Universitatea “AL. I. CUZA”
Facultatea de Biologie
Specializare: Genetica Moleculara an VI
DETERIORAREA ADN-ului
SI IMBATRANIREA
Nota Abstracta
Ipoteza discutata aici este ca o componenta majora a imbatranirii in metazoane ce consta in deteriorarea oxidativa a ADN-ului nuclear. Un astfel punct de vedere ar avea sens cu realitatea ca toate aceste sindroame de imbatranire prematura prezente in mamifere implica mutatii in proteinele nucleare. Mai multe din aceste proteine sunt enzime in asociere cu metabolismul ADN-ului sau a reinnoirii lui. Printre simpla si dubla rasucire a ADN-ului deteriorat si pe parcursul repararii sale, prezent in toate eucariotele, doar un singur parcurs deseori esueaza sa se refaca la intreg continutul de informatie a genomului si in mod tipic va rezulta intr-o suprimare a unor perechi de baza. Acest parcurs este numit ADN non-omolog si imbinat (NHEJ), este un parcurs major, de aceea poate sa dicteze un factor cheie in balanta dintre oxidare si durata de viata a organismului.
1. INTRODUCERE
Este un acord emergent ca deteriorarea oxidativa are o importanta centrala mai mult a varstei similara cu a declinarii celulelor animale datorita varstei, de la samanta la om (Beckman si Ames, 1998; Barja, 2002: Hasty et al., 2003; Hekimi si Guarente, 2003; Longo si Finch, 2003; Tatar et al., 2003). Restrictia calorica a conditiilor mediului care favorizeaza descresterile in metabolismul oxidativ, de altfel mareste durata de viata. (Speakman et til., 2002), sau a animalelor transgenice cu metabolism oxidativ in scadere au imbunatatit durata de viata. De exemplu, mustele care consuma oxigen la o rata marita au o durata de viata scazuta, si ratele de consum a oxigenului mai scazute si temperaturile, favorizeaza o durata de viata mai lunga. (Tower, 1996; Sohal et al., 2002). Lipidele, proteinele si ADN-ul au demonstrat toate ca sunt chei tinte de oxidare (Finch, 1990). Desi oxidarea produselor lipidice si proteice se pot acumula odata cu imbatranirea, pierderea continutului informatiei ADN-ului nuclear este de neinlocuit.
Aici, dorim sa integram informatia actualizata in legatura cu metabolismul ADN-ului nuclear (cum ar fi ADN-ul deteriorat si repararea lui) cu cunostintele prezente a metabolismului oxidativ si a imb 858j91i 59;tranirii. Toate formele de alteratie privind ADN-ul sunt in mod potential nocive. De altfel, ADN-ul cu rupturile dublu-rasucite sunt un tip de deteriorare care animalele „le repara” folosind ADN-ul non-omolog capat-lipit (NHEJ), care deseori nu poate sa retina intreaga informatie in locul deteriorat. Aceasta cale de reparatie pare a fi un factor important in balanta oxidarii ADN-ului si a deteriorarii genomului, si de aici, poate fi relevant pentru unele forme de imbatranire prematura si un important factor la imbatranirea normala. Continutul ADN-ului repetitiv, dincolo de animale, seminte si plante poate determina pana la care nivel orice organism poate folosi aceasta cale, si de aceea, poate dicta un factor cheie in balanta dintre oxidare si timpul de viata. Date recente indica ca gena progeriei a fost identificata ca o gena-proteina cu schelet nuclear, lamina A (de Sandre-Giovannoli et al., 2003; Eriksson et al., 2003); de aceea, legatura dintre ADN-ul nuclear si imbatranire merita o evaluare proaspata. Unele dintre rezultatele discutate aici au fost adresate de noi (Lieber si Karanjawala, 2004) si altii recent (Kirkwood si al. 2003; Kirkwood si Proctor, 2003).
2. ADN-UL CA O TINTA DE OXIDARE IN IMBATRANIRE
2.1. Deteriorarea ADN-ului: ADN-ul mitocondrial fata de ADN-ul nuclear
Ce fel de ADN deteriorat este mai important – ADN-ul mitocondrial sau nuclear? Mutatiile genetice indica ca amandoua sunt importante, deoarece mutatiile mostenite, in care pot rezulta in mod clar inmultirea bolilor debilitare (Wallace, 1999). Fiecare celula are mii de genomuri mitocondriale, facand mutatii din toate in aceeasi gena. Desi 7,8-dihidro-8-oxo-2’-deoxiguanozina (8-oxo-dG) si chiar rearanjamentele structurale pot sa se acumuleze in genomul structural odata cu varsta, nu este clar daca un numar suficient de copii a genomilor mitocondriali pe celula sunt afectati odata cu varsta, ca rezultat in energia inadecvata a metabolismului (Wallace, 1999; Barja si Herrero, 2000). Prin contrast, genomul nuclear este pur si simplu diploid. In mod natural, aparitia sindroamelor accelerate de imbatranire la oameni au fost de departe legate la enzimele ADN-ului nuclear sau proteinelor structurale nucleare, mai degraba decat a celor care afecteaza ADN-ul mitocondrial (Kanaar si Hoeijmakers, 1997: Wallace, 1999: van Gent et al., 2001; Eriksson et al., 2003). Prin urmare, acesta este un motiv important pentru a favoriza ADN-ul nuclear ca fiind ultima tinta de deteriorare a imbatranirii naturale. Cu toate acestea, este de conceput ca atunci cand mutatiile apar in genomul mitocondrial, productia de proteina mutanta poate creste ineficienta lantului mitocondrial respirator oxidativ, in felul acesta rezultand in mai multe specii de oxigen reactiv (ROS), care ar deteriora apoi ADN-ul nuclear si mitocondrial.
