CAPITOLUL III
NUTRIŢIA MICROORGANISMELOR
Nutritia este un proces fiziologic complex, prin care microorganismele īsi procura energia si toate elementele necesare cresterii, reproducerii si īntretinerii functiilor vitale.
Procesul de nutritie se realizeaza īn cadrul metabolismului celular care cuprinde doua laturi esentiale:
- reactiile de catabolism care constau īn degradarea secventiala a compusilor macromoleculari prin actiunea catalitica a enzimelor. Degradarea consta īn formare de compusi cu molecule mici si se face secvential pe cai biochimice, prin care se elibereaza cuantificat energia potentiala cuprinsa īn produsul catabolizat. Aceste reactii au caracter exergonic.
- reactiile de anabolism se desfasoara concomitent cu reactiile de catabolism si constau īn reactii de biosinteza catalizate enzimatic prin care celula vie, folosind compusi cu molecule mici si o cantitate de energie, cladeste compusi macromoleculari, care intra īn structura celulei cu rol functional sau de rezerva. Totalitatea reactiilor de anabolism contribuie la cresterea īn dimensiune si la reproducerea celulelor si au caracter endergonic.
Pentru asigurarea procesului de nutritie celula microbiana necesita diferiti nutrienti care trebuie sa prezinte anumite dimensiuni care sa le permita trecerea prin peretele celular si membrana citoplasmatica. Apoi sunt transformati īn celula si are loc formarea compusilor celulari.
Īn cazul reactiilor de catabolism, compusii macromoleculari sunt continuti de substratul care constituie nutrient pentru celula vie, iar īn cel al reactiilor de anabolism compusii macromoleculari se regasesc īn componentii celulari esentiali pentru crestere, reproducere si īntretinerea functiilor vitale. Compusii cu molecule mici care nu mai sunt necesari se elimina sub forma produsilor de catabolism.
Īn procesul de nutritie se stabileste o interdependenta īntre microorganisme si mediu. Īn aceasta unitate dialectica mediul are rolul activ iar microorganismele se adapteaza la conditiile de mediu actionānd si transformānd mediul. Aceasta interrelatie a permis ca, īn timp, sa se realizeze adaptari specifice ale microorganismelor la cele mai dificile conditii oferite de mediul ambiant.
Mediul actioneaza asupra microorganismelor prin asigurarea unui substrat nutrit 616c214g iv, temperatura, umiditate, pH, concentratie de oxigen favorabile, iar microorganismele actioneaza asupra mediului prin diferite transformari care au loc īn procesul de nutritie. Astfel prin actiunea de degradare pe care o exercita microorganismele asupra mediului, pot avea loc urmatoarele transformari: reducerea consistentei, tulburarea, formarea de voal, scaderea concentratiei īn extract, acidifierea, alcalinizarea.
3.1 CONDIŢIILE DE DESFĂsURARE A PROCESULUI DE NUTRIŢIE
Pentru asigurarea vietii celulelor microbiene, microorganismele folosesc din mediul natural substraturi nutritive sau alimente.
Prin aliment īntelegem orice mediu asupra caruia microorganismele pot sa actioneze si care sa asigure energia si toate componentele necesare la biosinteza componentelor celulare.
Pentru a folosi aceste medii ca sursa de nutritie īn celula microbiana, pe cale genetica si pe cale catabolica, se regleaza metabolismul celulei care īi permite adaptarea la conditiile de mediu. Īn acest sens celula microbiana poate sa sintetizeze enzime adaptive extracelulare care sa produca hidroliza substantelor nutritive si sa asigure transportul īn celula al nutrientilor si transformarea acestora.
Conditiile pentru desfasurarea procesului de nutritie sunt urmatoarele:
īn mediul nutritiv, celulele microbiene trebuie sa beneficieze de conditii compatibile cu viata;
Īn absenta apei celula nu va putea sa se hraneasca, apa fiind cea care solubilizeaza compusii din mediu, asigura transportul si transformarile īn interiorul celulei.
totalitatea substantelor nutritive solubile īn apa trebuie sa se afle īntr-o concentratie apropiata celei existente īn citoplasma, deoarece daca mediul nutritiv este hipertonic se produce plasmoliza celulelor. De aceea mediile de cultura destinate cultivarii microorganismelor au o concentratie de 3 - 15 % substante nutritive solubilizate. Daca concentratia este foarte mica se produce turgescenta celulelor.
mediul trebuie sa fie caracterizat de un anumit pH, un anumit potential de oxido-reducere, favorabile cresterii si multiplicarii celulelor;
absenta din mediu a unor substante toxice sau sa nu existe posibilitatea ca prin transformarea substantelor nutritive din mediu sa se formeze substante toxice.
