Examinarea microscopica este frecvent primul pas in identificarea unor bacterii. Caracterele morfologice si tinctoriale incadreaza bacteriile intr-unul din grupurile majore stabilind conduita diagnosticului bacteriologic. 555i81f Elementele morfologice importante in identificarea unei bacterii sunt: dimensiunea, forma, asezarea, prezenta unor structuri speciale ca, de pilda, endospori, flageli, capsula sau incluzii intracelulare.
Microscopul cu camp luminos. Acesta are 2 sisteme de lentile care maresc imaginea obiectului studiat: lentilele obiectivului si lentilele ocularelor. In mod obisnuit se folosesc 3 obiective: un obiectiv care mareste de 10x si care se foloseste pentru obtinerea unei imagini de ansamblu a preparatului examinat, un obiectiv ce mareste de 40x, cu care se examineaza microorganisme mai mari ca, de pilda fungi, paraziti si in fine obiectivul cu imersie care amplifica imaginea de 100x si cu care se examineaza bacteriile. Imaginea mai este amplificata inca de 10 ori de lentilele ocularelor. Puterea de rezolutie (distanta cea mai mica intre 2 puncte ce poate fi perceputa) a unui microscop fotonic este de 0,2µ. La microscopul cu camp luminos se examineaza preparatele colorate, dar uneori si preparate native.
Microscopul cu fond intunecat. Are un condensator special, cardioid, care permite patrunderea luminii numai de la periferia obiectivului. La acest tip de microscop se examineaza preparatele native, intre lama si lamela, efectuate direct dintr-un produs, in care se cauta bacterii a caror latime nu depaseste 0,1-0,2µ (ca, de exemplu, evidentierea treponemelor din sancrul sifilitic), sau dintr-un mediu de cultura lichid, in care se urmareste dezvoltarea unei culturi (Leptospira etc.).
Microscopul cu contrast de faza se utilizeaza la examinarea preparatelor native. El are un sistem de filtre care permit sesizarea diferentelor de faza a luminii cand aceasta trece prin obiecte de densitate diferita. Microorganismele examinate la acest microscop au aspect tridimensional.
Microscopul cu raze UV. Preparatele de examinat sunt colorate cu un compus fluorescent cum este izotiocianatul de fluoresceina. Particulele colorate vor apare luminoase, fluorescente pe campul intunecat al microscopului.
Microscopul electronic. Lumina este inlocuita cu un fascicul de electroni. In microscopia electronica cu transmisie, electronii trec direct prin preparat, iar in microscopia prin baleiaj ei trec dintr-un anumit unghi prin preparat, astfel incat imaginea ce apare pe ecran este tridimensionala.
Examinarea morfologiei bacteriene se efectueaza pe diverse preparate microscopice.
Efectuarea frotiurilor fixate si colorate este o metoda de rutina in laboratorul de bacteriologie. Frotiurile se pot colora simplu cu un singur colorant, elementele preparatului avand toate aceeasi culoare, sau diferentiat cu mai multi coloranti, bacteriile colorandu-se diferit in functie de afinitatea lor tinctoriala.
Dupa efectuarea frotiurilor, acestea se usuca la temperatura camerei si se fixeaza cel mai des prin caldura, trecand frotiul de 2-3 ori prin flacara. In timpul fixarii, formele vegetative ale bacteriilor sunt omorate si devin permeabile pentru coloranti. Fixarea chimica (cu alcool metilic, acetona, May-Grünwald, acid osmic etc.) se utilizeaza mai ales cand preparatele sunt sectiuni de tesuturi sau frotiuri de sange, deoarece protejeaza celulele din produs de degradare.
Coloratiile simple folosesc solutii apoase a unui colorant bazic ca, de exemplu, albastru de metilen, violet de metil, fuxina bazica etc. Dupa colorare, frotiurile se spala pentru indepartarea excesului de colorant. Unii microbi se coloreaza bipolar datorita dispozitiei citoplasmei la ambele capete ale bacteriei.
Coloratia negativa este o metoda rapida si simpla de studiu a morfologiei bacteriene. Bacteriile se amesteca cu colorantul si se intind ca un film pe lama. Ele apar incolore pe fondul colorat al preparatului.
Impregnarea argentica se utilizeaza pentru colorarea spirochetelor, mai ales cand se urmareste evidentierea lor in tesuturi. In aceasta coloratie, spirochetele se coloreaza in brun-negru pe fondul galben al preparatului.
Coloratiile diferentiale sunt cele mai importante in laboratorul de bacteriologie. Cel mai des folosita este coloratia gram, introdusa de studentul danez Christian Gram la sfarsitul secolului trecut. Dupa cum apar bacteriile in aceasta coloratie, ele se impart in gram-pozitive si gram-negative.
Principiul coloratiei gram consta in colorarea initiala a bacteriilor cu cristal-violet sau violet de gentiana. Mordansarea se face cu lugol. Urmeaza decolorarea in urma careia unii microbi, cei gram-pozitivi, pastreaza colorantul violet, iar altii, cei gram-negativi, vor fi decolorati cu un amestec de alcool-acetona. Acestia din urma se vor recolora cu fuxina bazica. Bacteriile gram-pozitive vor aparea, deci, de culoare violet iar cele gram-negative rosii.
|