2.2. ADN cu o singura rasucire, deteriorat si reparat
Multe tipuri de deteriorari a bazelor si zaharului apar in ADN dupa un atac de ROS (Imlay si Linn, 1988; Imlay, 2002). Unele din aceste rezultate in deslocarile din sira spinarii, astfel incat reusind sa ajunga la o singura rasucire (ss) SI – crestaturi de configurari variate. (fig. 1). (Imlay si Linn, 1988). Printre variatele cazuri chimice, guanina poate fi oxidata la 8-oxo-dG (Beckman si Ames, 1998). Ca alte tipuri de defecte, aceasta leziune este in mod eficient reparata de cel putin doua carari de taieri si o excizie reparatoare de baza. (Friedberg et al., 1995). Nivelul de oscilatie constanta a 8-oxo-dG cazuri este 100-1000 pe celula in soareci, dar fractia care nu reuseste sa fie reparata si devine mutatii de punct, este mai putin clara. (Klungland et al., 1999). Unele studii reporteaza o crestere nedetectabila la nivel constant a 8-oxo-dG cu varsta in nucleu (Beckman si Ames, 1998: Herrero si Barja, 1999), desi altii au raportat o crestere (Hamilton et al., 2001), privind nivelul constant de 8-oxo-dG de cazuri, genomul sufera o mutatie de fiecare data cand repararea exciziei esueaza sa se reintregeasca inapoi pe pozitia normala. Locatiile mutatiilor rezultate vor fi asteptate sa fie amplasate in mod aleator in intregime pe genom. Cercetarile recente indica ca este o limita superioara pe intreaga acumulare a pozitiilor care au esuat sa fie reparate pentru 8-oxo-dG in soarecii in varsta. (Dolle et al., 2002)
2.3. Deteriorarea ADN-ului dublu-rasucit
O sursa a rupturilor dsADN-ului este ROS, cum ar fi peroxidul de hidrogen. Un procent din oxigenul pe care il respiram este convertit in radicali liberi oxidativi, care inseamna <3 x 1022 radicali liberi/persoana in fiecare ora. (Chance et al., 1979). Este de altfel cunoscut ca ROS, cum e peroxidul de hidrogen, poate cauza dsADN rupturi la un nivel scazut (in aditie la un numar mult mai mare de ingustari ssADN) (Prisee et al., 1989).
Radiatia ionizanta (raze X- si γ) pot cauza rupturi de dsADN (la fel si ingustari de ssDNA) prin crearea de manunchiuri de ROS de-a lungul cararii prin care trec particulele spre ruta lor spre corpurile noastre. Doua sute de milioane de raze gama trec printr-un corp uman obisnuit in fiecare zi in mod simplu din descompunerea radionuclizilor care apar in mod natural in Pamant. (NatlRadProtectBoard, 1986).
Replicatiile de ADN de-a lungul unui crestaturi este in mod probabil de a fi o alta cauza de rupturi ale dsADN-ului. (fig. 1). Aceste crestaturi pot fi lasate deoparte de acelea care sunt in mod natural prezente in incetinirea malului in timpul sintezei ADN-ului replicativ. In mod alternativ, crestaturile pot fi cauzate de surse exogene sau endogene, cum ar fi ROS, cum au fost mentionate mai sus. Aceasta sursa a rupturilor de dsADN pot numai sa apara cand o celula urmeaza diviziei celulare sau cel putin sinteza ADN-ului local in pozitia repararii ADN-ului.
2.4. Repararea rupturii dublu-rasucite
Rupturile dublu-rasucite sunt reparate pe fiecare din cele doua carari majore (Liber et al., 2003). Functiunile omoloage recombinate din celulele somatice din timpul lui G2 si S a celulelor divizate pentru a repara rupturile de dsADN (fig. 2a). Acesta este un punct in ciclul celulei cand continutul de ADN este 4N, si cromatidele surori sunt pozitionate in mod adiacent una celeilalte, astfel permitand o copie a informatiei de la o sora cromatida la cealalta. Aceasta restaureaza in mod tipic continutul de informatie in aceeasi pozitie de ruptura inspre normal.
NHEJ este o alta importanta cale pentru repararea rupturilor de dsDNA. (fig. 2b). Calea NHEJ este activa pe tot ciclul celulei in toate tesuturile vertebrate si este o cale majora pentru repararea rupturilor de dsADN, in timpul lui G0 si G1 in faza S timpurie (Takata et al., 1998). In timpul lui S si faza G2, o ruptura poate fi reparata prin NHEJ sau recombinatia omogena. In mod tipic, cel putin o nucleotida, si deseori pana la 10-20 de nucleotide, sunt pierduti din fiecare capat de ADN in timpul fiecarui caz NHEJ. Precum este mentionat, NHEJ este inclinare spre eroare a ADN-ului, o cale de reconstructie. Din acest motiv, in cele mai multe cazuri unde NHEJ este angajat, un pic mai multa informatie genetica este in mod permanent pierduta din celula. Din cauza impreciziei si din cauza caii majore a NHEJ pentru repararea rupturilor dsADN-ului, calea NHEJ este in mod particular relevanta in discutia imbatranirii. In aditie la recombinatia omoloaga si NHEJ, cea mai putin folosita carare include variante a recombinatiilor omoloage, cunoscute ca replicatia ruperii determinata, aditia telomera si analiza refacerii.
