ALTE DOCUMENTE
|
|||||||||
FCS- Fuorescence correlation spectroscopy
Fig. 8. Spectroscopia prin corelarea fluorescentei. Fluctuatiile reflecta procesele dinamice ce apar in spot.[39]
Fig.9 Schema de principiu a sistemului optic utilizat pentru FCS si FRAP
ND1 si 2 –filtre de densitate, MR- oglinda, DM-oglinda dicroica, SF- filtre spatiale, MON-dispozitiv ce monitorizeaza fasciculul laser, L1,2 si3 Lentilele microscopului, BF- filtru de tip bariera, FD- diafragm, PMT- tubul fotomultiplicator.[38]
FRAP ( Fuorescence Recovery After
Photobleaching):
Fig.10 Reprezentare schematica FRAP- Fluorescence Recovery After Photobleaching
Se obtine mai intai o linie de baza a fluorescentei (1), inainte de fotoalbire, care va duce la o reducere semnificativa a fluorescentei(2). Dupa o anumita perioada, „cantitatea” de fluorescenta creste – recuperarea fluorescentei (3) deoarece moleculele care nu au fost „albite” difuzeaza din nou pe suprafata supusa fascicolului laser care produce „fotoalbirea”. Dupa o perioada de timp se obtine o stabilizare a intensitatii fluorescentei (4) sub forma liniara. Procentul de recuperare utilizeaza formula (X/Z)x100 = % recuperare. In diagrama procentul de fluorescenta pierduta in timpul „fotoalbirii” este X iar „cantitatea” de fluorescenta care reapare pe zona „fotoalbita” este Y. In practica procentul de recuperare nu ajunge niciodata la 100%. Coeficientul de difuziune laterala se determina pe baza curbei (3), cu cat curba are o amplitudine scazuta si implicit recuperarea fluorescentei mai rapida, cu atat mobilitatea laterala moleculara este mai mare.[39,46]
De actualitate este utilizarea FRAP pentru studiul interactiilor de legare sau nelegare la nivel celular. In acest sens apare asa numita FRAP in prezenta difuziei si capacitatea de legare a unei molecule care presupun notiunile de: rata de asociere si difuziune-cuplare FRAP. Rata de asociere se refera la produsul
Tabel. 1 Rata de recuperare a fluorescentei in functie de masa moleculara
Depolarizarea fluorescentei:
FRET- Fluorescence Resonace Energy Transfer
emisie fluorescenta normala, raza de culoare verde, polarizata, in solutii diluate (b) depolarizarea fluorescentei prin homotransfer (FRET) pentru solutii concentrare, distanta dintre acceptor si donor trebuie sa fie pana in 10 nm pentru a apare homotransferul.(c) SPT pune in evidenta modul de difuziune a particulei pe zone „compartimentalizate” (rafturi) de 300 nm.[74]
In cazul membranelor, in ceea ce priveste evaluarea fluiditatii membranare, aceasta metoda poate evalua eterogenitatea distributiei lipidice si a dimensiunii microdomeniilor. Daca eficienta FRET este direct proportionala cu densitatea moleculara, presupunand o distributie neomogena atunci se poate considera ca eficienta FRET reflecta modul de „clustering” (organizare in microdomenii membranare). [62] Studiile FRET recente au indicat ca domeniile membranare au dimensiuni de aproximativ 25 nm in diametru cele mai mici implicand doar aproximativ 5 molecule dar metoda folosita a fost RES.[63]
prin urmarirea anizotropiei polarizarii in cazul unor molecule lipidice marcate fluorescent. Se urmareste polarizarea in plan paralel si perpendicular (P si S) comparativ cu planul fascicolului laser folosit pentru excitare. Inregistrarile sunt procesate in functie de numarul de counts/pixel de la nivelul CCD, si au loc cu o intarziere de 30 ms pentru fiecare imagine .[68]
Fig.16 Histograme urmarind anizotropia unor molecule lipidice la nivelul unor membrane artificiale in monostrat (A si B) pentru TRM-fosfatidil etanolamina (POPE) in monostrat de fosfatidilcolina (POPC), respectiv Cys7-POPE in POPC, si la nivelul unor membrane artificiale in bistrat(C si D) pentru aceleasi molecule marcate fluorescent ca si in cazul precedent. [68]
Fig.17 Microscop utilizat pentru vizualizarea a doua specii de molecule fluorescente
.
Depletia colesterolului intervine in formarea complexelor cu greutate moleculare
mare la nivelul aparatului Golgi. Tratarea celulelor cu mevinolin (mev) si
β CD duce la depletia colesterolului si la modificarea comformationala
a PLAP. Marcarea simultana a GPI -GFP si a PLAP ( placental
phosphatase alkalin- enzima cu expresie ridicata la nivelul
apical al MDCK(Madin-Darby Canine Kidney
Epithelial Cells) ne permite urmarirea implicarii GPI si a
proteinelor in realizarea „rafturilor” membranare. [75]
Posibilitatea de mobilitate atat rotationala cat si liniara este pusa in relatie si de interactiile proteinelor membranare cu citoscheletul membranar.
