Genomica
În capitolele precedente am vazut ca structura, functionarea si reproducerea organismelor vii se bazeaza pe instructaje de pe moleculele de ADN nuclear si mitocondrial cu ajutorul unui limbaj scris reprezentat de codul genetic ce foloseste drept litere bazele azotate ,si ale carui sintagme au fost numite gene
Am vazut modul cum sunt alcatuite genele individual,cum se reproduc si cum se exprima prin proteinele specifice a caror sinteza o dicteaza,si am vazut ca textele genetice ca orice text pot prezenta alteratii numite mutatii care confera întregului sistem al genelor o flexibilitate si chiar o dinamica ce poate fi pozitiva sau negativa.
Totalitatea genelor dintr-o celula a fost numita în 1920 de botanistul german Hans Winkler(1877-1945) genom. El cuprinde atât genele care sunt transcrise si traduse cât si cele ce nu codeaza nimic. În caz 12312j922m ul genomului nuclear se ia în considerarea totalitate secventelor de nucleotide (sau perechi de baze) doar de pe un singur set de cromozomi si nu a celor doua seturi ce caracterizeaza zestrea cromozomiala diploida din celulele somatice.
Genomul uman cromozomial este ca o colectie de 5000 de carti fiecare de 300 de pagini continând în total peste un bilion de cuvinte .Tot aceste urias volum de informatii se afla înscris pe un set de 23 de molecule de ADN .Lungimea ADN-ului din setul de cromatide ale unei singure celule umane in interfaza are o lungime de circa 1,8m cu un diametru însa de numai circa 2,4 nm Acest genom dispune de 3200 Mb
Din acest imens material numai 1,5% reprezinta secventele ce codeaza proteine (în special exoni).Ele sunt circa 20-25.000 La acestea se adauga genele regulatoare, Aproape 97% din genom are functii necunoscute Printre acestea se gasesc elemente repetive izolate,elemente repetitive grupate în tandemuri (sateliti, minisateliti, microsateliti) .transpozomi de ambele clase si pseudogene (Wikipedia)
Toate aceste regiuni ce nu codeaza proteine si care nu au functii regulatoare reprezinta o enigma fascinanta a geneticii moleculare. Aceste gene numite de englezi "junk DNA"sunt în mare masura relicve ale evolutiei genomului. E vorba de gene care cândva au fost functionale dar care în urma evolutiei si-au pierdut rolul dar totusi s-au transmis din generatie în generatie. Ramâne însa întrebarea de ce acestea se pastreaza si nu se elimina dat fiind ca prezenta lor este un balast spatial dar si energetic în cursul diviziunii celulare.
Unele din aceste secvente enigmatice par sa fie o rezerva ce poate fi utilizata în anumite conditii;altele sunt un element stabilizator ele protejând genele operationale mai ales fata de traumatismele mecanice din cursul unor diviziuni celulare(ca de ex din cursul procesului de crossing over);în fine unele din ele par a avea functii importante în special de tip regulator dar care înca nu au fost descifrate .Sunt cercetari care arata ca unele din ele intervin sa repare unele rupturi ale lantului ADN. În ansamblu putem spune ca acest imens material este departe de a fi un simplu material de umplutura sau numai ramasitele care au supravietuit evolutiei. Oricum sunt un domeniu important de cercetare care ne va oferi în viitor multe surprize