2.5. Recombinatia omoloaga fata de NHEJ - in celulele somatice
O cale de a masura proportia recombinatiei omoloage la NHEJ este de a introduce un segment a ADN-ului linear in celule si a le monitoriza daca se integreaza in genom, bazat pe omologia sa, de recombinatia omoloaga la o pozitie genomica, sau se integreaza in mod intamplator la o suta de ori mai eficient decat NHEJ prin tipul de proba. (Roth and Wilson, 1988). In celulele a cele mai multe pluricelulare eucariote, NHEJ este de 10 - 100 de ori mai eficient decat recombinatia omoloaga de proba.
Motivele pentru folosirea abundenta a NHEJ in celulele somatice a eucariotele multicelulare poate fi intrinseca la organizarea genomica in aceste organisme. Genomii eucariotelor multicelulare, spre deosebire de seminte au o fractie substantiala de ADN repetitiv. (Lieber 1999). Exceptand faza de dupa a lui S si G2, cand o sora cromatida este in mod fizic pozitionata optim, partenerii omologi pentru regiunile repetitive pot fi alese in mod potential de catre oricare dintre cromosomi in mod necorespunzator. De exemplu, o ruptura in repetitia Alu are aproape 1 milion de posibili donatori. Daca a fost folosit un donator incorect, un caz de crossover omolog apare in timpul rupturii reparatorii a dsADN-ului si poate rezulta intr-o translocare cromosomiala sau deletie. Pentru acest motiv, cazurile de crossover omoloage pot fi prea periculoase in organismele cu genomi care au o parte substantiala a ADN-ului repetitiv. In speciile care au ADN repetitiv nuclear, evolutia poate sa limiteze recombinatia omoloaga la un S si G2 care apare mai tarziu in ciclul celulei. Acesta poate fi un factor important care guverneaza ratia recombinatiei omoloage sper NHEJ in seminte relativ cu asemanatoare cu ratia din organismele multicelulare.
2.6. Frecventa despartirilor ADN-ului dublu-rasucit
Cat de des apar rupturile in dsADN? Intrebarea frecventei rupturilor dsADN-ului spontan nu are ca rezultat un raspuns experimental. Recent, mai multe laboratoare folosesc in mod citogenetic rupturi de cromosomi detectabili ca o reflectie a frecventei a rupturilor dsADN-ului (Karanjawala et al.. 1999; Ferguson et al.. 2000; Giliey et al.. 2001; Karanjawala et al., 2002). Aceasta masura a rupturilor a dsADN-ului este autonoma de faptul ca mutatiile in cele mai multe NHEJ - rezultate componente intr-o elevare marcata in frecventa aberatiilor cromosomiale. Cu aceasta analiza, 5 - 10% a primului pasaj primar de fibroblaste si celule epiteliale ale rinichiului la soareci salbatici sau oameni au o aberatie cromosomiala (mai multe cromatide sau rupturi de cromosomi) (Martin et al., 15: Karanjawala et al.. 1999). Acest numar este probabil o rostogolire de 5-10%; asta este, cateva ore mai tarziu, aceste rupturi vor fi in mod probabil reparate si 5-10% observate ceva mai tarziu.
Daca rezultatele din aceste prime pasaje studiate in celulele somatice primare se aplica celulelor in vivo, asa ca una poate estima frecventa cu care mutatiile in celulele individuale vor aparea din rupturile dsADN-ului. Daca fiecare ruptura de dsADN ia 24 de ore pentru a fi reparata (o limita superioara ridicata, vedeti dedesubt), atunci la sfarsitul a 70 de ani a vietii umane, fiecare celula ar avea aproximativ 2300 locuri de reparare distribuite in intreg genomul sau. Aceasta estimare este bazata pe o ruptura a cromosomului rotitor cu o incidenta de 9%. Asumand faptul ca 5% din genom este crucial pentru continutul informatiei (3% codificat, plus 2% mai mult pentru secventele locale regulatorii) (Strachen si Read, 1999), atunci in fiecare celula diploida, 2300 pozitii de rupturi la intamplare se traduc in mutatia a 115 gene pe celula. Aceasta ar insemna 115 gene in fiecare celula. Intr-un genom estimat la 50.000 de gene, 115 gene mutante ar corespunde la una la fiecare 430 de gene distruse sau mutante. Desigur, fiecare celula este diploida, asa incat pierderea unei gene este diminuata de cele alele. In orice caz, 50% din reducerea din productie a unelor proteine ar compromite functia, bazata pe multe exemple de haploinsuficienta in celulele eucariotice (AND ligase IV, H2AX, FEN-1, si BLM) (Karanjawaia et al., 1999; Sharpless et al.. 2001; Goss et al, 2002: Kucherlapatt et al., 2002; Seidman and Siedman, 2002; Bassing et al., 2003; Celeste et al., 2003). Productia proteinelor mutante poate avea deasemenea consecinte daunatoare. In mod clar, un astfel de nivel mare de ADN in fiecare celula poate contribui la declinul per ansamblu al organismului.
