Proprietatile proteinelor
Solubilitatea proteinelor este extrem de diferita si depinde de structura acestora. Īn general, proteinele fibrilare sunt insolubile īn apa. Celelalte proteine prezinta grade diferite de solubilitate, aceasta proprietate stānd la baza unor metode de separare si purificare preliminara. Unele proteine sunt usor solubile īn apa, altele sunt solubile īn apa si īn diferiti solventi organici, alte proteine se solubilizeaza doar īn solutii saline de diferite concentratii etc.
Datorita prezentei unei multitudini de grupe functionale libere ionizabile īn structura macromoleculelor 11511f524l proteice (-COO-, -NH3+, -S- etc.), solutiile proteinelor prezinta un caracter amfoter. Pe aceasta proprietate se bazeaza si rolul de sistem tampon pe care proteinele solubilizate īn diferite lichide biologice īl īndeplinesc alaturi de sistemul tampon carbonat-bicarbonat, sistemul tampon al aminoacizilor, al hemoglobinei si altele.
Ca si īn cazul aminoacizilor, datorita prezentei grupelor functionale ionizate īn moleculele proteinelor, acestea se caracterizeaza prin valori bine determinare ale punctului lor izoelectric (sau pH izoelectric - pI sau pHi) care se defineste ca fiind acea valoare de pH la care īncarcarea electrica globala a moleculei este nula. Acest parametru fizico-chimic prezinta o importanta practica deosebita, el stānd la baza metodelor electroforetice de separare si determinare a diferitelor fractiuni proteice din lichidele biologice. Valorile punctelor izoelectrice ale proteinelor oscileaza īntre limite foarte largi si nu depind de masa lor moleculara (tabelul II).
Īn structura tuturor proteinelor solubile aflate īn mediu apos pot ioniza grupele -NH2 terminale si grupele -COOH terminale. Īn afara de acestea, exista 7 aminoacizi ale caror resturi pot ioniza chiar si atunci cānd se situeaza īn interiorul catenelor polipeptidice.
Tabelul II.
Principalele constante fizico-chimice ale unor proteine native
|
Proteina |
Masa moleculara (Da) |
Constanta de sedimentare (S) |
pI |
|
Actina Adrenocorticotropina porcina Albumina serica bovina Albumina serica umana Antitoxina difterica b-Amilaza din cartof Chimotripsinogenul bovin Enolaza Feritina Fibrinogenul uman Fumaraza Hemocianina (Helix pomatia) Hemoglobina umana Insulina bovina Lactalbumina Lizozim (din oul de gaina) Mioglobina (casalot) Ovalbumina Papaina Pepsina Ribonucleaza bovina Tiroglobulina ovina Toxina difterica Tripsinogenul bovin |
|
|
|
I.3.2. Proprietati chimice
Hidroliza proteinelor si peptidelor naturale. Analiza compozitiei īn aminoacizi a unei proteine native sau a unei peptide naturale este deosebit de importanta pentru studiul structurii chimice a acestora. Totodata, ea pune multe probleme printre care, cea mai importanta o constituie puritatea materialului folosit pentru analiza. Acest material nu trebuie sa fie impurificat cu substante cu masa moleculara mica (saruri utilizate la purificare, lipide, glucide, ioni metalici etc.). Gruparile prostetice ale heteroproteinelor se separa de componentele proteice īnainte de a se trece la hidroliza acestora din urma. Īn functie de modul de realizare, hidroliza peptidelor si proteinelor este de mai multe tipuri.
1. Hidroliza acida Proteina supusa analizei este liofilizata si redizolvata īn solutie de HCl 5,7 N la care se adauga cāteva picaturi de fenol 5%. Īn fiola īn care a fost realizat amestecul de hidroliza se introduce azot sau se creeaza vid pentru a preīntāmpina oxidarea, dupa care se īncalzeste pe baia de apa la 40°C timp de 30 de secunde sub agitare usoara, pentru īndepartarea completa a oxigenului. Se realizeaza apoi hidroliza la 105 - 110°C īn fiola din sticla termorezistenta timp de 24 - 72 de ore dupa care fiola se raceste, iar acidul este īndepartat la rotavapor. Reziduul obtinut se redizolva īntr-un volum minim de apa bidistilata si se evapora din nou la sec.
Pentru determinarea calitativa si cantitativa a aminoacizilor īn hidrolizatul obtinut se folosesc analizoare automate de aminoacizi, cu īnregistrare automata care furnizeaza direct datele necesare calcularii continutului procentual al fiecarui aminoacid prezent īn proteina analizata. De regula, pentru obtinerea unor rezultate cāt mai exacte, se folosesc 0,4 - 0,5 mg de proteina nativa.
Hidroliza acida a proteinelor se poate realiza si cu alti acizi. Rezultate bune se obtin de exemplu si cu acid performic. Acesta se obtine amestecānd 9 volume acid formic 80% cu un volum de H2O2 30%. Amestecul se agita si se lasa īn repaus 30 minute la +4°C.
