCR si

Real Time PCR

Utilizarea eficienta a tehnicilor moderne de detectie a OMG depinde de disponibilitatea informatiilor precise. Detectia OMG necesita cel putin cunoasterea secventei tinta a genei si tipul de modificare genetica. Caracteristicile specifice ale liniilor transgenice soia RoundupReady sunt prezentate in urmatoarele capitole.

Au fost elaborate diferite tehnici PCR pentru detectia OMG aprobate pentru introducerea in mediu si implicit pentru consumul populatiei. Specificitatea PCR depinde de alegerea primerilor.

Plantele modificate genetic pot fi impartite in categorii in conformitate cu gena structurala introdusa. O metoda aditionala pentru a directiona specificitatea reactiei este alegerea primerilor specifici secventelor ADN.

Asa cum a fost descris mai sus, nevoia cuantificarii OMG prezente intr-o proba duce catre elaborarea multor protocoale bazate pe reactia PCR, care permit nu numai un raspuns calitativ (prezenta/absenta) cat si o indicatie mult mai precisa asupra cantitatii de OMG prezente in proba analizata. Cele doua abordari bazate pe analiza ADN, cel mai des utilizate sunt competitive – PCR si real-time PCR.

Reactia PCR utilizeaza doua secvente oligonucleotidice (primeri) care se hibridizeaza pe catenele opuse de ADN si flancheaza secventa tinta care trebuie amplificata. Extensia primerilor este catalizata de o polimeraza ADN termostabila. Acumularea exponentiala a fragmentului specific de ADN rezulta in urma unei serii de cicluri repetitive alcatuite din cele trei etape: denaturarea acidului nucleic de interes (sablonul), atasarea primerilor si extensia acestora sub actiunea polimeazei. Capetele fragmentului de amplificat sunt definite de catre capetele 5^' ale primerilor. Deoarece produsii sintetizati prin extensia primerilor intr-un anumit ciclu pot servi drept sablon in urmatorul ciclu, numarul copiilor ADN tinta se dubleaza aproximativ la fiecare ciclu; astfel un numar de 20 de cicluri produc aproximativ un milion de copii (2²⁰) din ADN tinta de studiat.

Ce afecteaza interca iile ADN-ADN?

Ce proprieta i ale reac iei PCR sunt afectate?

Caracteristicile primerilor:

Reducerea posibilitatii de aparitie a primerilor:

Pentru desemnarea primerilor se utilizeaza software dedicate. In practica curenta am utilizat Primer3, care il exemplificam ca si aplicatie.

Primeri desemnati si utilizati pentru identificarea RRS (Roundup Ready Soybean) prin PCR conventional:

- Primerii utilizati pentru identificare 'gena lectin' specifica plantei:

GMO3 5¢-GCCCTCTACTCCACCCCCATC-3¢

GMO4 5¢- GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3¢

- Primerii utilizati pentru identificarea 'promotorului p35S'specific OMG:

p35S cf3 5`- CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG - 3`

p35S cr4 5` - TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTTCC -3`

- Primerii utilizati pentru identificarea 'terminatorului tnos' specific OMG:

HA- nos 118f 5`- GCATGACGTTATTTATGAGATGGG - 3`

HA-nos 118r 5` - GACACCGCGCGCGATAATTTATCC - 3`

Primerii sunt produsi de firma TibMol Biol.

- Reactivi auxiliari: Tampon 5X PCR si Taq DNA polimeraza (Promega)

In PCR-ul in timp real (Real-Time PCR), produsul de amplificare este detectat prin intermediul colorantilor fluorescenti (“probes”).

• In chimia reactiei sunt incluse diferite tipuri de sonde (“probes”) oligonucleotidice care, intr-o anumita etapa a amplificarii, se prind specific fie de produsul amplificat, fie de fragmentul-tinta ce urmeaza a fi copiat.

• FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer; fenomenul are loc numai cand fragmentul marcat fluorescent si quencer-ul sunt apropiati in spatiu, si ei pot reactiona. Fluorescenta emisa se cumuleaza si creste in intensitate pe masura ce cantitatea de ampliconi creste.

