CAPITOLUL III
NUTRIŢIA MICROORGANISMELOR
Nutritia este un proces fiziologic complex, prin care microorganismele îsi procura energia si toate elementele necesare cresterii, reproducerii si întretinerii functiilor vitale.
Procesul de nutritie se realizeaza în cadrul metabolismului celular care cuprinde doua laturi esentiale:
- reactiile de catabolism care constau în degradarea secventiala a compusilor macromoleculari prin actiunea catalitica a enzimelor. Degradarea consta în formare de compusi cu molecule mici si se face secvential pe cai biochimice, prin care se elibereaza cuantificat energia potentiala cuprinsa în produsul catabolizat. Aceste reactii au caracter exergonic.
- reactiile de anabolism se desfasoara concomitent cu reactiile de catabolism si constau în reactii de biosinteza catalizate enzimatic prin care celula vie, folosind compusi cu molecule mici si o cantitate de energie, cladeste compusi macromoleculari, care intra în structura celulei cu rol functional sau de rezerva. Totalitatea reactiilor de anabolism contribuie la cresterea în dimensiune si la reproducerea celulelor si au caracter endergonic.
Pentru asigurarea procesului de nutritie celula microbiana necesita diferiti nutrienti care trebuie sa prezinte anumite dimensiuni care sa le permita trecerea prin peretele celular si membrana citoplasmatica. Apoi sunt transformati în celula si are loc formarea compusilor celulari.
 |
În cazul reactiilor de catabolism, compusii macromoleculari sunt continuti de substratul care constituie nutrient pentru celula vie, iar în cel al reactiilor de anabolism compusii macromoleculari se regasesc în componentii celulari esentiali pentru crestere, reproducere si întretinerea functiilor vitale. Compusii cu molecule mici care nu mai sunt necesari se elimina sub forma produsilor de catabolism.
În procesul de nutritie se stabileste o interdependenta între microorganisme si mediu. În aceasta unitate dialectica mediul are rolul activ iar microorganismele se adapteaza la conditiile de mediu actionând si transformând mediul. Aceasta interrelatie a permis ca, în timp, sa se realizeze adaptari specifice ale microorganismelor la cele mai dificile conditii oferite de mediul ambiant.
Mediul actioneaza asupra microorganismelor prin asigurarea unui substrat nutrit 616c214g iv, temperatura, umiditate, pH, concentratie de oxigen favorabile, iar microorganismele actioneaza asupra mediului prin diferite transformari care au loc în procesul de nutritie. Astfel prin actiunea de degradare pe care o exercita microorganismele asupra mediului, pot avea loc urmatoarele transformari: reducerea consistentei, tulburarea, formarea de voal, scaderea concentratiei în extract, acidifierea, alcalinizarea.
3.1 CONDIŢIILE DE DESFĂsURARE A PROCESULUI DE NUTRIŢIE
Pentru asigurarea vietii celulelor microbiene, microorganismele folosesc din mediul natural substraturi nutritive sau alimente.
Prin aliment întelegem orice mediu asupra caruia microorganismele pot sa actioneze si care sa asigure energia si toate componentele necesare la biosinteza componentelor celulare.
Pentru a folosi aceste medii ca sursa de nutritie în celula microbiana, pe cale genetica si pe cale catabolica, se regleaza metabolismul celulei care îi permite adaptarea la conditiile de mediu. În acest sens celula microbiana poate sa sintetizeze enzime adaptive extracelulare care sa produca hidroliza substantelor nutritive si sa asigure transportul în celula al nutrientilor si transformarea acestora.
Conditiile pentru desfasurarea procesului de nutritie sunt urmatoarele:
în mediul nutritiv, celulele microbiene trebuie sa beneficieze de conditii compatibile cu viata;
În absenta apei celula nu va putea sa se hraneasca, apa fiind cea care solubilizeaza compusii din mediu, asigura transportul si transformarile în interiorul celulei.
totalitatea substantelor nutritive solubile în apa trebuie sa se afle într-o concentratie apropiata celei existente în citoplasma, deoarece daca mediul nutritiv este hipertonic se produce plasmoliza celulelor. De aceea mediile de cultura destinate cultivarii microorganismelor au o concentratie de 3 - 15 % substante nutritive solubilizate. Daca concentratia este foarte mica se produce turgescenta celulelor.
mediul trebuie sa fie caracterizat de un anumit pH, un anumit potential de oxido-reducere, favorabile cresterii si multiplicarii celulelor;
absenta din mediu a unor substante toxice sau sa nu existe posibilitatea ca prin transformarea substantelor nutritive din mediu sa se formeze substante toxice.
