Lipide microbiene
6.1. Introducere
Este cunoscut de mult timp faptul ca microorganismele sunt capabile sa produca lipide. Pentru a se pastra analogia cu plantele din care se extrag uleiurile, aceste microorganisme au fost denumite oleaginoase. Doar uleiurile foarte valoroase pot fi obtinute prin procese biotehnologice, deoarece în cazul uleiurilor obisnuite, pretul de cost este superior produselor similare obtinute prin procedeele clasice.
[1]]. Pretul untului de cacao a variat între 3000 si 8000 $ S.U.A. per tona (vrac). Mentinerea unui pret pe tona în jurul valorii maxime face ca metodele biotehnologice sa de obtinere a triacilglicerolilor sa devina promitatoare, mai ales în cazul utilizarii ca sursa de carbon a apelor reziduale din diverse industrii.
O alta oportunitate pentru procesele biotehnologice o constituie uleiurile utilizate în îngrijirea sanatatii cum ar fi uleiurile polinesaturate. Dintre acestea trebuie mentionate acidul γ-linoleic (18:3 ω-6), acidul arachidonic (20:4 ω-6), acidul eicosapentanoic (20:5 ω-3), etc [ ].
Lipidele cu valoare foarte ridicata sunt compusi prostanoidici cum ar fi prostaglandinele, leukotrienele si tromboxanii, folositi în special în scopuri terapeutice experimentale. Ţinând seama de utilizarile acestor compusi cantitatile necesare sunt de ordinul câtorva kg/an.
6.2. Scurt istoric
Prima referinta la uleiurile microbiene apare în lucrarea lui Nägeli si Loew "Uber die Chemische Zussammensetzung der Hefe" publicata în 1878 [ ]. Prima fractionare a unui amestec de lipide microbiene a fost realizata de Hinsberg si Roos în 1903. Ei au identificat un acid gras saturat cu formula C15H30O2 (probabil un amestec de acizi miristic si stearic) alaturi de doi acizi nesaturati din care unul era acidul oleic, iar celalalt un acid gras C12. "Colesterolul" sau mai probabil ergosterolul a fost de asemenea identificat în lipidele extrase.
Prima biotehnologie de obtinere a grasimilor si uleiurilor din Torula a fost realizata de Lindner la Berlin în 1890. Procesul a fost dezvoltat la scara pilot în 1914-1918 cu Trichosporon pullulans în încercarea de a gasi o sursa alternativa de grasimi în timpul primului razboi mondial.
Conceptele dezvoltate de Lindner au stat la baza elaborarii biotehnologiilor de obtinere a uleiurilor si 525j91f grasimilor microbiene. Este demn de mentionat faptul ca în 1937 Fink a ajuns la concluzia ca obtinerea industriala a lipidelor microbiene este neatractiva în viitorul apropiat. Odata cu izbucnirea celui de-al doilea razboi mondial cercetarea în acest domeniu a fost din nou intensificata în Germania în cadrul a doua companii Zellstoff Fabrik în Maaheim-Waldorf si Henkel et Cie GmbH în Dusseldorf. Prima companie si-a orientat eforturile catre Candida utilis în timp ce ultima s-a concentrat asupra genului Fusarium. În aceasta perioada s-a facut si trecerea de la cultura de suprafata la cultura submersa. Nici unul din aceste procese nu a constituit un succes deplin, producându-se doar cantitati mici de grasimi microbiene ce au fost folosite în hrana cailor.
Dificultatile întâmpinate în dezvoltarea tehnologiilor pentru obtinerea grasimilor microbiene au fost în principal de natura tehnica, deoarece nu exista o tehnologie eficienta pentru producerea unor cantitati mari de biomasa bogata în grasimi.
Aceasta problema a putut fi depasita în momentul dezvoltarii biotehnologiilor pentru obtinerea antibioticelor în cultura submera si apoi a proteinelor monocelulare.
Prof. F.Lynen a primit premiul NOBEL pentru chimie în 1964 pentru studiile legate de biosinteza lipidelor microbiene [7].
6. 3. Microorganismele producatoare
Candida utilis
C. utilis
Cryptococcus terricolus
Debaryomyces hansenii
Hansenula anomala
Kluyveromyces polysporus
Lipomyces lipofer
Lipomyces starkevi
Pichia fermemans
Pullaria pullulans
Rhodosporidium toruloides
Rhodotorula graminis
Saccharomyces carlsbergensis
S. cerevisiae
S.fragilis
Schizosaccharomyces pombe
Trichosporon cutaneum
Trigonopsis variabilis
Organism
Phycomycetes
Conidiobolus denaesporus
a
Cunninghamella echinulata
a
Entomophthora coronata
a
Mucor mucedo
a
Rhizopus arrhizus
Saprolegnia parasitica
a
Ascomycetes
Aspergillus niger
Botyritis cinerea
Fusarium moniliforme
Microsporium gypseum
Penicillium chrysogenum
P. notatum
Stilbella thermophila
Basidiomycetes
Agaricus campestris
Fames sp.