Toate genomele indivizilor unei specii sunt similare dar nu identice. Diferentele ,care nu afecteaza mai mult de 0,1% din genom, explica diferentele dintre indivizi. Aceste diferente pot fi doar înlocuirea unei perechi de nucleotide dintr-o gena (single nucleotid polymorphisms - SNPs).O alta clasa de diferente este constituita de variabilitatea numarul de copii ale diferitelor gene Variabilitatea regiunilor repetitive este folosita - cum vom vedea - pentru stabilirea amprentei genetice, De asemenea exista variatii individuale în ceea ce priveste amploarea componentei heterocromatice a cromozomilor (care însa contine foarte putine gene functionale)
Unul din obiectivele geneticei a fost si este sa faca inventarul cromozomilor si apoi hartile acestor cromozomi (pe care sunt marcate locurile diferitelor caractere ereditare si ale genelor (mai ales ale celor responsabile de diferite malformatii sau boli). Aceste harti la om se refera la cei 22 de cromozomi autosomali si la cromozomii X si Y. Acesti cromozomi sunt de lungimi diferite si au fost numerotati în ordinea descrescânda a lungimilor lor de la 1(cel mai lung)la 22 (de 10 ori mai scurt)
1) Primele harti - asa cum am mai spus - le datoram lui Morgan care a cartografiat distantele dintre unele caractere ereditare urmarind efectele procesului de crossing over asupra "lincajului" sau recombinarii acestora. Sunt harti genetice
2) A doua etapa a fost determinata - asa cum am mai amintit -de descoperirea benzilor cromosomiale de catre T.O Caspersson (1910-1997)în 1997 care a permis întocmirea hartilor cromozomiale citogenetice cu identificarea de denumirea benzilor
Am vazut ca în profaza, orice cromozom este format din alipirea la nivelul centromerului a doua cromatide surori,ceea ce îi confera forma clasica de X cu doua brate mici(desemnate cu "p" de la "petit")si doua brate lungi(desemnate cu "q" de la "queue")fiecare din brate terminându-se cu câte un telomer. Acesti cromozomi când sunt colorati cu anumiti coloranti(un compus de quinacrina,colorantul Giemsa dupa digerare cu tripsina etc.)prezinta o serie de benzi transversale de grosimi si de intensitati diferite distribuite în lungul bratelor cromozomilor. Exista si benzi mai putin evidente numite subbenzi Aceste benzi sunt numerotate de la centromer catre telomer si formeaza un sistem de repere (vizibile cu microscopul optic) în raport cu care se stabileste localizarea unei gene.
Benzi cromozomiale
Astfel o gena situata la nivelul celei de treia benzi, de pe bratul lung al cromozomului 12 se noteaza 12 q 3. .Simbolizarea 2 p 4, 3 reprezinta un loc asezat la nivelul benzii 4 si subbenzii 3 de pe cromozomul 2 .Telomerele (extremitatile cromozomilor)sunt notate ptel sau qtel(ex 12 p tel = telomerul de pe ramura mica a cromosomului12) iar o localizare la nivelul centromerului este notata cu c(d.ex c3 =centromerul cromozomului 3)
Într-o cartografiere a genelor nu trebuie precizate numai benzile,ci si genele. În legatura cu acestea s-a constituit un sistem de desemnare a lor prin denumiri sau simboluri care sa fie univoce,universale si fara confuzii posibile. Pentru aceasta exista un nomenclator universal si un set de reguli care stabilesc modul cum se compun numele sau simbolurile respective. Exista si ghiduri pentru diferitele specii Astfel exista un ghid pentru om (Way H si col.)Simbolurile afectate cuprind doar litere mari latine si cifre arabe,si deriva din numele(englez) descriptiv al genei,locului sau regiunii respective sau al sindromului pe care le genereaza
De exemplu gena"insulin dependent diabetes mellitus 6" este simbolizata IDM6;gena "lactat dehydrogenase "cu trei variante LDHA,LDHB si LDHC ;gena sindromului" Allan-Hernon-Dudley Sydrome"AHDS s.a.m.d. Daca în numele respective exista litere grecesti .in simbolul folosit se utilizeaza echivalentul latin Astfel pentru "Galactosidase apha "avem GLA si pentru "Galactosidase beta"avem GLB Toate aceste reguli permit ordonarea lor alfabetica riguroasa