Monitorizarea intensitatii fluorescentei chiar in timpul reactiei PCR permite detectia si cuantificarea produsului acumulat, fara a fi evoie de a mai deschide tuburile dupa terminarea reactiei.

• Asadar, un instrument de Real-Time PCR este in acelasi timp si un analizor in sine (spre deosebire, un PCR simplu realizeaza doar etapa de amplificare urmand ca analiza si detectia produsilor sa fie facuta intr- o etapa post PCR)

Pentru reactia Real Time PCR s-a utilizat kit-ul dedicat: “foodproof GMO Soya Quantification” producator BITECON Diagnostics. Detectia se realizeaza in timp real prin atasarea sondelor de hibridizare la secventa tinta. Sondele sunt fragmente scurte de oligonucleotidecare se leaga la o secventa tinta in timpul fazei de atasare. O oligonucleotida este marcata la capatul 5’ cu un fluoroflor acceptor si este la capatul 3’ fosforilata, cealalta oligonucleotita este marcata la capatul 3’ cu un colorant donor.

ACTIVITATEA II.2

Selectie probe de alimente in vederea analizei

Tipul de probe analizate si rezultate obtinute

In laborator am testat diferite materii prime (soia boabe) si produse alimentare care contin soia sub forma de faina sau ca adaos de proteina vegetala. Probele au fost testate prin tehnici de biologie moleculara (PCR conventional si Real Time PCR), iar rezultatele sunt prezentate pentru fiecare proba in parte. In cadrul prezentarii rezultatelor specifice activitatilor II.3 si II.4 sunt analizate rezultatele pe baza electroforezelor si a diagramelor real time PCR.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

gena Lectin – specifica plantei;

promotorul p35S – specific OMG;

terminatorul tnos – specific OMG.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La probele 2 (snitel texturat soia) si 3 (chiftele vegetale) au fost identificate gena lectin – specifica plantei; promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este sub limita de cuantificare a metodei de 0.1 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

4. Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 5 (soia boabe) a fost identificata:

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 6 (texturat proteic) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este sub limita de cuantificare a metodei de 0,1%.

6. Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 7 (pate vegetal cu ciuperci) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este sub limita de cuantificare a metodei de 0,1%.

7. Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 10 (salam vegetal) au fost identificate gena lectin – specifica plantei si promotorul p35S specific OMG; terminatorul tnos– se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0,2 %.

10. Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 11 (soia boabe) a fost identificata:

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 100 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 12 (faina din soia) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 82,3 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 13 (soia boabe) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 77,7 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 14 (snitel soia) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0,30 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 15 (granule soia) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 52,3 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 16 (Hamburger vegetal) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; Promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0.005 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 17 (parizer pasare) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; Promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0.02 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 18 (rulada carne) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; Promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0.03 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 19 (soia indigena - boabe) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 90 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 20 (proteine texturate soia) au fost identificate gena lectin – specifica plantei si terminatorul tnos specific OMG; Promotorul p35S– se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0.01 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 21 (texturat granulat soia) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 100 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 22 (kaizer) a fost identificata gena lectin – specifica plantei, iar Promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0.11 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 23 (parizer) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; Promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0.7 %.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

- gena Lectin – specifica plantei;

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 45,3 % pentru proba 24, 74,48 % pentru proba 25, 73,69 % pentru proba 26, 83,81 % pentru proba 27.

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional:

La proba 28 (parizer) au fost identificate:

- gena Lectin – specifica plantei;

- promotorul p35S – specific OMG;

- terminatorul tnos – specific OMG

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 76,3 % .

Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 29 (lecitina soia) au fost identificate gena lectin – specifica plantei si Promotorul p35S specific OMG; terminatorul tnos- specific OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este de 0,009 %.

26. Screening pentru identificare ADN specific prin tehnica PCR conventional.

La proba 30 (texturat proteic din soia) a fost identificata gena lectin – specifica plantei; promotorul p35S si terminatorul tnos specifice OMG – se afla sub limita de detectie a metodei de 0,1%.

Cuantificare ADN folosind tehnica Real Time PCR.

Cantitatea de ADN tinta, modificat genetic (promotorul p35S) este sub limita de detectie de 0,009%.

