Structura proteinelor

Structura proteinelor

Elucidarea structurii proteinelor a reprezentat si continua sa reprezinte una din problemele principale ale biochimiei aplicate. Fiecare proteina nativa reprezinta un edificiu tridimensional complex a carui conformatie depinde de dispozitia spatiala a catenelor polipeptidice din care este formata. Orientarea în spatiu a catenelor polipeptidice componente poarta denumirea de conformatie.

Comparativ cu celelalte biomolecule, proteinele prezinta o structura chimica mult mai complexa de care depind în mod direct functiile lor biologice si care se caracterizeaza prin existenta a patru nivele de organizare numite structura primara, secundara, tertiara si respectiv cuaternara.

I.4.1. Structura primara a proteinelor

Este data de numarul, natura si succesiunea resturilor de aminoacizi în catenele polipeptidice ce intra în structura acestora.

În structura primara, resturile de aminoacizi sunt unite prin legaturi peptidice identice cu cele întâlnite în structura peptidelor:

Studiul peptidelor sintetice cu ajutorul metodei difractiei de raze X prin cristale pure a permis determinarea distantelor interatomice într-o catena polipeptidica, precum si a unghiurilor dintre atomii componenti. Aceste determinari au demonstrat existenta unei perioade de identitate de 7,2Ĺ pentru fiecare doua resturi de aminoacizi. Totodata s-a observat ca distanta interatomica C - N este mai mica, iar distanta C = O este mai mare decât cele normal întâlnite în alti compusi.

Fig.1. Reprezentarea schematica a distantelor interatomice si unghiurilor de valenta în catenele polipeptidice

Aceste rezultate indica prezenta unei stari de rezonanta a legaturii peptidice între doua forme limita

Forma reala va fi deci cea intermediara între cele doua forme limita instabile

Aceasta înseamna ca legatura peptidica C - N nu este simpla ci partial dubla, fiind astfel împiedicata rotatia libera a substituentilor. Acest caracter de legatura partial dubla are o importanta deosebita pentru structurile de ordin superior ale proteinelor.

La nivelul legaturilor peptidice se întâlneste izomeria de tip trans, iar rotatia libera este permisa numai la nivelul celorlalte legaturi covalente. Orientarea spatiala a catenelor polipeptidice este datorata, în principal, acestor rotatii libere în jurul legaturilor mentionate: 13513e48n

Proteinele formate din mai multe catene polipeptidice se numesc proteine oligomere, iar polipeptidele componente se numesc protomeri). Protomerii se unesc într-o molecula oligomera prin legaturi covalente, dar nu de natura peptidica. Cel mai adesea, protomerii se leaga prin punti disulfidice intercatenare, adica realizate de resturi de cisteina localizate în catene polipeptidice diferite.

Prima proteina careia i s-a determinat structura primara (în 1955) a fost insulina care are o masa moleculara de 6.000 Da. Câtiva ani mai târziu s-a stabilit structura primara a ribonucleazei (M = 13.000 Da), iar în prezent sunt cunoscute structurile primare ale multor proteine cu mase moleculare mult mai mari si care sunt formate din sute sau chiar mii de resturi de aminoacizi.

Molecula insulinei contine doua catene polipeptidice: catena A cu 21 resturi de aminoacizi ce contine o punte disulfidica intracatenara formata de resturile Cys₆ si Cys₁₁ si catena B alcatuita din 30 resturi de aminoacizi. Cele doua catene polipeptidice sunt legate între ele prin doua punti disulfidice formate de resturile de cisteina A₇ - B₇ si respectiv A₂₀ - B₁₉:

Puntea disulfidica intracatenara din catena A este deosebit de importanta deoarece secventa aminoacizilor din bucla formata de aceasta reaminteste succesiunea resturilor de aminoacizi din ocitocina si vasopresina. Aminoacizii din pozitiile 8, 9 si 10 ale catenei A (Thr, Ser si Ile) sunt esentiali pentru caracterizarea insulinelor de la diferite specii:

insulina de bou:    ..- Ala - Ser - Val - ..

insulina de oaie: ..- Ala - Gly - Val - ..

insulina de cal: ..- Thr - Gly - Ile - ..

insulina de om: ..- Thr - Ser - Ile - ..