3.2 MODALITĂŢI DE TRANSPORT AL NUTRIENŢILOR
Ţinând cont de diversitatea surselor nutritive si de faptul ca, prin structura, peretele celular si membrana nu permit fizic decât patrunderea moleculelor mici, are loc prehidroliza în exteriorul celulei ca urmare a sintezei si eliberarii unor enzime extracelulare.
În urma hidrolizei compusilor macromoleculari va rezulta o cantitate mica de energie (1 %) pe care celula nu o poate folosi.
Astfel, diferitele polioze (amidon, celuloza, substante pectice, lipide) pot constitui sursa de energie sau alimente pentru microorganisme numai daca acestea sunt capabile sa produca enzime care sa le scindeze la compusi mai simpli.
Transferul nutrientilor în interiorul celulei are loc prin diferite modalitati:
Difuzia simpla (pasiva) reprezinta cel mai frecvent mod posibil de transfer pentru moleculele cu dimensiuni mici (0,4 - 0,6 nm): moleculele de apa, ioni, gaze, glicerol.
Difuzia are loc ca urmare a existentei unui gradient de concentratie între exteriorul si interiorul celulei si înceteaza când se produce izotonia.
Difuzie facilitata (cu proteine purtator) se realizeaza ca urmare a prezentei unor proteine receptor numite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau în spatiul periplasmic.
Difuzia facilitata se poate realiza fata de un gradient de concentratie, iar celula nu consuma energie pentru acest transfer. Permeaza recunoaste nutrientul necesar celulei, îl retine si prin procesul de translatie, rotatie îl aduce spre partea interioara a celulei. În final are loc disocierea nutrientului în interiorul celulei.
 |
Figura 3: Etapele difuziei facilitate
Microorganismele se întâlnesc în habitate în care continutul în nutrienti poate fi foarte redus, încât pentru crestere este important transportul si concentrarea lor în celula. În aceasta situatie transportul se face împotriva gradientului normal de concentratie, cu consum de energie, prin translocatie de grup si transport activ.
Translocatia de grup (difuzia fosforilata) este întâlnita mai ales la celulele de drojdie la care moleculele de zahar sunt transportate în celula sub forma de ester fosforic, ca urmare a faptului ca molecula de ATP trece în ADP. Energia eliberata permite formarea esterului fosforic care apoi este metabolizat.
Zp reprezinta esterul fosforic al zaharului respectiv.
 |
Figura 4: Etapele difuziei fosforilate
Enzimele care catalizeaza acest transfer sunt, în general, kinaze, iar celula consuma energie. Diferite enzime intervin apoi în regenerarea cantitatii de energie consumate. Procesul de folosire a diferitelor zaharuri în procesul de crestere este caracterizat si de o stereospecificitate, deoarece celula de drojdie poate sa produca fermentarea esterilor fosforici ai zaharurilor sub forma dextrogira.
Prin acest transport în celula se acumuleaza o cantitate mai mare de zahar decât în exteriorul celulei, aceasta fiind explicatia consumului de energie (existenta gradientului de concentratie).
Transportul activ sau cu membrana energizanta se realizeaza când celula are nevoie de o cantitate mai mare de substante nutritive decât concentratia lor în mediul extern, deci pentru a lucra împotriva gradientului de concentratie se presupune un efort din partea celulei, efort care consta în consum de energie.
Acest lucru se realizeaza datorita unei proteine transportor activata sau energizata (T*)care poate sa lege molecula de nutrient (N) din exteriorul celulei, sa o transfere prin membrana si sa o elibereze în interior unde urmeaza sa fie metabolizata.
Activarea proteinei transportor se realizeaza prin consum de energie cu ajutorul enzimelor de tipul permeazelor.