Frecventa de ruptura actuala a dsADN-ului in celulele non-divizibile pot fi mai scazute decat valoarea estimata mentionata mai sus daca sursa primara a rupturilor dsADN apare din sinteza ADN-ului replicativ peste o crestatura. Pe de alta parte, actuala frecventa de ruptura a dsADN-ului in diviziunea celulelor poate fi de sute de ori mai mari decat valoarea estimata pentru motivele urmatoare. Totusi, o valoare mai corecta pentru numarul rupturilor dsADN poate fi obtinuta in celule care sunt neputincioase sa duca la bun sfarsit repararea ADN-ului – cu alte cuvinte, in celulele nule NHEJ – cu toate ca 9% din valoarea mentionata deasupra, din celulele tip “salbatice”, este complicata de „stergerea” rupturilor citogenetice observabile de repararea lor. Frecventele de ruptura in celulele nule NHEJ sunt mai mari (55% in celulele murine nule NHEJ), si bazate pe acestea, frecventa de ruptura va fi cam de sase ori mai mare. Totusi, timpul pe care il ia ca NHEJ sa repare o ruptura este aproximativ jumatate de ora (in seminte) mai bine decat 24 de ore mentionat deasupra (Lee si Haber, comunicarea personala). Aceasta inseamna ca “rularea” franelor prin ciclul reparatoriu de frana poate sa fie aproximativ de 48 de ori mai mare. Combinand cei doi factori (48 x 6) ar insemna ca ciclul de frana/reparatie, si prin urmare locurile deteriorate, pot fi mai mult de 280 de ori mai mari. Estimarile derivate in acest fel sunt intr-un dispozitiv de magnitudine de estimari obtinute prin masurarea ruperii intre sirurile de markeri selectabili genetic. (Dolle si Vijg. 2002).
Metabolismul oxidativ pare a fi un contributor important la generarea unor rupturi de cromosomi. (Karanjavala et al., 2002) si mutatiile somatice (Busuttil et al., 2003), si studiile celulare de cultura sunt intemeiate pe aceasta posibilitate. (Parrinello et al., 2003).
2.7. Repararea NHEJ a rupturilor de dsADN poate duce la mutatii somatice: implicatii pentru genomul care imbatraneste
Precum am descris mai sus, am estimat numarul de rupturi dsADN care apar spontan prin observarea rupturilor cromosomiale precedente pentru a le repara. Alternativ, una poate secventa regiuni ale genomilor. Regiunile ce contin deletii pot indica un loc a unei reparatii a rupturilor de dsADN. Cauze potentiale a deletiilor pot implica reparari a rupturilor de dsADN de NHEJ sau polimeriza alunecarea pe malul de sablon in timpul replicarii ADN-ului. Examinand secventa stearsa si inconjurarea regiunii, poate fi folosite sa sugereze mecanismul deletiei. (fig. 3). In unele cazuri, secventa deletiilor are aspecte concordante cu un mecanism NHEJ si inconsistente cu alte mecanisme. Prin analizarea acestui caz de deletie, una poate estima numarul a eventual repararii NHEJ de rupturi de dsADN din celulele somatice.
Un studiu de examinare a acumulat mutatii somatice in gena HPRT din celulele epiteliale ale rinichiului uman a indivizilor ajunsi la 31-77 de ani (Colgin et al., 2002). Autorii determina o mutatie obisnuita dependenta de varsta la frecventa de 1,9 x 10-4. Cam 15% din toate mutatiile in pozitia HPRT sunt deletii mari si rearanjamente (Cole si Shopek, 1994), si cele mai multe din aceste cazuri sunt mai mult ca sigur de a fi reparate de NHEJ. Deletii mai mici au fost reportate in studii multiple (Burkhart-Schultz et al., 1996; Burkhart-Schultz and Jones, 1997; Podlutsky et al., 1998; Podlutsky et al.. 1999; Hackman et al.. 2000; Jinnah et al.. 2000; Colgin et al., 2002) si inspectia noastra a secventelor raportate determina ca un procent de 5% a mutatiilor descrise in pozitia HPRT sunt probabil cazuri NHEJ. De aceea, cam 20% (15% + 5%) a mutatiilor somatice dobandite in pozitia HPRT pot fi datorita lui NHEJ. Extrapolarea acestor valori conduce la o estimare a aproximativ 175 deletii (e.g. dsADN rupturi care au fost reparate de NHEJ) pe genomul haploid. Estimari similare pot fi obtinute prin masurarea deteriorarii inauntru ariilor a reperelor selectabile (Dolle si Vijg, 2002). Este notabil ca aceste trei independente actiuni (proba rupturii cromosomului, succesiunea HPRT si selectia genetica a indicatorilor exogeni selectabili) produce estimari a nivelului somatic a mutatiilor acumulate care sunt inauntrul unei ordini de magnitudine a fiecaruia.
Aceste calculatii ilustreaza ca frecventa estimata a pozitiilor reparate NHEJ nu este mica. In timp ce toate aceste mutatii somatice pot fi importante pentru declinul per ansamblu a unei celule, deletiile pot fi mai severe decat mutatiile misense cu privire la impactul cu proteinele impachetate, si, de aici, fenotipul. Avand in vedere ca este o permanenta pierdere de informatie asociata cu fiecare pozitie NHEJ (loc), pierderea de informatie acumulata este probabil a fi substantiala.
Este o evidenta, ca deseori multe cazuri asumate datorita polimerizarii alunecarii ADN-ului in timpul replicarii lui, este de fapt datorita deletiei in timpul NHEJ (Heidenreich et al., 2003). Aceasta poate insemna ca 20% din cazurile pozitiilor NHEJ mentionate mai sus pot fi in mod actual mai sus, poate apropiindu-se de 35%.