ACTIVITATEA II.3

Screening prin tehnica PCR a RoundapReady din alimente

Extractia si purificarea acizilor nucleici este primul pas in cele mai multe studii de biologie moleculara si in tehnicile de ADN recombinat. In acest studiu obiectivul metodei de extractie a acidului nucleic este obtinerea acizi nucleici puri din diverse surse cu scopul supravegherii analizelor specifice GM folosind lantul reactiei polimerazei (Polymerase chain Reaction – PCR).Calitatea si puritatea acizilor nucleici sunt unii dintre cei mai cririci factori pentru analizele PCR. In vederea obtinerii acizilor nucleici de inalta puritate liberi de contaminanti inhibitori ar trebui aplicate metode potrivite de extractie.

In vederea evitarii obtinerii unui rezultat fals negativ datorat prezentei inhibitorilor de PCR in proba, se recomanda efectuarea unui experiment de control pentru a testa inhibitia PCR..

Pentru acest scop este deseori utilizata o planta specifica ( eucariota sau cloroplasta) sau specii specifice analizei PCR.

Tabel 1. Inhibitori ai procesului PCR

Inhibitori    Concentratia de inhibare

SDS    > 0.005%

Fenol    >0.2%

Etanol    > 1%

Isopropanol    >1%

Acetat de sodiu    >5mM

Clorura de sodiu    >25mM

EDTA    >0.5mM

Hemoglobina    >1mg/ml

Heparina    >0.15 i.m/ml

Uree    >20mM

Deoarece exista o varietate de metode de a extrage si purificare a acizilor nucleici alegerea celei potrivite se bazeaza pe urmatorul criteriu:

• Acidul nucleic vizat;
• Organismul sursa;
• Materia prima (saminta, material procesat etc);
• Rezultatul dorit ( randament, puritate, timpul de purificatre etc)
• Aplicatia ( PCR, etichetare, RT-PCR, etc).

Metode de extractie

Extractia acizilor nucleici din materialul biologic are la baza liza celulelor, inactivarea nucleazelor celulare si separarea acidului nucleic dorit de resturile celulare.

Deseori, procedurile de liza celulara constau in tehnici sigure folosite pentru a rupe legaturile materiei prime (starter) de ex. tesutul, dar suficient de fin pentru a pastra intreg acidul nucleic vizat.

Procedurile de liza celulara includ:

Rupere mecanica ( ex.liza hipotonica, macinare etc);

Tratament chimic ( ex. liza cu ajutorul detergentilor, reducerea tiolului, agenti chaotropici)

Digestie enzimatica ( ex.proteinaza K)

Pot fi combinate ruperea membranelor celulare si inactivarea nucleazeor intracelulare. De exemplu o singura solutie poate contine detegenti care solubilizeaza membranele celulare si saruri chaotropice care sa inactiveze enzimele intraceulare. Dupa liza celulara si inactivarea nucleazei, resturile celulare pot fi usor indepartate prin filtrare si precipitare.

Metode de purificare

Metodele de purificare a acizilor nucleici din extractele celulare sunt de obicei combinatii de doua sau mai multe din urmatoarele tehnici:

• Exctractia/precipitarea
• Cromatografie;
• Centrifugare;
• Separarea prin afinitate

Metoda utilizata in labororator pentru extractia acizilor nucleici este cea propusa de producatorul de kit-uri ROCHE –„High Pure GMO Sample Preparation Kit”.

Pe parcursul studiului s-au analizat un numar de 29 probe de alimente care contin soia sau materii prime (soia boabe sau texturat de soia).

Materiale necesare aplicarii tehnicilor PCR conventional si Real time PCR

Disponibilitatea materialelor de referinta certificate este o cerinta fundamentala pentru fiecare metoda de detectie. Materialele de referinta certificate sunt produse din faina de soia Roundup Ready deshidratata cu fractii de masa diferite (0, 0.1, 0.5, 1, 2, si 5%)

Un alt punct de maxima importanta este omogenitatea probei.