Model de harta cromozomiala pe care sunt marcate unele gene
Pe unele harti cromozomiale se mentioneaza si numarul de baze din fiecare fragment exprimat în megabaze
Harta unui cromozom cu genele respective si numarul de baze
Deosebitul interes suscitat de cercetarile de genetica moleculara au dus la initierea programului de stabilire a genomului uman care sa cuprinda inventarul tuturor genelor din cariotipul lui Homo sapiens sapiens. Terminarea primei etape a acestui program a fost anuntata la 26 iunie 2000 de presedintele Bill Clinton si de primul ministru Tony Blair. Cartografierea ultimului cromozom a fost terminata în anul 2006 iar la 4 sept 2007 J.Craig Venter a anuntat terminarea inventarului tuturor secventelor din cariotipul uman cuprinzând 6 bilioane de baze. Rezultatele acestor cercetari sunt extraordinar de interesante si utile iar datele respective sunt accesibile ele apartinând patrimoniului stiintific
Cu titlul de curiozitate vom aminti ca genomul omului din Neanderthal difera de al nostru doar cu 0,5% iar cel al cimpanzeului cu 1,23%
Biosinteza proteinelor
Stabilirea exhaustiva a genomului uman a fost un pas hotarâtor pentru a cunoaste determinarea genetica. Ideea de baza a fost ca genomul dicteaza sinteza proteinelor plastice dar mai ales a celor operationale,a enzimelor care sunt responsabile de gestiunea formelor si functiilor organismelor vii Totusi trebuie sa mentionam ca aceasta determinare nu este univoca deoarece sinteza proteinelor de catre o secventa ADN se realizeaza cu variante mai ales în ceea ce priveste organizarea spatiala a moleculelor respective. De aceea se ventileaza ideea initierii unui program de inventariere a tuturor proteinelor umane(proteinomul)
Paralel se preconizeaza initierea unui program care sa determine diversitatea genomelor umane care va avea o importanta deosebita antropologica si medicala,a unui inventar al variatiilor genetice(variomul)si al tuturor structurilor celulare si subcelulare (citomul)
Evident ca se pune întrebarea la ce foloseste imensul efort de inteligenta munca si bani pe care l-a implicat descoperirea genomului uman si în paralel al genomului altor specii.
În afara de importanta lui academica datele respective sunt foarte importante în primul rând pentru medicina caci vor permite realizarea de indiscutabile progrese privind:diagnosticarea unor clase de boli(d,ex a celor heredo-familiare) sau a predispozitiilor pentru anumite afectiuni;stabilirea riscurilor unor manifestari patologice;creerea rationala a unor noi medicamente(în general va impune noi directii farmacologiei ajungându-se la o adevarata farmacologie genetica sau farmacogenomica) si în fine realizarea unor terapii genice. De asemenea cunoasterea mecanismelor biologice implicate în producerea unor boli(d.ex. unor forme de cancer)va beneficia de pe urma imensei banci de date realizata prin programul genomului uman
Genomul uman va permite noi studii în domeniul antropologiei,privind diversitatea umana,evolutia si migratiile umane
O alta beneficiara va fi psihologia mai ales pentru studiul aptitudinilor,a personalitatii si pentru consiliere
Identificarile umane,în justitie (ex. stabilirea paternitatii)si criminologie ( ex identificarea vinovatului)vor profita si ele de pe urma acestui efort.