3. UTILIZAREA LUI NHEJ VERSUS RECOMBINAREA OMOLOAGA IN GAMETOGENEZA
Precum este schitat mai sus, imbatranirea in celulele somatice poate avea baza sa in folosinta relativa a recombinarii omoloage fata de NHEJ. Astfel “imbatranirea”, prin utilizarea unei cai de predispuneri la erori ca NHEJ poate fi foarte deletioasa in celulele germeni. In gameti, de altfel, este probabil ca NHEJ sa joace un rol semnificant in repararea rupturilor de dsADN. Studii recente au demonstrat ca Ku70 nu este obtinut in timpul unor stagii de dezvoltare a spermatogenezei murine (Goedecke et al., 1999). Realitatea ca spermatogonia consuma cam 3 saptamani in profaza meiotica I, unde recombinarea omoloaga este cunoscuta sa functioneze, poate fi un alt mecanism protectiv impotriva utilizarii caii NHEJ. In mod similar, oocitele umane sunt cunoscute ca fiind oprite in profaza meiozei I pentru circa 55 de ani. Mai degraba decat NHEJ, recombinarea omoloaga poate fi utilizata preferential potrivit cu imperecherea cromosomilor omologi in timpul acestor perioade extinse. Folosind un mecanism fara eroare pentru repararea dublurilor este esentiala pentru minimizarea mutatiilor si ar fi un avantaj revolutionar pentru utilizarea recombinarii omoloage din timpul gametogenezei. Studii recente pe Drosophila indica in celulele mitotice a celulelor somatice uzitarea recombinarii omoloage si mai des a NHEJ (Rong si Golic, 2003), in concordanta cu minimalizarea pierderii de informatie in celulele de germeni. Consideratii similare pot fi aplicate semintelor, care de asemenea pot sa aprecieze favorizarea recombinatiei omoloage peste NHEJ.
In examinarea mutatiilor in pozitia HPRT, este interesant sa notam ca este o predispozitie pentru deletii si impotriva insertiilor in celulele somatice. In contrast, o linie descendenta de celule, deletiile si insertiile sunt aproape egale (Colgin et al., 2002). Intrucat natura predispunerilor la erori a caii NHEJ poate rezulta in deletii, aceste observatii pot reflecta folosirea descrescatoare a NHEJ in timpul stagiilor specifice de spermatogeneza.
Desi imprimarea ADN-ului aberant poate fi o cauza a unei eficiente scazute (una din mai multe sute) observate in eforturile de a clona animalele, este de asemenea de conceput, datorita deletiilor numeroase asociate cu folosirea NHEJ in nucleul celulelor somatice. Nucleele germenilor celulei, care pot fi expuse la o utilizare mai mica a NHEJ, poate avea mai putina informatie prin comparare. In mod interesant, laboratoarele de fertilizare umana in vitro, gasesc ca vor avea mai mult succes mentinand ouale in mai putin oxigen (fiziologic, 3%) in incubatoare. Asta ajuta la reducerea cantitatii de ADN deteriorat (Karanjawala et al., 2002).
4. ACCELERAREA IMBATRANIRII LA SOARECI SI OAMENI
Daca repararea deteriorarii ADN-ului de NHEJ este un important contributor la pierderea informatiei genetice datorata impreciziei sale, atunci ar fi interesant sa se stie daca prezinta defecte mostenite in NHEJ care rezulta in imbatranire accelerata. Ku este prima proteina care se lipeste la capatul a unei rupturi de dsADN, si este un heterodimer, constand in Ku70 si Ku86 (cunoscut de altfel Ku80). Ku86-nul, la soareci intr-adevar prezinta trasaturi a imbatranirii accelerate, incluzand osteoporoza, subtierea pielii, moartea celulei neuronale, si pierderea potentialului replicativ a fibroblastelor cultivate. (Vogel et al., 1999).
De ce e posibil ca pierderea de Ku sa rezulte in trasaturi de imbatranire prematura? Cand NHEJ apare in mod normal, numai o singura gena – cea din locul rupturii de dsADN – este la risc a pierderii permanente de informatie. De altfel, daca reunirea rupturilor de dsADN esueaza sa apara impreuna, atunci o mult mai larga regiune este la risc. In celulele NHEJ nule, regiunea pierderii a rupturii dsADN este foarte larga, extinzandu-se pana la mii de perechi de baza in fiecare directie (Schiller et al., 1986; Malynn et al., 1988; Okazaki et al.. 1988; Gu et al., 1997; Gao et al., 1998; Gu et al., 2000). Pentru subansamblul de gene care sunt in proximitatea alaturata, aceasta poate rezulta in pierderea genelor multiple (Adachi si Lieber, 2002). Daca frana nu este reparata de tot, atunci portiunea cromosomului distal, spre frana poate fi pierdut, care poate include sute sau poate mii de gene. Prin urmare, rata de informatie pierduta este mult mai rapida intr-un animal Ku deficient. Aceasta poate explica fenotipul imbatranirii accelerate in animalele Ku86-/-. (Celulele Ku70-/- se matureaza in cultura mai rapid decat tipurile de celule salbatice (Gu et al., 1997 ; Li et al., 1998), dar imbatranirea prematura in soarecele Ku70-/- nu au fost inca documentate). Spre deosebire de animalele deficiente Ku, ADN-ul PK al animalelor mutante (SCID) nu s-au semnalat rapoarte de imbatranire prematura. Deosebirea in fenotipul Ku deficient si animalele cu ADN-PK mutante pot avea baza lor in cantitatea relativa de nucleaza si activitatile dinauntrul celulei (Karanjawala et al., 2002). In aditie la explicarea de mai sus a imbatranirii premature la animalele Ku86-/-, alte efecte care contribuie la Ku, cum ar fi in stabilizarea telomera, nu poate fi exclusa. Din acest motiv, rolul lui Ku in lungimea telomerului mamalian este controversat. (Fagagna et al., 2001; Espejel et al., 2002), chiar desi rolul sau in seminte pare clar. De aceea, in acest timp, este dificil sa facem orice concluzii in rolul potential al scurtarii telomerului ca o cauza a imbatranirii in absenta lui Ku.