În urma unor experimente cu aminoacizi marcati radioactiv s-a demonstrat ca insulina este sintetizata în insulele Langerhans ale pancreasului sub forma unui precursor cu o masa moleculara mai mare decât cea a insulinei, acesta fiind denumit proinsulina. Molecula proinsulinei este formata dintr-o singura catena polipeptidica ce contine 84 resturi de aminoacizi si are o masa moleculara de 9.000 Da. În aceasta catena se regasesc catenele A si B ale insulinei si un fragment peptidic C care difera de la o specia la alta Pentru insulina umana si cea specifica altor mamifere este cunoscuta structura primara.

Fig. 2. Reprezentarea schematica a punctelor de clivare în catena polipeptidica a proinsulinei, în procesul conversiei acesteea în insulina

Studiile asupra structurii si proprietatilor insulinelor din diferite surse biologice au fost justificate de importanta acestui hormon pentru practica medicala în tratamentul diabetului zaharat

Un exemplu semnificativ în sprijinul afirmatiei ca structura primara a proteinelor este esentiala pentru asigurarea proprietatilor lor biologice îl constituie hormonul β-lipotrop sau lipotropina. El a fost izolat prima data în 1965 din hipofiza de oaie, dovedindu-se a fi o polipeptida alcatuita din 90 resturi de aminoacizi. Ulterior, s-a izolat din hipofiza de bou, porc si berbec un hormon de natura polipeptidica ce a fost denumit lipotropina, remarcându-se apoi ca preparatele hormonale izolate din diferite surse nu se deosebesc între ele structural si functional. Structura primara a acestui hormon a fost descifrata în 1968 dupa purificarea sa prin cromatografie pe coloana cu CM-celuloza.

Fig. 3. Reprezentarea schematica a structurii primare a insulinei umane (Kucerenko, N.E. - 1988)

I.4.2. Structura secundara a proteinelor.

Modelul helicoidal Studiul proteinelor fibrilare din clasa scleroproteinelor prin metoda difractiei razelor X a evidentiat faptul ca acestea se caracterizeaza prin prezenta unor regularitati structurale ale moleculei, prin unitati care se repeta si care sunt dispuse de-a lungul unui ax imaginar al moleculei.

Aceste regularitati în structura moleculei au fost numite perioade de identitate si ele difera de la o proteina la alta.

În functie de marimea perioadelor lor de identitate, proteinele se împart în 3 grupe:

- grupa α-keratinei, miozinei si fibrinogenului

- grupa α-keratinei si fibroinei

- grupa colagenului

Efectuând experimente pe cristale peptidice, Pauling si Corey au stabilit cu rigurozitate conditiile formarii catenelor polipeptidice si au constituit modele experimentale care sa ilustreze modul în care catenele polipeptidice sunt orientate în spatiu în functie de natura si numarul legaturilor peptidice, precum si de dimensiunile lor. Autorii au stabilit de asemenea, urmatoarele criterii care stau la baza formarii catenelor polipeptidice:

- aminoacizii constituenti trebuie sa prezinte configuratie L si au în structura proteinelor aceeasi valoare, deoarece catenele lor laterale nu influenteaza structura secundara;

- distantele interatomice si unghiurile de valenta trebuie sa prezinte aceleasi valori, indiferent de marimea catenei polipeptidice;

- atomii participanti la legatura peptidica trebuie sa fie coplanari, aceasta asezare fiind favorizata energetic;

- modelul experimental elaborat pe baza datelor de laborator trebuie sa permita formarea unui numar maxim posibil de legaturi de hidrogen.

Pe baza acestor postulate, Pauling si Corey gasesc ca cel mai simplu aranjament corespunzator acestor cerinte este modelul helicoidal sau spiralat, denumit α-helix. Acesta rezulta prin spiralizarea catenei polipeptidice în jurul unui cilindru imaginar.

În functie de directia de spiralizare, α-helixul poate sa apara teoretic sub doua forme:

- α-helixul de dreapta are sensul unui surub cu pasul spre dreapta;

- α-helixul de stânga are sensul unui surub cu pasul spre stânga.

Fig. 4. Reprezentarea schematica a modelului α-helicoidal al structurii secundare a proteinelor (Lentner,C. - 1986)

Catenele laterale ale resturilor de aminoacizi ies în afara corpului propriu-zis al -helixului si pot interactiona între ele sau cu solventul în care este dizolvata proteina.