Pe lânga genomul cromozomial(nuclear)toate celulele eucariotelor animale(inclusiv omul) mai dispun cum am mai spus e un genom mitocondrial reprezentat de materialul genetic propriu acestor formatiuni subcelulare. Acest material genetic serveste multiplicarii si functionarii mitocondriilor care se pare ca sunt - potrivit teoriei endosimbiotice -paraziti ancestrali care s-au adaptat devenind componente ale celulelor gazda animale (cum sunt cloroplastele la plante)
Esential este faptul ca genomull mitocondrial nu se transmite decât pe linie feminina. Fiecare celula nu contine decât genomul mitocondrial din ovulul mamei caci mitocondriile din spermatozoizi sunt distruse în momentul fecundarii
Genomul mitocondrial ca si cel al procariotelor este reprezentat de o singura molecula de DNA care însa este circulara. Aceasta molecula nu este îngramadita ca cele de ADN nuclear în cromatide si nu este izolata de citoplasma printr-o bariera cum este membrana nucleara
Are doar 16.569 de perechi de baze si dispune de gene ce codeaza 13 proteine,22 de molecule de ARN t si 2 de ARN r. Regiunile mute(introni,"junk DNA") sunt extrem de reduse si genele repetitive sunt aproape absente O celula ou contine 100.000 -1000.000 de molecule de ADN mitocondrial(ADN mt)
Cum vom vedea ,desi implicarea ADN mt în realizarea fenotipului uman este foarte redusa,modificari ale acestui ADN pot genera unele boli foarte grave,e drept si foarte rare
Aceste identificari se fac stabilindu-se amprenta genetica. Fiecare fiinta vie este un unicat determinat de factorii genetici. Unicitatea aceasta se regaseste si la nivelul genomului,caci fiecare fiinta vie are un genom propriu diferit de cel al altor fiinte.
Acest aspect a fost exploatat pentru stabilirea identitatii pe baza unor indicatori sau indici de recunoastere De asemenea, datorita modului cum se transmite genomul, la nivelul lui se pot gasi indicatori care sa permita stabilirea sau infirmarea unor legaturi de rudenie între doua exemplare diferite(d.ex stabilirea paternitatii, unei filiatii oarecare sau apartenenta la o familie data)
Identificarea acestor indicatori sau indici de recunoastere sta la baza realizarii amprentelor sau semnaturilor genetice
Indicatorii respectivi nu se gasesc la nivelul genelor ce codeaza proteine sau a genelor regulatoare,ci la nivelul secventelor de baze inactive(junk ADN) si repetitive. Unele din ele sunt secvente repetitive de baze grupate în tandemuri scurte de circa 4 baze si sunt numite microsateliti(STR Short Tandem Repeats). Altele sunt secvente repetitive de tandemuri lungi de 10-100 de baze numite minisateliti(VNTR Variable Number Tandem Repeats)Toti acesti sateliti difera de la individ la individ prin lungimile lor
Identificarea acestor variante si distributia lor este cheia de bolta a realizarii amprentelor genetice pe care le datoram geneticianului englez sir Allec John Jeffreys (n 1950)care a folosit-o prima oara în 1986 depistând un violator dintr-o grupa de 5000 de persoane
Tehnica obtinerii amprentei genetice
Stabilirea amprentei genetice este un proces laborios si costisitor desi preturile substantelor necesare au scazut în ultima vreme .ADN-ul de cercetat este supus unei fragmentari tintite cu ajutorul unor enzime speciale care elibereaza fragmentele dorite de STR sateliti Aceste fragmente sunt de dimensiuni variabile la fiecare individ in functie de numarul de repetitii a tandemurilor. iar aceasta variabilitate difera de la individ la individ
Fiecare tara (sau laborator)utilizeaza un anumit set se microsateliti
Pentru a avea o cantitate suficienta, aceste fragmente sunt supuse unui proces de multiplicare în lant ,cu ajutorul unei polimeraze (metoda PCR "polymerase chain reaction")care sporeste fragmentele de ordinul miliardelor de ori
Apoi fragmentele respective sunt supuse unei separari prin electroforeza pe un gel sau capilara. Fragmentele se grupeaza pe suportul respectiv în functie de lungimea lor si grupurile sunt diferite ca marime în functie de numarul fragmentelor ce le contine fiecare din ele. Se obtine astfel o distributie caracteristica pentru fiecare individ formata dintr-o coloana de liniute de grosimi diferite fiecare liniuta corespunzând unei anumite grupe de microsateliti de aceeasi lungim.
Pentru vizualizarea lor foitele cu aceste coloane sunt copiate pe o membrana de nitroceluloza sau nilon .Pe aceasta membrana fragmentele respective se marcheaza radioactiv sau fluorescent
Doua exemple de identificare a amprentelor genetice
Amprentele obtinute pot fi identificate prin comparare
|
