Tipuri celulare īntālnite īn organismul uman. Proliferare si diferentiere celulara, culturile celulare

Lucrare practica numarul 13

Tipuri celulare īntālnite īn organismul uman. Proliferare si diferentiere celulara, culturile celulare

Toate tesuturile sunt constituite din celule si substanta intercelulara. Substanta intercelulara poate fi reprezentata īntr-o cantitate ce difera īn functie de tesut: foarte redusa cum īntālnim īn tesutul epitelial sau abundenta īn tesutul conjunctiv. La tesutul conjunctiv īn aceasta substanta se gasesc si elemente fibrilare. Atāt substanta intercelulara cāt si fibrele sunt produse de elaborare ale celulelor tisulare locale. Astfel devine clar ca elementul constitutiv de baza al fiecarui tesut este celula, care reprezinta unitatea morfologica si functionala a oricarui tesut.

Dimensiunile celulei sunt particulare fiecarei localizari tisulare īn diferite organe:

-4-5 microni (celulele granulare din cerebel),

-7-8 microni (limfocite, eritrocite),

-30-40 microni (neuronii din coarnele anterioare ale maduvei spinarii),

-180-200 microni (ovulul).

Forma celulelor

Este dependenta de functia lor si de modul de agregare, din care cauza celulele īn preparatele histologice se prezinta sub forme variate:

-celula sferica: ( ovocit, leucocit, adipocit, condrocit, etc),

Figura 1. Celula sferica. Adipocitul (celula grasa). Are un 22522f521w contur sferoidal, continānd un nucleu turtit si situat spre periferie, sub plasmalema si putina citoplasma.

-celula poliedrica (celulele spinoase din epiteliul malpighian -epiderm, epiteliul bucal),

Figura 2. Celule poliedrice. Celulele stratului spinos epidermic sunt prevazute cu multe laturi, au nucleul sferic si situat central, 1, iar īntre ele lasa spatii intercelulare. Celulele nu sunt lipite una de alta si se leaga īntre ele prin spini intercelulari, 2, (desmozomi).

-celula turtita, pavimentoasa (celulele endoteliale, celulele mezoteliale),

Figura 3. Celula turtita (pavimentoasa) cu citoplasma putina si īntinsa iar nucleul discoidal proemina īn zona centrala. Limitele celulare se evidentiaza prin impregnare argentica , se coloreaza īn negru.

-celula stelata (neuronul - celulele nervoase),

Figura 4. Celula stelata (neuron). Corpul celulei prezinta prelungiri periferice care sunt mai intens impregnate la origine dānd celulei aspect stelet. Nucleul este rotund, slab colorat, cu nucleol situat central.

-celula fuziforma (fibra musculara neteda -miocitul),

Figura 5. Celula fuziforma. Celula musculara neteda. Celula are forma alungita, (de aici si numele de fibra) si ascutita la cele doua capete, (forma de fus). Nucleul alungit este situat central.

-celula flagelata (spermatozoidul),

Figura 6. Celula flagelata. Spermatozoidul. Se remarca la o extremitate a celulei capul spermatozoidului ovalar, intens colorat (contine nucleul) si o prelungire subtire si usor flexuoasa-coada (flagelul) spermatozoidului.

-celula piriforma (celula Purkinje,din scoarta cerebeloasa)

Figura 7. Celula piriforma

-celula cubica ( celulele epiteliului tiroidian, celulele plexurilor coroide, celulele din epiteliul canaliculului biliar din spatiul Kiernan),

Figura 8. Celule cubice. Celula are forma cubica, nucleu sferic situat central.

-celula cilindrica (celula epiteliului mucoasei gastrice, celula epiteliului mucoasei intestinale, celula epiteliului mucoasei uterine),

Figura 9. Celule cilindrice, īnalte, ce prezinta doi poli (pol bazal si pol apical). La polul apical apar fine striatii, platoul striat. Nucleul este ovalar situat īn treimea inferioara

-celula caliciforma (celula mucoasa din epiteliul mucoasei intestinale si din epiteliul mucoasei respiratorii),

Figura 10. Celula caliciforma ( are forma unui caliciu de floare sau a unei cupe de sampanie)

-celula piramidala (neuronii piramidali din scoarta cerebrala, celula secretorie din acinii serosi),

Figura 11. Celula piramidala

-celula cu prelungiri mult ramificate dāndu-i un aspect neregulat (Ex: celula pigmentara, melanocitul). Pigmentul secretat de melanocit este melanina, ce confera citoplasmei aspectul brun īnchis.

Figura 12. Celula pigmentara ce prezinta prelungiri mult ramificate dāndu-i celulei un aspect ce nu-i permite īncadrarea īn nici o forma bine precizata, din care cauza i se spune ca este de forma neregulata. Este colorata prin pigmentul sau.

-celula discoidala (hematia), sau echivalente celulare

Fig. 13 Hematie. Este anucleata, vazuta din fata este rotunda si mai slab colorata la mijloc, vazuta din lateral apare ca un disc biconcav.

Plasmodiul este o formatiune citoplasmatica multinucleata rezultata dintr-o singura celula prin cresterea citoplasmei si īnmultirea nucleilor. Ex: Fibra musculara striata.

Figura 14. Fibra musculara striata. Se remarca forma de panglica a fibrei musculare striate īn a carei citoplasma bogata si eozinofila se gasesc numerosi nuclei ovalari, dispusi īn periferie. Sub sarcolema, aspectul striat al citoplasmei, este dat de structura specifica a miofibrilelor fibrei musculare.

Sincitiul este o formatiune citoplasmatica multinucleata rezultata prin contopirea mai multor celule. Ex. Osteoclastul, sincitiul trofoblastic, etc.