Indiferent de agentul folosit si de precautia de a īnlatura oxigenul, hidroliza acida a proteinelor si peptidelor este īntotdeauna īnsotita de oxidarea unor aminoacizi. Astfel, cisteina si cistina trec usor īn acid cistic, metionina trece īn metionin-sulfona, tirozina si triptofanul sunt complet distruse, iar treonina si serina se oxideaza īn proportie de 5 - 10%. Pentru evitarea acestor fenomene secundare, se recomanda realizarea unei hidrolize acide partiale, adica hidroliza la intervale de timp diferite de 24, 48 si 72 de ore.
2. Hidroliza cu bromcian sau iodacetamida. Aceasta metoda se bazeaza pe faptul ca īn mediu acid, bromcianul (BrCN) sau iodacetamida (ICH2 - CO - NH2) scindeaza specific legaturile peptidice formate de metionina rezultānd lactona homoserinei:
Scindarile cu ajutorul bromcianului si iodacetamidei dau posibilitatea obtinerii unor fragmente polipeptidice mai scurte ce pot fi ulterior analizate prin alte metode.
3. Hidroliza secventiala īncepānd cu extremitatea N-terminala Aceasta poarta numele de metoda Edman de degradare a proteinelor si foloseste ca reactiv fenil-tioizocianatul. Proteina de analizat se dizolva īntr-o solutie tampon adecvata dupa care se trateaza cu fenil-tioizocianat īn prezenta de acid trifluoracetic si īn absenta totala a oxigenului. Derivatii aminoacizilor N-terminali rezultati se identifica apoi prin cromatografie īn strat subtire.
4. Hidroliza secventiala īncepānd cu extremitatea C-terminala. Aceasta metoda utilizeaza carboxipeptidazele, enzime capabile sa hidrolizeze succesiv cāte un aminoacid de la capatul C-terminal. Dupa fiecare etapa, aminoacizii sunt separati prin dializa si determinati calitativ si cantitativ.
5. Hidrazinoliza este o alta metoda de determinare a aminoacidului C-terminal. Īn prezenta hidrazinei, toate legaturile peptidice sunt rupte si toti aminoacizii, cu exceptia aminoacidului C-terminal, trec īn hidrazide. Aminoacidul C-terminal se poate apoi identifica, fie cu ajutorul reactivului 2,4-dinitrofluorbenzenic, fie cu ajutorul clorurii de dansil.
Reactiile ce au loc īn cazul acestui procedeu sunt urmatoarele:
Cei doi derivati ai dinitrobenzenului (a si b) au solubilitati diferite si pot fi separati din amestec prin diferite procedee de extractie bazate pe diferenta de solubilitate.
6. Hidroliza enzimatica nespecifica. Acest tip de scindare hidrolitica se realizeaza īn conditii blānde de reactie. Īn principiu, orice proteina sau polipeptida poate fi scindata complet īn prezenta enzimelor proteolitice din clasa hidrolazelor. Din punct de vedere practic īnsa, acest procedeu este foarte laborios.
Īn primul rānd, hidroliza enzimatica completa nu se poate realiza cu o singura enzima ci cu un set de mai multe enzime alese īn functie de natura proteinei analizate.
7. Hidroliza enzimatica la pH acid Acest procedeu este utilizat īn cazul proteinelor ce se denatureaza la pH acid. Proteina de analizat este mai īntāi supusa denaturarii cu o solutie de guanidina sau de uree, urmata de dializa la pH acid. La proteina astfel denaturata se adauga apoi pepsina, subtilizina, aminopeptidaza si prolidaza. Uneori, īn functie de natura proteinei analizate, se īnlocuieste subtilizina, care este o proteinaza de origine microbiana, cu papaina extrasa din arborele Carica papaya.
Hidrolizatul obtinut este liofilizat, redizolvat īn acid acetic 5% si liofilizat din nou. Gradul de hidroliza enzimatica la pH acid este controlat permanent analizānd hidrolizatul prin cromatografie sau electroforeza.
8. Hidroliza enzimatica la temperaturi moderate se realizeaza īn prezenta papainei, leucinaminopeptidazei si prolidazei. Proteina este denaturata prin īncalzire timp de 3 minute la 95°C, iar dupa racire se tamponeaza la pH = 5,2. Hidroliza se realizeaza apoi timp de 18 - 24 de ore la 40°C, iar hidrolizatul obtinut se analizeaza prin metode specifice.
9. Hidroliza enzimatica specifica. Aceasta metoda consta īn utilizarea unor preparate pure de tripsina si chimotripsina, enzime ce hidrolizeaza specific legaturile peptidice formate de anumiti aminoacizi. Tripsina de exemplu, hidrolizeaza legaturile peptidice formate de resturile de lizina si arginina, iar chimotripsina pe cele realizate de leucina, fenilalanina si tirozina.
|