3.2 MODALITĂŢI DE TRANSPORT AL NUTRIENŢILOR
Ţinānd cont de diversitatea surselor nutritive si de faptul ca, prin structura, peretele celular si membrana nu permit fizic decāt patrunderea moleculelor mici, are loc prehidroliza īn exteriorul celulei ca urmare a sintezei si eliberarii unor enzime extracelulare.
Īn urma hidrolizei compusilor macromoleculari va rezulta o cantitate mica de energie (1 %) pe care celula nu o poate folosi.
Astfel, diferitele polioze (amidon, celuloza, substante pectice, lipide) pot constitui sursa de energie sau alimente pentru microorganisme numai daca acestea sunt capabile sa produca enzime care sa le scindeze la compusi mai simpli.
Transferul nutrientilor īn interiorul celulei are loc prin diferite modalitati:
Difuzia simpla (pasiva) reprezinta cel mai frecvent mod posibil de transfer pentru moleculele cu dimensiuni mici (0,4 - 0,6 nm): moleculele de apa, ioni, gaze, glicerol.
Difuzia are loc ca urmare a existentei unui gradient de concentratie īntre exteriorul si interiorul celulei si īnceteaza cānd se produce izotonia.
Difuzie facilitata (cu proteine purtator) se realizeaza ca urmare a prezentei unor proteine receptor numite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau īn spatiul periplasmic.
Difuzia facilitata se poate realiza fata de un gradient de concentratie, iar celula nu consuma energie pentru acest transfer. Permeaza recunoaste nutrientul necesar celulei, īl retine si prin procesul de translatie, rotatie īl aduce spre partea interioara a celulei. Īn final are loc disocierea nutrientului īn interiorul celulei.
Figura 3: Etapele difuziei facilitate
Microorganismele se īntālnesc īn habitate īn care continutul īn nutrienti poate fi foarte redus, īncāt pentru crestere este important transportul si concentrarea lor īn celula. Īn aceasta situatie transportul se face īmpotriva gradientului normal de concentratie, cu consum de energie, prin translocatie de grup si transport activ.
Translocatia de grup (difuzia fosforilata) este īntālnita mai ales la celulele de drojdie la care moleculele de zahar sunt transportate īn celula sub forma de ester fosforic, ca urmare a faptului ca molecula de ATP trece īn ADP. Energia eliberata permite formarea esterului fosforic care apoi este metabolizat.
Zp reprezinta esterul fosforic al zaharului respectiv.
Figura 4: Etapele difuziei fosforilate
Enzimele care catalizeaza acest transfer sunt, īn general, kinaze, iar celula consuma energie. Diferite enzime intervin apoi īn regenerarea cantitatii de energie consumate. Procesul de folosire a diferitelor zaharuri īn procesul de crestere este caracterizat si de o stereospecificitate, deoarece celula de drojdie poate sa produca fermentarea esterilor fosforici ai zaharurilor sub forma dextrogira.
Prin acest transport īn celula se acumuleaza o cantitate mai mare de zahar decāt īn exteriorul celulei, aceasta fiind explicatia consumului de energie (existenta gradientului de concentratie).
Transportul activ sau cu membrana energizanta se realizeaza cānd celula are nevoie de o cantitate mai mare de substante nutritive decāt concentratia lor īn mediul extern, deci pentru a lucra īmpotriva gradientului de concentratie se presupune un efort din partea celulei, efort care consta īn consum de energie.
Acest lucru se realizeaza datorita unei proteine transportor activata sau energizata (T*)care poate sa lege molecula de nutrient (N) din exteriorul celulei, sa o transfere prin membrana si sa o elibereze īn interior unde urmeaza sa fie metabolizata.
Activarea proteinei transportor se realizeaza prin consum de energie cu ajutorul enzimelor de tipul permeazelor.