Dintre toti aminoacizii proteinogeni, prolina, hidroxiprolina si chiar glicocolul nu se încadreaza perfect în α-helix, determinând o deranjare a structurii regulate a -helixului.

Aceasta structura helicoidala a macromoleculelor proteice a fost postulata cu 16 ani înaintea lui Pauling si Corey de catre biochimistul român Haralamb Vasiliu.

Aceasta asezare spatiala, care confera moleculei o arhitectura structurala speciala, este mentinuta datorita formarii unui mare numar de punti de hidrogen intracatenare la care participa oxigenul carbonilic din vecinatatea unei legaturi peptidice si hidrogenul iminic din vecinatatea alteia, situata la o distanta de 4 resturi de aminoacizi. Aceste punti de hidrogen sunt aproape paralele cu axul moleculei, iar într-o spira intra 3,6 resturi de aminoacizi.

Distanta dintre doua spire succesive este de 5,41 Ĺ, iar diametrul lor este de 0,101 Ĺ. Dupa un interval al α-helixului care cuprinde 18 resturi de aminoacizi, adica 27 Ĺ, α-helixul este superpozabil, adica se repeta identic dupa fiecare 5 spire. Acest interval reprezinta asa-numita perioada mare de identitate (perioada mica de identitate fiind reprezentata de secventa - NH - CH - CO -).

Modelul helicoidal a fost apoi confirmat experimental si reprezinta una din variantele structurii secundare a proteinelor. Multe date experimentale demonstreaza însa faptul ca proteinele native nu prezinta o structura secundara total sau perfect spiralata. Cele mai multe proteine prezinta o organizare structurala partial helicoidala, în sensul ca regiuni cu structura de α-helix pot alterna cu regiuni ce prezinta alt tip de structura secundara. Procentul de α-helix în structura proteinelor oscileaza între 0 - 10% în cazeina, actina si α-globulina, între 10 - 20% în ribonu­cleaza, între 20 - 30% la pepsina si histone, între 30 - 45% la ovalbumina, muramidaza si fibrinogen, între 60 - 80% la mioglobina si hemoglobina si respectiv între 80 - 100% în tropomiozina.

Modelul straturilor pliate. Datorita structurii lor chimice, prolina si hidroxiprolina nu se înscriu în structura α-helicoidala. Acesti doi aminoacizi heterociclici, dar si glicocolul, tind sa confere catenelor polipeptidice un alt tip de structura secundara, denumita α-conformatie, care corespunde modelului straturilor pliate.

Conform acestui model, doua sau mai multe catene polipeptidice, sau fragmente ale aceleiasi catene se orienteaza spatial sub forma pliata, în zig-zag.

Modelul straturilor pliate se poate prezenta în doua variante:

- modelul straturilor pliate paralele (caracteristic de exemplu pentru β-keratina) se întâlneste atunci când la o extremitate a moleculei sunt orientate capetele C-terminale, iar la cealalta capetele N-terminale ale catenelor polipeptidice;

Fig. 5. Reprezentarea schematica a modelului straturilor β-pliate ale structurii secundare a proteinelor

- modelul straturilor pliate antiparalele (întâlnit de exemplu la fibroina) se caracterizeaza prin faptul ca la ambele extremitati ale moleculei capetele C-terminale ale catenelor polipeptidice alterneaza cu cele N-terminale. În mod automat, atunci când structura β-pliata este formata de diferite fragmente ale aceleiasi catene polipeptidice, aceasta va fi de tip antiparalel.

Structura β-pliata este stabilizata de punti de hidrogen care se formeaza în mod similar ca în cazul structurii helicoidale, dar care sunt intercatenare si perpendiculare pe axul moleculei. Daca la α-helix radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi sunt orientati spre exterior, în structura β-pliata ei se orienteaza de o parte si de alta a planului legaturii peptidice, perpendicular pe acesta.

De regula, punctele de trecere de la fragmentele helicoidale la cele pliate si invers sunt reprezentate de resturile de prolina si hidroxiprolina si uneori de cele de glicina.