I) Reactivi necesari pentru extractia acizilor nucleici

- Kit pentru extractia acizilor nucleici specifici OMG –„High Pure GMO Sample Preparation Kit”-Roche

II) Reactivi necesari pentru identificarea soia modificata genetic prin PCR conventional

- Primerii utilizati pentru identificare 'gena lectin' specifica plantei:

GMO3 5¢-GCCCTCTACTCCACCCCCATC-3¢

GMO4 5¢- GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3¢

- Primerii utilizati pentru identificarea 'promotorului p35S'specific OMG:

p35S cf3 5`- CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG - 3`

p35S cr4 5` - TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTTCC -3`

- Primerii utilizati pentru identificarea 'terminatorului tnos' specific OMG:

HA- nos 118f 5`- GCATGACGTTATTTATGAGATGGG - 3`

HA-nos 118r 5` - GACACCGCGCGCGATAATTTATCC - 3`

Primerii sunt produsi de firma TibMol Biol.

- Reactivi auxiliari: Tampon 5X PCR si Taq DNA polimeraza (Promega)

III) Reactivi necesari pentru cuantificarea soia modificata genetic prin Real Time PCR

- Kit Quantificare – “LightCycler GMO Soya Quantification Kit -Roche

Metode utilizate

1. Extractia ADN optimizata, este fundamentala pentru asigurarea calitatii si prezentei ADN extras. Acest aspect este deosebit de important deoarece majoritatea produselor alimentare de pe piata ce contin soia sunt procesate foarte mult. Este cunoscut faptul ca ADN se poate degrada considerabil in timpul procesarii alimentelor, in special prin tratament termic. Aditional, o metoda corespunzatoare de extractie a ADN trebuie sa asigure inlaturarea substantelor inhibitoare prezente in proba.

Au fost elaborate metode pentru extractia ADN si foarte multe companii au produs kituri specializate.

In cadrul temei noastre de cercetare pentru extractia acizilor nucleici specifici OMG din diferite tipuri de probe s-a utilizat kit-ul „High Pure GMO Sample Preparation Kit” de la firma ROCHE.

Liza celulara s-a obtinut prin incubarea probelor (30 min. la 80⁰C) intr-un tampon special de lizare, in prezenta proteinazei K, acizii nucleici legandu-se in mod specific de suprafata filtrelor alcatuite din fibre de sticla.

Reactia de legare apare in decurs de cateva secunde datorita distrugerii structurii organizate a moleculelor de apa si a interactiunii acizilor nucleici cu suprafata fibrelor de sticla.

Eventualele reziduuri contaminante de ADN sunt supuse digestiei directe cu DNaza aplicata direct pe suprafata filtrelor, acizii nucleici fiind ulterior purificati de saruri, proteine si alte impuritati prin spalari succesive cu tampoane de spalare.

Proba de analizat se trateaza cu tamponul de legare suplimentat cu proteinaza K si poliadenina, reactiv specific pentru legarea si transportul ADN, se incubeaza la 72 C pentru 10 min.

Amestecul se centrifugheaza 2 minute la 13000 rpm, supernatantul se pipeteaza pe suprafata filtrelor alcatuite din fibra de sticla, se indeparteza eluatul obtinut in urma centrifugarii timp de 1min. la 13000 rpm. In final produsul se spala de mai multe ori cu tampoane de spalare si se recupereaza in tampon de elutie, prin centrifugare la 13000 g timp de 1 minut.

Cuantificarea ADN cu ajutorul spectrofotometriei

Putitatea ADN poate fi masurata direct in solutii apoase in forma diluata sau nediluata prin masurarea absortiei „A” ( definita si densitate optica, OD) in UV.

Daca proba este pura (de ex. fara cantitati semnificative de contaminanti cum ar fi proteinele, fenolul sau agaroza), masuratoarea spectrofotometrica a cantitatii de radiatii ultravolete absorbita este proportionala cu puritatea ADN. Pentru aceasta metoda, solutiile apoase tampon avand concentratii scazute de ioni ( ex. solutie tampon TE) sunt ideale. Concentratia de acizi nucleici este determinata de obicei prin masurarea la 260 nm, proba martor fiind blank. Deoarecee proteinele absorb la 280 nm, raportul A260/A280 este folosit pentru a estima puritatea acidului nucleic.