Sindromul Werner este o dereglare in imbatranirea umana prematura ce este cauzata de o mutatie in ADN-ul helicase/nucleaza, numit astfel dupa boala. Rolul precis al proteinei Werner (WRN) in repararea ADN-ului este neclar, dar date recente indica, ca WRN are un rol in combinarea omoloaga (Prince et al., 2001; Saintigny et al., 2002). In mod interesant, proteina WRN formeaza o proteina stransa complexa cu Ku (Cooper et al., 2000; Li si Comai, 2000), dar rolul functional in vivo a acestei interactii Ku-WRN nu este clara. O ipoteza este atunci cand recombinarea omoloaga se strica, interactia Ku-WRN ar putea sa faciliteze reparatia rupturii dsADN de NHEJ (Prince et al., 2001). Pacientii WRN au un mediu de viata de aproximativ 50 de ani si au probleme cu alopecia, osteoporoza, arterioscleroza, diabet, cataracta, telangiectazia, atrofia pielii si incaruntirea parului. Efectele combinatiilor omoloage a deficientei WRN si interactiunea cu Ku indica ca functiile WRN in repararea rupturilor dsADN. Daca recombinatia omoloaga ar fi mai eficienta, atunci repararea unui procent mai mare de rupturi de NHEJ, care este imprecisa, ar duce la o rapida pierdere a informatiilor genetice. Spre deosebire de sindromul uman, soarecii Wrn supusi testelor nu au aratat o imbatranire accelerata. (Leber si Leder, 1998).
Pacientii suferind de progeria (de altfel cunoscuta ca Hutchinson-Gilford progeria) are un timp de viata mediu de 13 ani si prezinta alopecia, ridarea pielii, cachexia si arterioscleroza. Date recente indica, ca mutatia care cauzeaza dereglarea este locata in lamina A, care codeaza o proteina structurala nucleara (deSandre-Giovannoli et al., 2003; Eriksson et al., 2003). Lamina A si genele C sunt produse alternative de conexiune a aceleasi gene; deci, dispozitive murine indeparteaza expresia amandurora lamine A si C (Burke si Stewart, 2002). Pierderea acestor lamine in soareci rezulta intr-o stabilitate structurala severa a invelitorii nucleare, care afecteaza celulele structurale mai sever. O ipoteza este ca frictiunea intracelulara a contractiei musculare cauzeaza pierderea integritatii nucleare. (Burke si Stewart, 2002). Chiar daca aceasta dezorganizare a nucleului cauzeaza pierderea ADN-ului nu este clara, desi este un raport a cresterii aneuploidatii in celulele progeria Hutchinson-Gilford (Mukherjee si Castello, 1998).
Pacientii cu sindromul Rothmund-Thomson au o mutatie in ADN-ul helicase a functiei necunoscute. Acesti pacienti pot avea o viata aproape de normal, dar au cataracte, osteoporoza, grizonarea parului si alopecia (Hasty et al., 2003). Pacientii cu ataxia telengiectasia au o atrofie a pielii, imunodeficiente moderate, grizonarea parului si pierderea celulelor neuronale. Proteina mutanta este implicata in semnalizarea deteriorarii ADN-ului dupa rupturile dsADN.
Astfel, patru dintre sindroamele majore de imbatranire prematura in oameni implica proteinele nucleare mai bine decat proteinele implicate in lipide, metabolismul carbohidratilor si doua din patru ADN helicase si una este molecula de ADN deteriorat de semnalizare. Mai mult de atat, una dintre modelele de imbatranire prematura la soareci – Ku86-/-, au aspecte similare de imbatranire prematura asociate cu WRN. Noi deducem din aceste date ca deteriorarea ADN-ului nuclear este un factor cheie in imbatranire. Importanta relativa a ssADN versus deteriorarea dsADN-ului nu poate fi implicata in aceste sindroame, desi este interesant sa notam ca Ku este implicat in repararea rupturilor de dsADN si WRN este suspectata de a fi asa deasemenea.
Acestea sunt sindroame umane, unde imbatranirea prematura se manifesta in doar o submultime de sisteme fiziologice (Martin si Oshima, 2000). De exemplu, sindromul Cockayne, care implica o proteina ce serveste ca o parte a RNA polimeraza II cu factor de transcriptie si, simultan, ca parte a mecanismului repararii exciziei nucleotide (Kanaar si Hoeijmakers, 1997; vanGent et al., 2001). Aceasta deasemenea este un factor de defect reparatoriu ADN, desi este dificil sa determinam contributia deficitului transcriptiei versus deficitul repararii ADN-ului. Sunt alte modele de soareci cu trasaturi de imbatranire prematura, cum ar fi klotho sau imbatranirea accelerata a soarecelui (SAM), unde functia fiziologica a proteinei nu este clara, sau identitatea genei afectate este respectiv necunoscuta. In mod interesant, nici unul dintre defectele mostenite in metabolismul proteinelor si a lipidelor a fost cunoscut sa se manifeste cu aspectele clasice a imbatranirii premature. Daca acumularea lipidelor oxidate sau a proteinelor atinge o limita critica de inmagazinare odata cu varsta, ar insemna ca un defect de stocare mostenit s-ar putea manifesta cu unele trasaturi de imbatranire prematura. Asa totusi, genele sindromului de imbatranire prematura se pare sa arate spre nucleu si, mai specific, spre ADN-ul nuclear.