Figura 5: Transportul activ sau cu membrana energizanta
Energizarea membranei care permite patrunderea diferitilor nutrienti īn celula poate sa se datoreze si gradientului electrochimic.
Endocitoza (pinocitoza) se īntālneste la microflora acvatica si consta īn patrunderea nutrientului īn interiorul celulei prin endocit. Īn acesta, molecula de nutrient este recunoscuta, au loc apoi plieri ale membranei care īnglobeaza substanta nutritiva (faza de picatura suspendata), apoi picatura este eliberata īn interiorul celulei.
3.3 TIPURI DE NUTRIŢIE
Nutritia hidrocarbonata este nutritia de baza care asigura energia necesara proceselor de biosinteza, prin care microorganismele īsi procura carbonul, bioelement vital care intra īn componenta tuturor substantelor organice.
Īn functie de modul de procurare al carbonului, microorganismele fac parte din urmatoarele clase:
- microorganisme litotrofe care sunt si fotosintetizante (poseda pigmenti care le permit utilizarea energiei solare), preiau carbonul din CO2 sau din CO3 2-, HCO3- , fac parte din microflora solului, a apei si au rol important īn circuitul carbonului īn natura.
- microorganisme organotrofe care folosesc materia organica ca sursa de carbon; multe dintre ele (dependente de materia organica ) pot sa preia carbonul si din saruri carbonate (prin aceasta sunt si heterotrofe). S-au produs adaptari specifice astfel īncāt īn grupa organotrofelor putem īntālni grupele:
- Saproorganisme (microorganisme saprofite), pot sa foloseasca materie organica moarta si īn acest grup īntālnim: bacteriile de putrefactie (produc degradarea materiei organice nevii de origine animala - carne, oua, brānzeturi) si mucegaiurile (agenti de putrezire) care produc degradarea materiei organice nevii de origine vegetala;
- Microorganisme comensale - microorganismele care convietuiesc cu diferite organisme vii de origine vegetala sau animala hranindu-se cu produsi rezultati din activitatea plantelor sau animalelor;
Exemple: microorganismele din microflora pielii, din microflora epifita a plantelor.
- Microorganisme patogene - microorganismele care se pot dezvolta pe materia organica vie si exista subtipurile acestei clase: microorganisme patogene si facultativ patogene.
Sursele de carbon preferate de microorganismele cu importanta industriala sunt urmatoarele:
Hexozele (glucoza, galactoza) sunt asimilate de toate microorganismele. Celulele de drojdie metabolizeaza hexozele sub forma de esteri fosforici, prin respiratie celulara sunt transformate īn CO2 si H2O, iar prin metabolizare partiala rezulta alcooli si acizi.
Dizaharidele sunt metabolizate de microorganismele care elaboreaza enzime extracelulare capabile sa le hidrolizeze īn hexoze componente.
3) Ca surse hidrocarbonate microorganismele mai folosesc trizaharide (rafinoza) sau polioze.
4) Poliozele sunt surse importante de carbon dar nu pot fi asimilate decāt dupa o hidroliza īn prealabil. Amidonul este hidrolizat sub actiunea enzimelor aminolitice elaborate de bacterii, mucegaiuri si unele specii de drojdie.
Glucoamilaza este produsa de drojdia Endomycopsis fibuligera si de mucegaiurile Aspergillus niger, A. avamorii, A. phoenicis.
Drojdiile de pāine si alte specii ale genului Saccharomyces nu produc amilaze, neputānd sa foloseasca amidonul ca sursa de carbon ci doar maltoza, glucoza si dextrine cu molecule mici.
Celuloza reprezinta 40% din materialul vegetal al pamāntului si poate fi hidrolizata de endoglucanaze si exoglucanaze pāna la celodextrine, celobioza si glucoza.
Microorganismele care produc celulaze sunt bacterii din genurile Bacillus cellulomonas, B. cellvibrio si marea majoritate a mucegaiurilor: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium.
Drojdiile, microorganisme cu mare importanta īn industria fermentativa, necesita īn mediile lor de cultivare zaharuri simple (hexoze si dizaharide) īn concentratii de 3-15 %.