ADN pur ar trebui sa aibe o marime a raportului de aprox.1,8.

Absortia la 230 nm reflecta contaminarea probei cu substante ca peptidele, carbohidrati, fenoli sau compusi aromatici. In cazul unei probe pure raportul A260/A280 ar trebui sa fie aprox. 2.2

Testul PCR coventional este utilizat pentru studierea a doua zone din genomul plantei de soia:

Denaturare initiala 95⁰C - 3 min

Denaturare 95⁰C - 30sec

Atasare 63⁰C - 30sec

Extensie 72⁰C - 30sec

Numar de cicluri 40

Extensie finala 72⁰C - 3 min

Identificarea 'terminatorului tnos'

Preparare Master mix, programul PCR, electroforeza

Componentele Master mix specifice testului PCR conventional, pentru un volum final de 48 ml / tub de reactie, sunt redate in tabelul 3:

Tabel 3 - Compozitia amestecului de reactie pentru identificarea prin PCR conventional a 'terminatorului tnos' specific OMG

Protocolul de amplificare s-a realizat in thermocyclerul 'iCycler Bio-Rad' dupa urmatorul profil:

Denaturare initiala 95⁰C - 3 min

Denaturare 95⁰C - 25 sec

Atasare 62⁰C - 30 sec

Extensie 72⁰C - 45 sec

Numar de cicluri 50

Extensie finala 72⁰C - 7 min

Racire 4⁰C - ∞

Electroforeza se efectueaza in gel de agaroza (2.5% agaroza in TBE 1x + 2 ml EtBr 10 mg/ml), fiecare godeu se incarca cu 10 ml amplicon si 2 ml tampon incarcare. Parametrii pentru electroforeza: Migrare: 100V; 1,5A, timp: 1 ora, in tamponul de migrare se adauga 12 ml EtBr 10 mg/ml; Marker folosit: 15ml de 100 pb.

Rezultatul electroforezei: banda specifica de 118 pb.

Testul Real -Time RT-PCR aplicabil pentru promotorul p35S si gena lectin

Posibilitatea cuantificarii materialului modificat genetic si stabilirii unei limite de detectie care sa permita identificarea produselor ce contin soia modificata genetic, au reprezentat prioritatile efectuarii acestui tip de test. Testul s-a realizat folosind kit-ul „LightCycler GMO Soya Quantification kit” (Roche, Germania).

Componentele testului Real-Time PCR, pentru un volum final de 15ml / tub de reactie, sunt redate in tabelul 4:

Tabel 4 - Compozitia amestecului de reactie pentru Real Time RT-PCR

Pipetare 15 ml PCR mix in fiecare capilar LightCycler si 5 ml ADN. Transfer capilare in carusel LightCycler si centrifugare 5 sec la 3000 rpm. Pentru a obtine cuantificarea (exprimata in procente) organismului modificat genetic provenit din soia, este necesar sa se prepare un set de etaloane seriate conform tabelului 5.

Etalonul folosit este ADN din soia modificat genetic si este inclus in kit-ul de lucru.

Tabel 5 - Prepararea controalelor externe (existente in kit)

Protocolul de amplificare s-a realizat in thermocyclerul LightCycler dupa urmatorul profil prezentat in tabelul 6:

Tabel 6 – Parametrii de functionare ai sistemului LightCycler

Rezultate

Identificarea 'genei lectin', a 'promotorului p35S' si a 'terminatorului tnos' prin tehnica PCR conventional (tehnica screening – prin care sunt eliminate probele negative obtinute, in urma analizei calitative)

S-au analizat 30 probe de materii prime si produse alimentare care contin soia; toate probele au fost lucrate in duplicat.

Probele au fost prelucrate conform protocolului de obtinere a acizilor nucleici prin extractie, acestia au fost utilizati ulterior in reactia PCR pentru identificarea genei 'lectin' specifica plantei, iar ampliconii obtinuti au fost pusi in evidenta prin electroforeza. In fig. 4 sunt prezentate rezultatele electroforezei in gel de agaroza, a ampliconilor specifici 'genei lectin', obtinuti in urma reactiei PCR conventional.

M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 - + + -