Figura 5: Transportul activ sau cu membrana energizanta
Energizarea membranei care permite patrunderea diferitilor nutrienti în celula poate sa se datoreze si gradientului electrochimic.
Endocitoza (pinocitoza) se întâlneste la microflora acvatica si consta în patrunderea nutrientului în interiorul celulei prin endocit. În acesta, molecula de nutrient este recunoscuta, au loc apoi plieri ale membranei care înglobeaza substanta nutritiva (faza de picatura suspendata), apoi picatura este eliberata în interiorul celulei.
3.3 TIPURI DE NUTRIŢIE
Nutritia hidrocarbonata este nutritia de baza care asigura energia necesara proceselor de biosinteza, prin care microorganismele îsi procura carbonul, bioelement vital care intra în componenta tuturor substantelor organice.
În functie de modul de procurare al carbonului, microorganismele fac parte din urmatoarele clase:
- microorganisme litotrofe care sunt si fotosintetizante (poseda pigmenti care le permit utilizarea energiei solare), preiau carbonul din CO2 sau din CO3 2-, HCO3- , fac parte din microflora solului, a apei si au rol important în circuitul carbonului în natura.
- microorganisme organotrofe care folosesc materia organica ca sursa de carbon; multe dintre ele (dependente de materia organica ) pot sa preia carbonul si din saruri carbonate (prin aceasta sunt si heterotrofe). S-au produs adaptari specifice astfel încât în grupa organotrofelor putem întâlni grupele:
- Saproorganisme (microorganisme saprofite), pot sa foloseasca materie organica moarta si în acest grup întâlnim: bacteriile de putrefactie (produc degradarea materiei organice nevii de origine animala - carne, oua, brânzeturi) si mucegaiurile (agenti de putrezire) care produc degradarea materiei organice nevii de origine vegetala;
- Microorganisme comensale - microorganismele care convietuiesc cu diferite organisme vii de origine vegetala sau animala hranindu-se cu produsi rezultati din activitatea plantelor sau animalelor;
Exemple: microorganismele din microflora pielii, din microflora epifita a plantelor.
- Microorganisme patogene - microorganismele care se pot dezvolta pe materia organica vie si exista subtipurile acestei clase: microorganisme patogene si facultativ patogene.
Sursele de carbon preferate de microorganismele cu importanta industriala sunt urmatoarele:
Hexozele (glucoza, galactoza) sunt asimilate de toate microorganismele. Celulele de drojdie metabolizeaza hexozele sub forma de esteri fosforici, prin respiratie celulara sunt transformate în CO2 si H2O, iar prin metabolizare partiala rezulta alcooli si acizi.
Dizaharidele sunt metabolizate de microorganismele care elaboreaza enzime extracelulare capabile sa le hidrolizeze în hexoze componente.
 |
3) Ca surse hidrocarbonate microorganismele mai folosesc trizaharide (rafinoza) sau polioze.
4) Poliozele sunt surse importante de carbon dar nu pot fi asimilate decât dupa o hidroliza în prealabil. Amidonul este hidrolizat sub actiunea enzimelor aminolitice elaborate de bacterii, mucegaiuri si unele specii de drojdie.
 |
Glucoamilaza este produsa de drojdia Endomycopsis fibuligera si de mucegaiurile Aspergillus niger, A. avamorii, A. phoenicis.
Drojdiile de pâine si alte specii ale genului Saccharomyces nu produc amilaze, neputând sa foloseasca amidonul ca sursa de carbon ci doar maltoza, glucoza si dextrine cu molecule mici.
Celuloza reprezinta 40% din materialul vegetal al pamântului si poate fi hidrolizata de endoglucanaze si exoglucanaze pâna la celodextrine, celobioza si glucoza.
Microorganismele care produc celulaze sunt bacterii din genurile Bacillus cellulomonas, B. cellvibrio si marea majoritate a mucegaiurilor: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium.
Drojdiile, microorganisme cu mare importanta în industria fermentativa, necesita în mediile lor de cultivare zaharuri simple (hexoze si dizaharide) în concentratii de 3-15 %.