5. IMBATRANIREA BIOLOGICA SI BOALA
Care este relatia dintre deteriorarea ADN-ului si imbatranirea naturala? Precum am mentionat mai sus, pozitii a NHEJ se pot raporta pentru peste 20% (si desigur pana la 35%) din mutatii la HPRT. Restul de 65-80% din mutatii sunt mutatii non-sens sau insertii care par improbabil de a fi asociate cu NHEJ. Pentru imbatranirea naturala, toate formele de deteriorare a ADN-ului pot fi contributorii.
Interactiunea dintre imbatranire si boala este una interesanta si a fost cercetata recent (Blumenthal, 2003). Deocamdata, ne-am concentrat peste nivelul de fundal a imbatranirii care este independenta de orice boala specifica. Dar este o legatura dintre nivelul de fundal a deterioratiei a ADN-ului nuclear si bolile specifice? Cancerul este exemplul evident, precum toate cancerele incep cu o mutatie de ADN. Dupa perioada copilariei, incidenta cancerului apare intr-o maniera care este in mod clar dependenta de varsta. Dependenta de varsta fata de cancer reflecta o incarcare si crestere a mutatiilor? Aceasta ar fi cea mai simpla interpretare si a fost revazuta in alta parte (Turker, 2000). Profilele de varsta a unor cancere, ca acelora care sunt responsabile hormonal, poate reflecta dependente specifice de proliferare a unor tesuturi. Dar directia totala a tuturor cancerelor este probabilitatea de a le dezvolta odata cu varsta.
Cat despre bolile degenerative, cum ar fi dementa senila, sau altele mai subtile, de exemplu, trepidatia inofensiva senila? O ipoteza este ca proteinele impachetate incorect se acumuleaza odata cu varsta. Deteriorarea ROS a ADN-ului ar putea fi asteptata sa fie distribuita in mod aleatoriu in genom. Fiecare celula ar fi diferita unde pierderea de informatie ar putea sa apara; asa deci, fiecare celula ar produce un set diferit de proteine derivate din genele mutante corespunzatoare. Un subset a acestor proteine n-ar putea sa se impacheteze corespunzator. O mixtura a proteinelor impachetate incorect cauzeaza disfunctii celulare in aceeasi masura ca superproductia unei singure proteine impachetate incorect, cum este vazuta in modelele murine a bolii Alzheimer sau Huntington? Daca fiecare celula produce un set diferit a proteinelor impachetate incorect, un spectru a disfunctiei celulare ar fi asteptata sa apara de la neglijabil la sever. Fenotipurile slabe a pierderii de memorie sau a tremuriciului senil in persoanele in varsta ar fi datorita disfunctiei celulare variate a neuronilor. Asa ca, in concordanta cu aceasta interpretatie, amiloida (care este un termen general pentru o categorie a proteinelor insolubile care se pot acumula extracelular) in creier poate fi varful iceberg-ului, si un numar mult mai mare a proteinelor daunatoare incorect impachetate poate fi produse dar sa ramana solubile. Natura diversa a unui set intamplator de proteine incorect impachetate face aceasta ipoteza dificil de testat. O mutatie mamaliana ce poate veni aproape de simularea acestei situatii ce apare intr-un subansamblu a pacientilor cu boala Parkinson, unde cararea catre ubicuitilatie nu poate sa functioneze adecvat, rezultand in dificultati in degradarea unui spectru larg de proteine care de altfel ar fi catabolizate (Kitada et. al., 1998). Este de-altfel interesant sa notam ca in soarecii nuli Ku86 acumuleaza incluzii intracitoplasmatice proteinacee in celulele ficatului la o rata mai rapida decat la soarecii salbatici. (Vogel et. al., 1999).
Aceasta vedere a bolilor neurodegenerative, poate in principal sa fie generalizata la alte tesuturi. Balanta metabolismului oxidativ si activitatilor protective reducatoare, cum ar fi glutationul, peroxidaza de glutation, si tiordedoxina, variaza printre tesuturi si probabil printre indivizi. Daca pierderea continutului de informatie a ADN-ului nuclear este un factor important in imbatranire, atunci factorii majori pentru aceasta pierdere in dependenta de timp, ar include productia de ROS (si, indirect, rata metabolica), activitatile protective reducatoare si eficienta repararii ADN-ului.
6. RATELE DE OXIDARE
Este o corelatie generala inversa intre productia ROS si durata de viata (Barja, 2002). Rata bazala metabolica si productia ROS de mitocondrie sunt legate si direct proportionale una-celeilalte. (Ku et al., 1993). Restrictia calorica, o metoda recunoscuta de reducere a ratei de imbatranire, descreste productia ROS in rozatoare (Sohal et al., 1994; Gredilla et al., 2001).
Gripa aviara merita o mentiune speciala privind relatia inversa dintre ROS si longevitate (Holmes et al., 2001; Barja, 2002). Aproape toate speciile cu gripa aviara au o mai mare cheltuiala de energie pe gram de tesut (kcal/gm) relativ cu mamiferele similare ca marime. Totusi, cele cu aviara traiesc mai mult de 4-10 ori decat mamiferele duplicate cu aceeasi cheltuiala de energie. (Holmes et al., 2001).