Tricholoma nudum
a acid γ-linolenic
6. 4. Acumularea lipidelor
Desi ca orice organism viu si microorganismele contin întotdeauna lipidele necesare functionarii membranelor, nu toate microorganismele pot fi considerate surse de lipide.
Practic, sunt denumite oleaginoase, microorganismele ce contin peste 20-25% lipide. Boulton si Ratledge [ , ] au corelat capacitatea de acumulare a lipidelor cu activitatea citrat liazei, enzima din ciclul ATP care participa la formarea acetil CoA din citrat conform ecuatiei globale:
|
citrat +ATP+ CoA acetilCoA+oxaloacetat +ADP +Pi |
|
Activitatea citrat liazei reprezinta un indicator foarte important asupra capacitatii unui microorganism de a acumula lipide, cu atât mai mult cu cât citrat liaza nu este prezenta în drojdiile neoleaginoase si nici în cazul tulpinilor neoleaginoase ale unor specii carora le apartin si tulpini oleaginoase cum ar fi Lipomyces starkeyi si L. lipofer.
Din 600 de specii de drojdii, numai 25 sunt capabile sa acumuleze mai mult de 20% lipide, iar din cele 60.000 de specii de fungi doar 50 acumuleaza mai mult de 25%.
Figura 1. Cardiolipina..
Figura Steroli din drojdii: ergosterol (stânga), zimosterol (dreapta).
|
|
|
Figura 3. Carotenoizi din drojdii; de sus în jos β-caroten, β-torularodina, astaxantina.. |
[6]] si astfel va deveni "obeza" asemanator animalelor superioare (Figura 4).
|
|
|
Figura 4. Cryptococcus curvatus (Candida curvata=Apiotrichum curvatum) crescutǎ timp de 48 de ore pe mediu cu limitare de azot; se observǎ prezenta picǎturilor de grǎsime (continut de lipide aprox. 40%); lungimea barei de marcare =1 mm. |
Figura 6. Variatia concentratiei biomasei, azotului si lipidelor (intracelulare) cultivarea drojdiilor în sistem continuu..
6. 5. Biochimia formarii lipidelor în microorganismele oleaginoase
Din punct de vedere structural, acetil-CoA carboxilaza este o enzima complexa: au fost identificate 3 componente functionale si anume biotin proteina transportoare de carboxil (BCCP), biotin carboxilaza si carboxil transferaza [ ].
|
Biotin-BCCP
+ HCO3- + H+ + ATP |
|
|
Carboxibiotin-BCCP
+ Acetil-CoA |
|
malonil-S-enzima, rezultatul concret al fiecarui ciclu de reactii este introducerea a doi atomi de carbon suplimentari în gruparea acetil initiala. Acesti atomi de carbon suplimentari sunt ei însisi obtinuti din acetil-CoA substrat al acetil CoA carboxilazei. Dupa 7 repetari ale ciclului, este sintetizata palmitoil-CoA cu urmatoarea stoechiometrie:
|
MeCOSCoA + 7(HO2CCH2COSCoA)
+ 14NADPH + 14H+ Me(CH2)14COSCoA + 7CO2 /CoASH + 14NADP+ 6H2O |
|
6. 6. Factorii care influenteaza biosinteza lipidelor
Sunt multi factori care afecteaza compozitia lipidelor intracelulare si astfel pot provoca o crestere sau o scadere a cantitatii totale de lipide intracelulare. Pentru ca aproape orice schimbare în conditiile de crestere ale microorganismului poate determina o variatie în compozitia lipidelor, este necesar sa se tina seama de succesiunea de evenimente care se produc la variatia unui singur parametru în timpul cultivarii discontinue. De exemplu, în cazul influentei temperaturii asupra gradului de nesaturare al gruparilor acil grase din lipide, trebuie sa se tina seama ca o scadere a temperaturii va încetini viteza de crestere a organismului si simultan va duce la cresterea cantitatii de oxigen dizolvat în mediu. Aceste variatii ale conditiilor de cultivare ar putea sa influenteze starea metabolica a celulelor ceea ce poate determina scaderea sau cresterea pH, necunoscându-se care dintre aceste schimbari semnalizeaza efectul variatiei temperaturii.
Influenta vitezei de crestere asupra acumularii lipidelor în microorganismele oleaginoase este un factor determinant major al cantitatii de lipide care se acumuleaza intracelular (Figura 6), desi în organismele eucariote neoleaginoase efectul pare sa fie mai putin evident.