Exista doua modele se interactiune dintre proteinele membranare si citoschelet: primul se refera la faptul ca proteinele se pot lega de filamentele (fig 19. b) citoscheletului, cel de al doilea sugereaza ca proteinele sunt libere sa se miste (fig.19.a), dar sunt restrictionate de organizarea in retea („in ochiuri de plasa”) a citoscheletului care se constituie ca o bariera impotriva difuziei libere a proteinelor membranare.
Fig.19 a- Modelul de interactiune proteine citoschelet in care proteinele sunt ancorate la reteaua citoscheletului; b- Modelul in care proteinele sunt libere sa se miste, dar sunt restrictionate de citoschelet.[70]
Exista cel putin cinci procese elementare importante in reglarea miscarilor si organizarii macromoleculare proteice membranare: interactiunea dintre citoschelet si proteinele membranare, asocierea de proteine, repartizarea in domenii lipidice, transportul vezicular cat si sistemul de semnalizare intracelulara. Se poate spune ca aceste procese actioneaza in colaborare, de exemplu daca o proteina formeaza dimeri cand receptioneaza un semnal extracelular, interactiunea cu citoscheletul va fi amplificata iar probabil ca acesti dimeri sunt parte integranta dintr-un „raft” membranar.
Mark DeBrabander, Hugo Geerts, Ken Jacobson si Mike Sheetz, pentru a vizualiza experimental aceste miscari proteice membranare au atasat particule de aur coloidal cu ajutorul unor liganzi sau anticorpi. Marimea particulei utilizata a fost de 40 nm diametru.[70] Particulele de aur au fost apoi vizualizate cu ajutorul microscopului cu contrast de faza
In fig.18 se poate observa miscarile receptorului de transferina pe suprafata celulelor epiteliale renale de sobolan (NRK). Aceasta miscare nu este un de tip Brownian. Se pare ca in anumite domenii membrabare se misca mai rapid iar in altele este scazuta.[71]
Fig. 20 Traiectoriile tipice pentru receptorul de transferina la nivelul NKR
Rezolutia de timp a miscarii este de 33 ms, timpul de observare fiind de 16,7 s
a. reprezentarea diagramatica a miscarii particulei de Au- coloidal
b. schema a citoscheletului membranar
Numerosi receptori membranari au o mobilitate restransa datorita interactiunilor cu citoscheletul.[71]
CCD-ul este un mic cip din siliciu, care are delimitate pe el niste mici patrate sau dreptungiuri numiti pixeli. Pixelii nu sunt delimitati fizic pe chip, ci prin intermediul unor voltaje aplicate pe chip. Marimea tipica a unui cip CCD este de 5-10 mm pe o latura, marimea pixelilor de pe suprafata cipului fiind intre 4 si 24 microni. Astfel, un cip CCD este o matrice de pixeli, avand de la 200x300 pixeli pana la 3000x5000 de pixeli si mai mult. Siliciul este sensibil la lumina, si cand lumina cade pe suprafata lui, materialul produce electroni = efectul fotoelectric, care i-a adus lui Einstein premiul Nobil pentru Fizica, si care sta la baza celulelor solare! Cam acelasi principiul sta si la baza CCD-urilor, lumina (gandita ca fiind alcatuita din fotoni) cade pe 'pixeli' delimitati pe suprafata cipului CCD si 'smulge' electroni din fiecare pixel. in CCD, acesti electroni sunt 'stocati' si se acumuleaza intr-o structura gen condensator electric, cate un mic condensator pentru fiecare pixel. 'Condensatorii' nu sunt macroscopici, ci sunt de fapt 'crescuti' pe chipul CCD in procesul de creare al chipului. Deci expunem siliciul la lumina, el transforma fotonii in electroni, cu cati mai multi fotoni pe un pixel, cu atat mai multa sarcina se acumuleaza 'sub' pixelul respectiv. Dupa ce 'expunem' CCD-ul, mai vrem sa-l si 'citim'. Din limitari de harware, nu putem citi toti pixelii odata, de fapt ii putem citi numai cate unul odata. Asa ca de fapt electronica chipului incepe si citeste sarcina acumulata in primul pixel din coltul din dreapta jos a chipului, apoi sarcina de pe linia de jos este 'mutata' un pixel mai la dreapta, al doilea pixel la rand este citit si tot asa, pana se termina cu primul rand. Cand am terminat cu primul rand, toate sarcinile sunt 'mutate' o 'linie' mai jos, linia doi de jos devenind linia unu si fiind citita pixel cu pixel ca mai sus. si tot asa, pana se termina de 'citit' tot cipul. Cumva, citirea merge ca o masina de scris, litera dupa litera, apoi 'enter' si trecem la randul urmator, si tot asa, pana terminam toata pagina [69]
|