Acelasi adevar despre lilieci (care sunt mamifere) (Austad si Fischer, 1991). Asa cum stau departe deasupra vietii versus cuba ROS, pasarile zburatoare si liliecii reprezinta o discrepanta fundamentala in teoria radicala libera a imbatranirii. Cum pot fi aceste exceptii sa fie intelese in termeni de viata ROS in relatia inversa?
7. ADN-UL REPETITIV SI ROLUL NHEJ IN IMBATRANIRE
Pentru o rata metabolica oxidativa data, pasarile traiesc mai mult in comparatie cu un numar larg de alte animale. Productia mare de ROS in pasarile zburatoare, despre care am discutat mai devreme este diminuata de o rata a productiei ROS mai scazuta (relativ cu cantitatea de oxigen consumata). (Ku si Sohal, 1993; Floyd et al., 2001; Barja, 2002); aceasta este gandita sa fie datorita unui lant mitocondrial respirator mai eficient. Niveluri marite de antioxidanti in animalele care au gripa aviara este inca un alt factor care poate contribui. (Ku si Sohal, 1993). Ratele productiei de ROS si diferentele nivelului de antioxidanti sunt mici (mai putin decat de doua ori), care ridica posibilitatea ca factori aditionali pot contribui la 4-10 ori diferenta a duratei de viata fata de mamifere. (Austad si Fischer, 1991; Holmes et al., 2001).
Astfel, repararea ADN-ului si organizarea genomului, ca parte a adaptarii la longevitate in fata metabolismului oxidativ ridicat? Mecanismul de reparare a pasarilor zburatoare sunt identice in multe feluri cu acelea a altor vertebrate si alte multe eucariote multicelulare. De altfel, printre eucariotele multicelulare, genomul avian este in mod distinct mai mic dintr-un factor de 2-3, si aceasta datorita unei mici cantitati de ADN repetitiv. Mai mult de atat, repetarile care sunt prezente sunt diferite in mod significant unul de celalalt (Burt 2002). Acelasi lucru este real si pentru lilieci – au genomuri mici si ADN repetitiv putin. (vandenBussche et al., 1995).
Ce au de-a face acesti factori de ADN repetitiv cu restructurarea ADN-ului sau cu longevitatea? Bazate pe studiile genelor, ratia recombinatiei omoloaga la NHEJ pare a fi mult mai mare in alte linii limfocite B aviane, relativ cu liniile celulelor umane sau murine. (Buerstedde si Takeda, 1991; Takata et al., 1998). Precum mentionam mai devreme, recombinatia omoloaga poate sa fie limitata in organismele cu o cantitate mare de ADN repetitiv. Dar in organismele cu relativ putin ADN repetitiv, cum ar fi ciupercile, combinatia omoloaga poate repara majoritatea rupturilor de dsADN. Precum recombinatia omoloaga este un mecanism precis a rupturilor de dsADN, este in mod tipic fara pierdere de informatie genetica, in contrast cu NHEJ. Aceasta inseamna ca o rata metabolica oxidativa marita nu va eroda genomul asa de repede intr-un organism care este capabil sa se bizuiasca mai mult pe recombinarea omoloaga. Este important sa notam ca amandoua deteriorari singulara sau dubla catenata care apare in aceste rate metabolice inalte. Pentru oricare cantitate de dublu-catenara deteriorata care poate sa apara in aceste rate metabolice mari aviane (si lilieci), ar putea sa depaseasca cu 20% nivelul vazut in celulele somatice umane, drept urmare necesitand o modulare a ratiei de NHEJ la recombinatia omoloaga.
Nivelul mai mare a recombinatiei omoloage in aviane a fost demonstrata in celule B ale puilor de gaina, unde aceste celule folosesc procesul ca parte a diversificarii imunoglobulinei. (Buerstedde and Takeda, 1991; Takeda, 1991; Takata et al. 1998). Alte tipuri de celule aviane, in mod particular celule primare, inca nu a fost studiate in detaliu. Realitatea, ca eficienta genelor in liniile celulare B la pui pot ajunge la 80%, indica faptul ca genomul avian este compatibil cu abilitatea de a exercita recombinatia omoloaga in mod liber, relativ cu celulele somatice mamaliane duplicate. Daca mecanismul repararii ADN-ului prin recombinare omoloaga este folosit preferential in celulele somatice aviane comparate cu celulele somatice a altor vertebrate, intrebuintarea unei precise (care este practic fara eroare) calea despre repararea rupturii dsADN, pot fi niste specii care s-au desprins din alte vertebrate in longevitate versus schita metabolismului care au cantitati scazute de ADN repetitiv. O cantitate mica de ADN repetitiv poate sa permita o intrebuintare marita a recombinatiei omoloage in locul NHEJ. In mod interesant, fibroblastele primare embrionice de la aviane supravietuiesc mai bine decat duplicatele lor mamaliane cand sunt combinate cu oxigen imbogatit sau cu hidrogen peroxid. (Ogburn et al., 2001). Astfel, longevitatea marita a avianelor poate fi in parte despre cum rupturile de dsADN sunt reparate, in mod special, de cand rupturile cromosomiale sunt legate de provocarea oxidativa. (Karanjawala et al., 2002). Agentii protectivi reducatori cum ar fi glutationul, poate contribui la unele din diferentele dintre specii destul de bine. (Fernandez-Checa, 2003)
|