Cele mai multe experimente s-au facut cu drojdii si majoritatea cu glucoza, uneori cu metanol sau etanol. Glucoza, a carei metabolizare urmeaza calea Embden-Meyerhof, pune cele mai multe probleme pentru microorganismele eucariote, care din acest punct de vedere sunt clasificate ca fiind Crabtree pozitive sau Crabtree negative. Pentru microorganismele Crabtree pozitive, o crestere a concentratiei de glucoza sau orice alt zahar metabolizat pe calea glicolitica are ca rezultat o represie a sintezei enzimelor oxidative (respiratorii) si se manifesta printr-o scadere a consumului de oxigen cuplata cu acumularea de intermediari metabolici redusi, cum este etanolul. S.cerevisiae este o drojdie tipic Crabtree pozitiva; o crestere a concentratiei de glucoza va determina astfel o marire a productiei de etanol chiar în conditii aerobe. Schimbarile metabolice sunt asociate probabil cu o scadere a componentelor mitocondriale ceea ce conduce la o scadere generala a sumei acizilor grasi, glicerofosfolipidelor si sterolilor esterificati.
La drojdiile Crabtree negative, cum sunt Candida utilis si Saccharomyces fragilis, se constata o crestere a lipidelor acumulate pe masura ce concentratia de glucoza creste. Cresterea cantitatii de lipide se manifesta în principal sub forma triacilglicerolilor.
Tabelul 3. Acizii grasi din drojdiile consumatoare de metanol.
|
Microorganism |
Substrat |
Lipide (%) |
Acizi grasi ( %) |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Candida guilliermondii |
metanol |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
glucoza |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Canida boidinii |
metanol |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
glucoza |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Hansenula polymorpha |
metanol |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
glucoza |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
În cazul drojdiilor consumatoare de metanol care sunt facultativ metilotrofe, apar variatii mari în ceea ce priveste spectrul de acizi grasi fata de drojdiile crescute pe glucoza (Tabelul 3 ).
În cazul a doua drojdii crescute pe metanol s-au constatat modificari importante în compozitia fosfolipidelor: au crescut fosfatidil serina si fosfatidil inositolul pe seama fosfatidil colinei [ , ].
Experimente efectuate în cultivare fed-batch au demonstrat influenta substratului asupra corelatiei dintre concentratia celulara si continutul de lipide. Astfel, cu tulpina Lipomyces starkeyi cultivata pe substrat etanol s-a obtinut o concentratie a biomasei de 150 g/l si un continut de lipide de 54%. Folosind tulpina Rhodotorula glutinis pe glucoza în cultivare fed-batch a fost obtinuta o concentratie de biomasa de 181 g/l cu un continut de 43% lipide. În aceste cazuri, cresterea a trebuit sa fie sustinuta prin utilizarea de aer îmbogatit cu oxigen (40% oxigen). Pare posibila atingerea unor concentratii celulare de 100 g/l si fara a folosi oxigen suplimentar, cu cele mai multe dintre drojdiile oleaginoase.
În general, gradul de nesaturare al acizilor grasi din sistemele biologice creste pe masura ce temperatura de cultivare scade, observatie valabila atât pentru organismele procariote [ ] cât si pentru cele eucariote . Atunci când studiile s-au desfasurat în chemostat, corelatia dintre gradul de nesaturare si temperatura a fost confirmata în multe cazuri. Dar nu toate organismele prezinta acest comportament; s-au constatat diferente putin semnificative în gradul de nesaturare al acizilor grasi la Saccharomyces cerevisiae între 30 si 15 oC [[13]]; la Candida sp. 107, între 19 si 32,8 [ , ], sau la Rhodotorula gracilis între 22,5 si 30oC.
La eucariote, oxigenul este necesar pentru transformarea acidului stearic în acid oleic si apoi în acizi linoleic si linolenic. Deoarece exista o singura etapa în biosinteza acizilor grasi care necesita ATP si nici una care sa necesite oxigen direct, este de asteptat ca lipsa oxigenului sa nu conduca la scaderea continutului de lipide din celule, fiind afectat doar randamentul în biomasa.
6.7. Consideratii tehnico-economice
Bibliografie
Boulton, C. A., Ratledge, C., J. Gen. Microbiol., 127,169-176 (1981).
Boulton, C. A., RatledGE, C., Comprehensive Biotechnology (M. MOO-YOUNG) vol 1
. Gill, C.O., Hall, M. J., Ratledge, C.,. Appl. Environ. Microbiol., 33, 231-239 (1977).
|
Carboxibiotin-BCCP + ADP + Pi
Biotin-BCCP + Malonil-CoA