Drojdiile îsi pot procura energia necesara astfel:
pe cale aeroba, prin respiratie:
 |
- pe cale anaeroba, prin fermentatie:
 |
Daca dorim sa obtinem biomasa în cantitate mare sunt create conditii favorabile respiratiei, iar daca dorim sa obtinem ca produs principal alcool etilic în cantitate mare, prin parametrii procesului tehnologic vom crea conditii de anaerobioza.
Nutritia azotata ajuta microorganismele sa-si procure azotul din diferite surse. Diversitatea acestor surse clasifica microorganismele în:
- microorganisme prototrofe care pot sa foloseasca azotul din combinatiile anorganice NO2- si NO3- (bacterii nitrificatoare din genurile Nitrobacter, Nitrozomonas) sau azotul din aer (bacteriile din genul Azotobacter); sunt independente de materia organica si nu necesita factori de crestere.
- microorganisme metatrofe - sunt cele mai raspândite, pot sa îsi procure azotul si din materia organica nevie (proteine).
Endo si exoproteazele sunt elaborate de mucegaiuri din genurile Aspergillus, Cladosporium, Penicillium. Peptidazele sunt elaborate de bacterii de putrefactie din genurile Bacillus, Clostridium, Pseudomonas. Drojdiile nu produc proteaze extracelulare.
Celula vie contine proteaze intracelulare localizate în lizozomi, iar în conditiile în care celula moare pe cale naturala se produce eliberarea proteazelor si are loc autoliza.
Drojdiile necesita ca sursa de azot:
aminoacizi care sunt foarte usor asimilabili, prin difuzie simpla; doar prolina este mai lent asimilata.
peptide si chiar proteine cu molecula mica; (peptone ca sursa de C si N);
sulfatul de amoniu SO4(NH4)2; ureea.
În mediile de cultura ale drojdiilor se poate adauga fie sulfatul de amoniu, fie uree 1-2 % si se poate calcula cantitatea de azot necesara stiind ca acesta reprezinta 10 % din substanta uscata de drojdie. Musturile naturale contin azot natural. Mediile industriale contin fainuri proteice (faina de soia, de peste, sau extract).
Drojdia nu poate folosi NO3- ca sursa de azot, iar NO2-, în doze mai mari de 200 mg/100 ml mediu, inhiba dezvoltarea si înmultirea drojdiilor.
Mucegaiurile, în afara de proteine vegetale sau animale, pot sa foloseasca azot anorganic (KNO3).
Nutritia minerala asigura microorganismelor atât elemente universale cât si elemente minore care intra în structura componentilor celulari.
Din mediul de cultura, pentru procurarea fosforului, microorganismele prefera ortofosfatii si fosfatii monobazici si dibazici ai diferitelor elemente.
Ca sursa minerala preferata de microorganisme mentionam: fosfatii de potasiu, care reprezinta sursa dubla de fosfor si potasiu, KH2PO4, K2HPO4 .
Cuprul, magneziul, fierul si alte elemente cu rol functional se adauga în mediul de cultura al microorganismelor sub forma de sulfati, care sunt sarurile cele mai accesibile.
Diferitele saruri minerale sunt necesare în concentratii foarte mici, uneori suficiente în apa.
Hidrogenul intra în componenta tuturor compusilor organici. Microorganismele îl preiau din compusii organici sau din apa.
Pentru a se dezvolta în conditii optime, microorganismele necesita în mediul lor de cultivare o anumita concentratie a ionilor de hidrogen.
PH-ul mediilor de cultura poate sa varieze în limite foarte largi: 1-12.
În acest domeniu de pH exista adaptari specifice:
Bacteriile prefera pH=6-8 (apropiat de neutru)
Bacteriile de putrefactie necesita mediu cu pH=7.
Mucegaiurile se dezvolta în medii al caror pH=2-10. Majoritatea prefera domeniul usor acid (pH=4,5-7,5).
Drojdiile se dezvolta în medii cu pH = 4,5-6 (spre domeniul acid).
Bacteriile acidotolerante prefera un pH acid (bacteriile lactice, bacteriile acetice).
În afara domeniului de pH optim, microorganismele se pot adapta producând enzime de tipul decarboxilazelor sau aminazelor (se elibereaza grupari bazice sau acide) astfel încât pot sa tamponeze pH-ul mediului.