- Modelul tropocolagenului. Structurile α-helicoidala si β-pliata sunt caracteristice marii majoritati a proteinelor. Exista însa unele proteine, dintre care cea mai importanta este colagenul, care prezinta o structura secundara caracteristica ce a fost denumita modelul structural al colagenului. Studiile de difractie a razelor X indica în colagen o structura secundara cu o perioada de identitate de 2,86 Ĺ, paralela cu axul fibrei.

Ponderea mare a resturilor de prolina si hidroxiprolina (pâna la 25%) din molecula colagenului fac imposibila structura helicoidala sau pliata, acesti aminoacizi formând un numar mic de punti de hidrogen. Molecula colagenului este alcatuita din 3 catene polipeptidice, fiecare având o masa moleculara de 95.000 Da si câte 1.000 resturi de aminoacizi. Cele 3 catene ale colagenului sunt strâns legate între ele prin punti de hidrogen, dând nastere tropocolagenului (fig. 6).

Fig. 6. Reprezentarea schematica a modelului structural al tropocolagenului (Lentner, C. - 1986)

I.4.3. Structura tertiara a proteinelor

Majoritatea proteinelor na­tive au o structura spatiala compacta determinata de dimensiunile si polaritatea resturilor de aminoacizi precum si de succesiunea acestora în catenele polipeptidice componente. Acest nivel de organizare structurala reprezinta deci rezultatul interactiunilor dintre resturile aminoacizilor din catenele polipeptidice. Structura tertiara este definita ca fiind forma structurala ce rezulta prin superspiralizarea a doua sau mai multe catene polipeptidice ce contin fragmente α-helicoidale si β-pliate într-o arhitectura spatiala complexa sub forma de ghem sau globula.

Formarea unei structuri globulare native, caracteristica pentru o proteina data este un proces complex ce are la baza formarea unei multitudini de legaturi slabe, necovalente. Principalele proteine ale caror structuri tertiare au fost bine studiate sunt hemoglobina, mioglobina, muramidaza, ribonucleaza, papaina, chimotripsinogenul, carboxipeptidaza A, subtilizina si altele. Mentinerea si stabilizarea structurii tertiare se realizeaza prin fortele de atractie ce apar între radicalii aminoacizilor componenti care se pot orienta în asa fel încât sa ajunga în pozitii favorabile formarii diferitelor tipuri de legaturi. Dintre acestea, cele mai importante sunt urmatoarele:

- legaturile de hidrogen se formeaza între gruparile fenolice ale resturilor de tirozina si respectiv grupele -COOH apartinând resturilor de acid aspartic si glutamic, sau între nucleul imidazolic al histidinei si grupa -OH a serinei;

- legaturile ionice se formeaza între grupele -COOH ale acizilor aspartic si glutamic si grupele -NH₂ ale lizinei si argininei. Numarul legaturilor ionice este relativ mic, deoarece majoritatea grupelor functionale ionizate interactioneaza cu dipolii apei. Conformatia proteinelor în solutie este de asa natura încât un numar cât mai mare de grupari polare sa fie expuse la suprafata arhitecturii moleculare, iar gruparile hidrofobe sunt orientate de regula spre interiorul moleculei;

- legaturile van der Waals se formeaza între resturile hidrocarbonate ale aminoacizilor. Aceste interactiuni sunt date, în principal, de resturile de alanina, fenilalanina, leucina, valina, izoleucina etc. Majoritatea radicalilor nepolari, hidrofobi ai acestor aminoacizi se orienteaza spre interiorul moleculei asigurând stabilitatea structurii acestora. Radicalii polari, ionizati, ai unor aminoacizi (în primul rând cei de arginina, lizina, acid aspartic si acid glutamic) sunt orientati spre exteriorul moleculei proteice unde interactioneaza cu dipolii apei din mediu.

Datorita aparitiei interactiunilor enumerate mai sus este asigurata pe de o parte nu numai stabilitatea structurii tridimensionale ci si conformatia optima din punct de vedere termodinamic. Pe de alta parte, diversitatea tipurilor de legaturi întâlnite în structura tertiara a proteinelor, precum si valorile energiilor de legatura, explica marea labilitate a proteinelor sub actiunea diversilor factori fizico-chimici cum ar fi pH-ul mediului, temperatura, presiunea osmotica, prezenta sau absenta unor substante chimice etc.