Drojdiile īsi pot procura energia necesara astfel:
pe cale aeroba, prin respiratie:
- pe cale anaeroba, prin fermentatie:
Daca dorim sa obtinem biomasa īn cantitate mare sunt create conditii favorabile respiratiei, iar daca dorim sa obtinem ca produs principal alcool etilic īn cantitate mare, prin parametrii procesului tehnologic vom crea conditii de anaerobioza.
Nutritia azotata ajuta microorganismele sa-si procure azotul din diferite surse. Diversitatea acestor surse clasifica microorganismele īn:
- microorganisme prototrofe care pot sa foloseasca azotul din combinatiile anorganice NO2- si NO3- (bacterii nitrificatoare din genurile Nitrobacter, Nitrozomonas) sau azotul din aer (bacteriile din genul Azotobacter); sunt independente de materia organica si nu necesita factori de crestere.
- microorganisme metatrofe - sunt cele mai raspāndite, pot sa īsi procure azotul si din materia organica nevie (proteine).
Endo si exoproteazele sunt elaborate de mucegaiuri din genurile Aspergillus, Cladosporium, Penicillium. Peptidazele sunt elaborate de bacterii de putrefactie din genurile Bacillus, Clostridium, Pseudomonas. Drojdiile nu produc proteaze extracelulare.
Celula vie contine proteaze intracelulare localizate īn lizozomi, iar īn conditiile īn care celula moare pe cale naturala se produce eliberarea proteazelor si are loc autoliza.
Drojdiile necesita ca sursa de azot:
aminoacizi care sunt foarte usor asimilabili, prin difuzie simpla; doar prolina este mai lent asimilata.
peptide si chiar proteine cu molecula mica; (peptone ca sursa de C si N);
sulfatul de amoniu SO4(NH4)2; ureea.
Īn mediile de cultura ale drojdiilor se poate adauga fie sulfatul de amoniu, fie uree 1-2 % si se poate calcula cantitatea de azot necesara stiind ca acesta reprezinta 10 % din substanta uscata de drojdie. Musturile naturale contin azot natural. Mediile industriale contin fainuri proteice (faina de soia, de peste, sau extract).
Drojdia nu poate folosi NO3- ca sursa de azot, iar NO2-, īn doze mai mari de 200 mg/100 ml mediu, inhiba dezvoltarea si īnmultirea drojdiilor.
Mucegaiurile, īn afara de proteine vegetale sau animale, pot sa foloseasca azot anorganic (KNO3).
Nutritia minerala asigura microorganismelor atāt elemente universale cāt si elemente minore care intra īn structura componentilor celulari.
Din mediul de cultura, pentru procurarea fosforului, microorganismele prefera ortofosfatii si fosfatii monobazici si dibazici ai diferitelor elemente.
Ca sursa minerala preferata de microorganisme mentionam: fosfatii de potasiu, care reprezinta sursa dubla de fosfor si potasiu, KH2PO4, K2HPO4 .
Cuprul, magneziul, fierul si alte elemente cu rol functional se adauga īn mediul de cultura al microorganismelor sub forma de sulfati, care sunt sarurile cele mai accesibile.
Diferitele saruri minerale sunt necesare īn concentratii foarte mici, uneori suficiente īn apa.
Hidrogenul intra īn componenta tuturor compusilor organici. Microorganismele īl preiau din compusii organici sau din apa.
Pentru a se dezvolta īn conditii optime, microorganismele necesita īn mediul lor de cultivare o anumita concentratie a ionilor de hidrogen.
PH-ul mediilor de cultura poate sa varieze īn limite foarte largi: 1-12.
Īn acest domeniu de pH exista adaptari specifice:
Bacteriile prefera pH=6-8 (apropiat de neutru)
Bacteriile de putrefactie necesita mediu cu pH=7.
Mucegaiurile se dezvolta īn medii al caror pH=2-10. Majoritatea prefera domeniul usor acid (pH=4,5-7,5).
Drojdiile se dezvolta īn medii cu pH = 4,5-6 (spre domeniul acid).
Bacteriile acidotolerante prefera un pH acid (bacteriile lactice, bacteriile acetice).
Īn afara domeniului de pH optim, microorganismele se pot adapta producānd enzime de tipul decarboxilazelor sau aminazelor (se elibereaza grupari bazice sau acide) astfel īncāt pot sa tamponeze pH-ul mediului.