Daca pH-ul este în afara limitei de dezvoltare au loc modificari ale gradientului electrochimic si se produc dereglari ireversibile la nivelul membranei.
Celula pierde din compusii celulari, iar activitatea acesteia este inhibata.
Oxigenul intra în structura substantelor organice si anorganice ale celulei si este preluat din componentele mediului (H2O, CO2, zaharuri, aminoacizi, acizi, etc). În afara de oxigenul legat în compusii mediului ambiant unele microorganisme necesita oxigen liber. Aceasta necesitate a aparut în cursul evolutiei.
În functie de necesarul de oxigen , microorganismele pot fi:
strict aerobe - necesita oxigenul pe care îl iau din aer, deoarece ele îsi procura energia prin respiratie iar oxigenul reprezinta acceptorul de hidrogen, cu formare de H2O.
Bacteriile strict aerobe actioneaza în medii cu potential redox optim rH = = 18-28 mV (bacteriile acetice din genurile Pseudomonas, Bacillus subtilis).
Mucegaiurile sunt microorganisme aerobe, se dezvolta la suprafata, la interfata cu aerul.
anaerobe - ne se pot dezvolta în prezenta oxigenului molecular. Aceste microorganisme sunt lipsite de catalaza, astfel încât oxigenul din aer, prin reducere, formeaza apa oxigenata care se acumuleaza si devine toxica pentru celula. Potentialul redox caracteristic mediilor de dezvoltare este rH = 0-12 mV. Bacterii anaerobe sunt bacteriile genurilor: Clostridium, Bacillus.
facultativ anaerobe - au grad de adaptabilitate mai mare, pot sa creasca cu sau fara oxigen. Potentialul redox caracteristic mediilor este rH = 12-18 mV.
Din aceasta categorie fac parte:
a) microorganisme aerotolerante care se pot dezvolta în prezenta aerului dar nu folosesc oxigenul din aer: drojdii fermentative, bacterii lactice care se pot dezvolta pe medii de suprafata (în prezenta aerului) dar nu folosesc oxigenul.
b) microorganisme microaerofile care folosesc cantitati foarte mici de oxigen din aer. Astfel în timp ce în aer presiunea oxigenului este de 0,2 barr, ele necesita 0,02, adica de 10 ori mai putin.
Cunoasterea comportarii microorganismelor fata de oxigen permite dirijarea cultivarii acestora. Când dorim sa cultivam microorganisme aerobe se poate face cultivarea prin metode statice sau stationare dar stratul de mediu trebuie sa fie foarte redus astfel încât oxigenul din aer sa se dizolve în stratul de mediu .
În situatiile în care dorim sa obtinem cantitati mari de celule se recurge la cultivari în medii lichide cu volume mari, dar se face barbotarea cu aer steril pentru a furniza cantitatea de oxigen necesara cresterii si multiplicarii.
Pentru cultivarea bacteriilor strict anaerobe se folosesc urmatoarele metode:
- cultivarea în anaerostat (aparat în care nu este permis accesul aerului) si în placi Petri, pastrate în gaz inert. Exista anaerostat simplificat care poate capta oxigenul, legându-l cu un element chimic.
- cultivarea în medii solide, în eprubete cu înaltime mare, astfel încât în zona în care oxigenul se poate dizolva, microorganismele sa nu existe.
- metoda chimica consta în introducerea în mediul de cultura a unor substante puternic reducatoare (tioglicolat de sodiu) care scad potentialul de oxidoreducere la valori între 0-12 mV, domeniu în care se dezvolta microorganismele anaerobe.
Factorii de crestere sunt substante care, prezente în mediu în concentratii mici, stimuleaza cresterea si dezvoltarea microorganismelor.
Factori de crestere pot fi aminoacizi necesari în concentratii de 10-4 M. Exista o mare variabilitate în necesarul de aminoacizi în numar maxim de 18; purine si pirimidine necesare în mediu în concentratie 10-5 M si care intra în structura acizilor nucleici stimulând biosinteza compusilor celulari; vitamine, necesare în concentratie 10-5 - 10-6 M reprezentând cofactori (intra în structura unor enzime cu rol de coenzime).