Dezorganizarea structurii tertiare, care este foarte complexa si variata, determina pierderea proprietatilor biologice ale proteinelor!

Deseori se pot produce modificari foarte mici în conformatia determinata de structura tertiara prin legarea într-un mod oarecare (de exemplu adsorbtie) a unui compus chimic cu masa moleculara mica. Aceste modificari conformationale poarta numele de efect alosteric si joaca un rol extrem de important în reglarea activitatii enzimelor.

În ceea ce priveste forma moleculelor proteice care este data de structura secundara si tertiara a acestora, se cunosc doua tipuri extreme (proteine fibrilare si respectiv proteine globulare), majoritatea proteinelor având însa structuri intermediare. Forma moleculelor proteice nu depinde numai de factorii ce tin de însasi structura proteinelor ci si de factorii de mediu.

Replierea si superspiralizarea catenelor polipeptidice depind de pH-ul mediului, de salinitatea acestuia, de prezenta sau absenta anumitor compusi chimici, de presiune osmotica de temperatura etc., ceea ce explica marea variabilitate functionala a proteinelor în raport cu mediul de reactie, precum si faptul ca unele proteine fibrilare pot trece în forma globulara si invers, odata cu modificarea caracteristicilor mediului.

I.4.4.Structura cuaternara a proteinelor

Aceasta reprezinta nivelul de organizare cel mai înalt al proteinelor si este rezultatul interactiunilor dintre catenele polipeptidice independente, fiecare cu structura sa primara, secundara si tertiara caracteristica.

Acest tip de structura nu se întâlneste la toate proteinele. El este caracteristic, în principal, proteinelor globulare a caror masa moleculara este mai mare de 50.000 Da si sunt proteine oligomere, adica au molecula formata din mai multi protomeri. Subunitatile proteinelor oligomere pot fi foarte diferite în functie de complexitatea structurilor primara, secundara si tertiara. Unele proteine oligomere formeaza structuri cuaternare prin asocierea subunitatilor globulare (cum se întâmpla în cazul hemoglobinei) sau a unor subunitati spiralate, filiforme (ca de exemplu la proteina virusului mozaicului tutunului - VMT).

Un exemplu concret de proteina oligomera cu structura cuaternara este insulina, în formarea careia, un rol extrem de important îl joaca diferiti parametri fizico-chimici. Structura primara a insulinei este cunoscuta, cea secundara este de tip α-helix, iar structura tertiara nu este înca pe deplin elucidata. Structura cuaternara rezulta prin polimerizare si depinde de pH, temperatura, concentratia insulinei în mediu si de prezenta ionilor de Zn²⁺. În conditii obisnuite, insulina este un tetramer cu masa moleculara de 24.000 Da. Insulina cristalizata poate exista sub forma de dimer dau hexamer, însa uneori este prezenta exclusiv sub forma de monomer.

De exemplu, insulina de cobai nu dimerizeaza în prezenta ionilor de Zn²⁺ deoarece în pozitia B₂₂, restul de arginina existent la insulinele altor animale este înlocuit cu un rest de acid aspartic.

Studii asupra insulinei bovine în ceea ce priveste dinamica legarii zincului au aratat ca nu exista o legatura directa între legarea ionilor de Zn²⁺ si activitatea hormonala a insulinei deoarece fragmentele din molecula implicate în activitatea sa biologica sunt diferite de cele care participa la legarea zincului. Formarea dimerilor insulinei prin participarea ionilor de zinc are loc datorita existentei resturilor de histidina în catenele A (fig. 7).

Asocierea moleculelor de insulina cu formare de trimeri si tetrameri are si o importanta practica deoarece preparatele de insulina utilizate pentru tratamentul diabetului zaharat difera dupa compozitia lor chimica si tipul de actiune astfel:

- insulina obisnuita sau clasica este un preparat de insulina cristalizata care are o actiune rapida, efectele manifestându-se dupa 20 - 30 minute de la administrare, iar durata medie de actiune este de aproximativ 6 ore;

Fig. 7. Reprezentarea schematica a formarii dimerilor insulinei

- insulina NPH este un preparat de insulina a carei actiune se declanseaza dupa 3,5 - 4 ore de la administrare si ramâne activa timp de 22 - 24 de ore;

- zinc-protamin-insulina (sau insulina retard) este un preparat cu actiune lenta ce se manifesta dupa 5 - 6 ore de la administrare, timpul de actiune fiind de 30 - 32 de ore.