Daca pH-ul este īn afara limitei de dezvoltare au loc modificari ale gradientului electrochimic si se produc dereglari ireversibile la nivelul membranei.
Celula pierde din compusii celulari, iar activitatea acesteia este inhibata.
Oxigenul intra īn structura substantelor organice si anorganice ale celulei si este preluat din componentele mediului (H2O, CO2, zaharuri, aminoacizi, acizi, etc). Īn afara de oxigenul legat īn compusii mediului ambiant unele microorganisme necesita oxigen liber. Aceasta necesitate a aparut īn cursul evolutiei.
Īn functie de necesarul de oxigen , microorganismele pot fi:
strict aerobe - necesita oxigenul pe care īl iau din aer, deoarece ele īsi procura energia prin respiratie iar oxigenul reprezinta acceptorul de hidrogen, cu formare de H2O.
Bacteriile strict aerobe actioneaza īn medii cu potential redox optim rH = = 18-28 mV (bacteriile acetice din genurile Pseudomonas, Bacillus subtilis).
Mucegaiurile sunt microorganisme aerobe, se dezvolta la suprafata, la interfata cu aerul.
anaerobe - ne se pot dezvolta īn prezenta oxigenului molecular. Aceste microorganisme sunt lipsite de catalaza, astfel īncāt oxigenul din aer, prin reducere, formeaza apa oxigenata care se acumuleaza si devine toxica pentru celula. Potentialul redox caracteristic mediilor de dezvoltare este rH = 0-12 mV. Bacterii anaerobe sunt bacteriile genurilor: Clostridium, Bacillus.
facultativ anaerobe - au grad de adaptabilitate mai mare, pot sa creasca cu sau fara oxigen. Potentialul redox caracteristic mediilor este rH = 12-18 mV.
Din aceasta categorie fac parte:
a) microorganisme aerotolerante care se pot dezvolta īn prezenta aerului dar nu folosesc oxigenul din aer: drojdii fermentative, bacterii lactice care se pot dezvolta pe medii de suprafata (īn prezenta aerului) dar nu folosesc oxigenul.
b) microorganisme microaerofile care folosesc cantitati foarte mici de oxigen din aer. Astfel īn timp ce īn aer presiunea oxigenului este de 0,2 barr, ele necesita 0,02, adica de 10 ori mai putin.
Cunoasterea comportarii microorganismelor fata de oxigen permite dirijarea cultivarii acestora. Cānd dorim sa cultivam microorganisme aerobe se poate face cultivarea prin metode statice sau stationare dar stratul de mediu trebuie sa fie foarte redus astfel īncāt oxigenul din aer sa se dizolve īn stratul de mediu .
Īn situatiile īn care dorim sa obtinem cantitati mari de celule se recurge la cultivari īn medii lichide cu volume mari, dar se face barbotarea cu aer steril pentru a furniza cantitatea de oxigen necesara cresterii si multiplicarii.
Pentru cultivarea bacteriilor strict anaerobe se folosesc urmatoarele metode:
- cultivarea īn anaerostat (aparat īn care nu este permis accesul aerului) si īn placi Petri, pastrate īn gaz inert. Exista anaerostat simplificat care poate capta oxigenul, legāndu-l cu un element chimic.
- cultivarea īn medii solide, īn eprubete cu īnaltime mare, astfel īncāt īn zona īn care oxigenul se poate dizolva, microorganismele sa nu existe.
- metoda chimica consta īn introducerea īn mediul de cultura a unor substante puternic reducatoare (tioglicolat de sodiu) care scad potentialul de oxidoreducere la valori īntre 0-12 mV, domeniu īn care se dezvolta microorganismele anaerobe.
Factorii de crestere sunt substante care, prezente īn mediu īn concentratii mici, stimuleaza cresterea si dezvoltarea microorganismelor.
Factori de crestere pot fi aminoacizi necesari īn concentratii de 10-4 M. Exista o mare variabilitate īn necesarul de aminoacizi īn numar maxim de 18; purine si pirimidine necesare īn mediu īn concentratie 10-5 M si care intra īn structura acizilor nucleici stimulānd biosinteza compusilor celulari; vitamine, necesare īn concentratie 10-5 - 10-6 M reprezentānd cofactori (intra īn structura unor enzime cu rol de coenzime).