Microorganismele dependente de acesti factori de crestere se numesc microorganisme auxotrofe (Streptococcus necesita ca factori de crestere acid folic, nicotina, vitamine; drojdiile necesita aminoacizi, vitamine, biotina).
Microorganismele paratrofe nu depind de factori de crestere (mucegaiuri).
Mediul de cultura reprezinta mediul nutritiv complex pentru microorganisme care asigura apa, sursa hidrocarbonata, azotata, minerala si factori de crestere aflate într-o stare asimilabila pentru celulele ce urmeaza a fi cultivate.
Concentratia substantelor asimilabile trebuie sa fie de 3 - 10 % pentru a nu influenta negativ schimburile osmotice ale celulelor cu mediul ambiant. Mediul de cultura trebuie sa aiba un anumit pH, rH si o anumita vâscozitate la valorile necesare microorganismelor care urmeaza sa fie cultivate.
Mediul de cultura, înainte de a fi folosit, trebuie sa fie supus sterilizarii.
Mediul steril reprezinta mediul lipsit de organisme vii. Sterilizarea se poate face pe cale termica, când într-un anumit regim de timp si temperatura are loc denaturarea proteinelor din citoplasma si inactivarea celulelor microbiene.
Mediile de cultura, care au în componenta substante termolabile (vitamine), sunt sterilizate prin filtrare. În acest scop se folosesc filtre cu dimensiunea porilor mai mica decât a celulelor pe care dorim sa le eliminam. Prin filtrare se obtine un mediu lichid steril.
Mediul steril reprezinta mediul lipsit de organisme vii. Sterilizarea se poate face pe cale termica, când într-un anumit regim de timp si temperatura are loc denaturarea proteinelor din citoplasma si inactivarea celulelor microbiene.
Mediile de cultura care au în componenta substante termolabile (vitamine) sunt sterilizate prin filtrare. În acest scop se folosesc filtre cu dimensiunea porilor mai mica decât a celulelor pe care dorim sa le eliminam. Prin filtrare se obtine un mediu lichid steril.
Datorita diversitatii necesitatilor nutritive ale microorganismelor mediile de cultura trebuie sa fie foarte variate în compozitie. În lume se cunosc firme care fabrica pe cale industriala medii de cultura (Difco, Sartorius, Novo, Sigma). Anual ele publica un catalog de medii de cultura pe care le poate obtine.
Mediile de cultura au o mare importanta practica deoarece sunt destinate cultivarii microorganismelor, selectionarii lor din medii naturale si întretinerii culturilor selectionate. Acestea mai pot fi folosite pentru identificarea microorganismelor si studiul caracterelor lor fiziologice si morfologice. În practica se folosesc medii selective si medii generale pentru controlul microbiologic al alimentelor. În functie de natura mediilor de cultura se pot detecta în microflora alimentelor diferite grupe de microorganisme.
În tehnica de laborator se utilizeaza si mediile fermentative, cu destinatie industriala (folosite în cantitati mari în scopul cultivarii industriale a microorganismelor) fie pentru obtinerea biomasei de celule - drojdii comprimate sau pentru obtinerea unor produse de biosinteza rezultate în urma actiunii microorganismelor asupra componentelor din mediu.
În functie de destinatie, mediile de cultura pot fi:
Medii de cultura generale care au o compozitie diversificata, sunt bogate în substante nutritive, permit dezvoltarea unui grup mare de microorganisme.
Mustul de malt este un exemplu de mediu de cultura general, obtinut din malt dupa aceeasi tehnologie care se foloseste la fabricarea berii. Sub forma lichida sau solidificat cu agar (MMA), cu pH acid, este mediu general pentru cultura drojdiilor si mucegaiurilor.
Bulionul de carne cu agar (BCA), cu pH neutru este mediul bogat în surse de azot si favorizeaza dezvoltarea bacteriilor.
Mediul TEGA este folosit pentru punerea în evidenta a bacteriilor din produsele alimentare prin metoda standard. Acest mediu contine triptona, extract de drojdie, glucoza si agar.
Mediile de cultura selective prezinta o compozitie specifica care este favorizanta doar pentru un grup restrâns de microorganisme sau chiar pentru dezvoltarea unei specii.
|