Proteinele oligomere pot avea o ierarhie complexa a subunitatilor din care sunt alcatuite. De exemplu, glutamat-dehidrogenaza din ficatul de bou are molecula formata din 8 subunitati identice, fiecare având o masa moleculara de 280.000 Da. La rândul ei, fiecare subunitate este constituita din câte 5 catene polipeptidice cu masa moleculara de aproximativ 55.000 Da. În asemenea cazuri, notiunea de protomer se utilizeaza pentru a desemna catenele polipeptidice, iar pentru unitatea functionala se foloseste termenul de subunitate.

Structura cuaternara poate fi dezorganizata cu usurinta cu obtinerea protomerilor sau subunitatilor constitutive, mai ales prin diluarea solutiilor, modificarea pH-ului, adaugarea de uree, guanidina si unele saruri. În urma înlaturarii agentului care a determinat disocierea proteinelor oligomere, se constata auto-reasamblarea rapida cu formarea suprastructurilor cuaternare.

Dupa cum s-a vazut mai sus, în proteine iau nastere mai multe tipuri de legaturi si interactiuni care explica marea complexitate si diversitate structurala ale acestor biomolecule.

În proteinele native se formeaza deci atât legaturi puternice, covalente, cât si legaturi si interactiuni slabe, fiecare dintre acestea îndeplinind anumite functii care asigura exercitarea rolului biologic specific fiecarei proteine în parte.

a) Legaturile covalente. În structura tuturor proteinelor native exista doua tipuri de legaturi covalente: legaturi peptidice si legaturi (punti) disulfidice. Legaturile peptidice sunt identice cu cele de la peptide, având acelasi caracter partial de legatura dubla si servesc la încatenarea resturilor de aminoacizi cu formarea cetenelor polipeptidice si a proteinelor, iar puntile disulfidice iau nastere prin oxidarea enzimatica a resturilor de cisteina cu formarea cistinei Legaturile disulfidice joaca un rol extrem de important în stabilizarea structurii spatiale a proteinelor. Atunci când resturile de cisteina implicate apartin aceleiasi catene polipeptidice se formeaza punti disulfidice intracatenare, dar daca resturile de cisteina sunt situate în catene diferite ele formeaza puntile disulfidice intercatenare.

b) Legaturile necovalente joaca, de asemenea, un rol important în stabilizarea conformatiei macromoleculelor proteice. Dintre acestea, cele mai importante sunt interactiunile hidrofobe, puntile de hidrogen, legaturile ionice etc.

- Interactiunile hidrofobe iau nastere între resturile alchil sau aril cu caracter hidrofob ale diferitilor aminoacizi (alanina, valina, leucina, izoleucina, fenilalanina si triptofan). Procesul de formare a interactiunilor hidrofobe se poate reprezenta ca fiind rezultatul deplasarii radicalilor nepolari (metil, etil, fenil etc.) ai catenelor polipeptidice din mediul apos într-o zona hidrofoba formata ca urmare a interactiunii dintre aceste grupari. Asa se explica faptul ca la proteinele globulare, solubile, suprafata moleculelor este preponderent hidrofila, iar interiorul are în general caracter hidrofob.

Fig. 8. Reprezentarea schematica a tipurilor de interactiuni ce se stabilesc în moleculele proteinelor

a - legatura peptidica

b - legatura ionica

c - punti de hidrogen

d - interactiuni hidrofobe

e - punti disulfidice

- Legaturile de hidrogen se formeaza între atomi de hidrogen legati covalent de atomi ce au o pereche de electroni neparticipanti si diversi atomi cu caracter electronegativ cum a fi atomii de oxigen, azot etc. În polipeptide si proteine, puntile de hidrogen pot fi atât intercatenare (asa cum se întâmpla de exemplu în α-helix) cât si intracatenare (ca în structura β-pliata).

- Legaturile ionice se formeaza preponderent între grupele carboxilice libere ale resturilor de acid aspartic si glutamic si respectiv grupele aminice libere ale resturilor de lizina si arginina.