Microorganismele dependente de acesti factori de crestere se numesc microorganisme auxotrofe (Streptococcus necesita ca factori de crestere acid folic, nicotina, vitamine; drojdiile necesita aminoacizi, vitamine, biotina).
Microorganismele paratrofe nu depind de factori de crestere (mucegaiuri).
Mediul de cultura reprezinta mediul nutritiv complex pentru microorganisme care asigura apa, sursa hidrocarbonata, azotata, minerala si factori de crestere aflate īntr-o stare asimilabila pentru celulele ce urmeaza a fi cultivate.
Concentratia substantelor asimilabile trebuie sa fie de 3 - 10 % pentru a nu influenta negativ schimburile osmotice ale celulelor cu mediul ambiant. Mediul de cultura trebuie sa aiba un anumit pH, rH si o anumita vāscozitate la valorile necesare microorganismelor care urmeaza sa fie cultivate.
Mediul de cultura, īnainte de a fi folosit, trebuie sa fie supus sterilizarii.
Mediul steril reprezinta mediul lipsit de organisme vii. Sterilizarea se poate face pe cale termica, cānd īntr-un anumit regim de timp si temperatura are loc denaturarea proteinelor din citoplasma si inactivarea celulelor microbiene.
Mediile de cultura, care au īn componenta substante termolabile (vitamine), sunt sterilizate prin filtrare. Īn acest scop se folosesc filtre cu dimensiunea porilor mai mica decāt a celulelor pe care dorim sa le eliminam. Prin filtrare se obtine un mediu lichid steril.
Mediul steril reprezinta mediul lipsit de organisme vii. Sterilizarea se poate face pe cale termica, cānd īntr-un anumit regim de timp si temperatura are loc denaturarea proteinelor din citoplasma si inactivarea celulelor microbiene.
Mediile de cultura care au īn componenta substante termolabile (vitamine) sunt sterilizate prin filtrare. Īn acest scop se folosesc filtre cu dimensiunea porilor mai mica decāt a celulelor pe care dorim sa le eliminam. Prin filtrare se obtine un mediu lichid steril.
Datorita diversitatii necesitatilor nutritive ale microorganismelor mediile de cultura trebuie sa fie foarte variate īn compozitie. Īn lume se cunosc firme care fabrica pe cale industriala medii de cultura (Difco, Sartorius, Novo, Sigma). Anual ele publica un catalog de medii de cultura pe care le poate obtine.
Mediile de cultura au o mare importanta practica deoarece sunt destinate cultivarii microorganismelor, selectionarii lor din medii naturale si īntretinerii culturilor selectionate. Acestea mai pot fi folosite pentru identificarea microorganismelor si studiul caracterelor lor fiziologice si morfologice. Īn practica se folosesc medii selective si medii generale pentru controlul microbiologic al alimentelor. Īn functie de natura mediilor de cultura se pot detecta īn microflora alimentelor diferite grupe de microorganisme.
Īn tehnica de laborator se utilizeaza si mediile fermentative, cu destinatie industriala (folosite īn cantitati mari īn scopul cultivarii industriale a microorganismelor) fie pentru obtinerea biomasei de celule - drojdii comprimate sau pentru obtinerea unor produse de biosinteza rezultate īn urma actiunii microorganismelor asupra componentelor din mediu.
Īn functie de destinatie, mediile de cultura pot fi:
Medii de cultura generale care au o compozitie diversificata, sunt bogate īn substante nutritive, permit dezvoltarea unui grup mare de microorganisme.
Mustul de malt este un exemplu de mediu de cultura general, obtinut din malt dupa aceeasi tehnologie care se foloseste la fabricarea berii. Sub forma lichida sau solidificat cu agar (MMA), cu pH acid, este mediu general pentru cultura drojdiilor si mucegaiurilor.
Bulionul de carne cu agar (BCA), cu pH neutru este mediul bogat īn surse de azot si favorizeaza dezvoltarea bacteriilor.
Mediul TEGA este folosit pentru punerea īn evidenta a bacteriilor din produsele alimentare prin metoda standard. Acest mediu contine triptona, extract de drojdie, glucoza si agar.
Mediile de cultura selective prezinta o compozitie specifica care este favorizanta doar pentru un grup restrāns de microorganisme sau chiar pentru dezvoltarea unei specii.
|