Figura 15. Osteoclast. Apare ca o celula voluminoasa cu citoplasma bogata, cu contur neregulat continānd multi nuclei sferoidali.

Metode de studiu ale biologiei celulare

Culturile de celule

Dezvoltarea organismului uman este rezultatul unor procese de diviziune, crestere, īnmultire si diferentiere celulara care duce la dobāndirea unor functii si structuri morfologice specifice tipurilor de celule. Mecanismele cresterii si proliferarii celulelor au fost urmarite experimental prin cultivarea de celule « in vitro ».

Definitie: termenul general de "culturi de celule" desemneaza totalitatea tehnicilor prin care un organ, un tesut sau celule dispersate (natural sau prin tehnici de laborator) sunt mentinute īn viata sau multiplicate īn afara organismului ("in vitro").

Prin culturile de celule, se poate studia comportamentul celulelor īn conditii strict definite:

-se adauga sau se extrag molecule specifice (de exemplu factori de crestere) si se determina efectele asupra comportamentului celular;

-se obtin populatii omogene de celule pentru analize biochimice; pe culturi mixte, se studiaza interactiunile īntre tipurile celulare.

Pe lānga scopurile de cercetare, culturile de celule sunt folosite si pentru producerea vaccinurilor virale.

A.              Clasificarea culturilor de celule :

Dupa felul substratului, pot fi:

- pe suport organic nutritiv;

- pe suport organic nenutritiv;

- pe suport anorganic;

- īn suspensie īn mediu lichid.

Dupa tipul de material biologic cultivat se disting doua mari categorii de culturi:

1. Culturi de organe (organocultura) - reprezinta īntretinerea, de obicei fara multiplicare, īn medii nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin, trahee, rinichi).

Īn general, cultura de organe "in vitro" este dificila si necesita medii nutritive complexe si conditii tehnice speciale.

2. Culturi de celule - reprezinta multiplicarea "in vitro" a celulelor din:

-fragmente de tesut (explante); in jurul explantului se formeaza o coroana de celule care se multiplica;

-suspensii de celule naturale sau obtinute prin dispersarea īn laborator.

Īn prezent, se pot obtine culturi celulare īn linie continua, mentinute de-a lungul a 15-20 de pasaje fara a se transforma sau degenera, precum si linii celulare stabilizate, care īsi mentin nealterati parametrii morfologici si fiziologiei initiali dupa multiple diviziuni.

Clonarea reprezinta separarea unei singure celule si multiplicare a ei separata rezultānd o linie celulara uniforma din punct de vedere genetic.

Īn organism, celulele se gasesc sub influenta mecanismelor de conservare si control. Odata scoasa din mediul natural de viata, celula are nevoie, pentru a supravietui si a se multiplica "in vitro", de o serie de conditii de ordin fizic, chimic, bioenergetic care sa mimeze cāt mai mult situatia "in vivo".

Reusita culturilor de celule "in vitro", depinde īn mare masura de:

-folosirea instrumentarului steril;

-aplicarea unor tehnici aseptice;

-utilizarea unor medii de cultura care sa asigure celulelor cultivate "in vitro" conditii apropiate de acelea pe care le ofera organismul viu.

Deosebirile esentiale dintre aceste doua modalitati de viata si de multiplicare celulara sunt:

- "in vivo", celulele sunt supuse controlului neuroendocrin si influentei tesuturilor din vecinatate; aportul de substante nutritive si eliminarea produselor de metabolism se face continuu prin sānge si limfa;

- "in vitro", celulele nu sunt supuse acestui control; aportul si eliminarea sunt periodice.

B. Mediile de cultura

Se pot clasifica dupa mai multe criterii:

dupa consistenta - sunt medii lichide si semilichide;

dupa compozitie - exista medii naturale, semisintetice si sintetice;

dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit - se cunosc medii de crestere, care asigura proliferarea celulelor din cultura, medii de mentinere utilizate pentru īntretinerea culturilor ajunse la dezvoltare maxima si care pastreaza toate activitatile celulare si medii defective, testarea celulelor īn conditii speciale de crestere.

Mediile de cultura celulara trebuie sa asigure:

-echilibrul ionic obtinut cu solutii izotone (pentru pastrarea continua a presiunii osmotice); pH-ul optim (pH 7.2 - 7.4) mentinut cu substante tampon (tampon fosfat sau bicarbonat de sodiu - CO₂); īn mediu exista si un indicator de pH;

-temperatura optima, continutul de 0₂ si de CO₂ favorabil;

-elemente nutritive, indispensabile metabolismului: hidrati de carbon (glucoza), proteine animale (din lichide biologice - plasma, ser, lichid amniotic) si aminoacizi esentiali, grasimi, vitamine, hormoni, substante stimulatoare ale cresterii;

-evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice (penicilina, streptomicina) si antifungice (stamicin, micostatin);

-stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugarea de extracte embrionare.

Mediile nutritive contin:

-o solutie salina (solutie tampon si indicator);

-elemente proteice (ser sau plasma sau lichid amniotic, aminoacizi);

-elemente stimulatoare ale cresterii (extracte tisulare de origine embrionara sau adulta);

-vitamine;

-antibiotice.

C. Tehnica culturii celulare

Se desfasoara īn mai multe etape, īn toate etapele se respecta riguros regulile de asepsie.

a. Reeditarea - se face din cele mai varitate tesuturi provenite de la om, animal sau plante. Dupa provenienta lor tesuturile ce urmeaza a fi cultivate se īmpart īn:

- tesuturi normale: - embrionare (se cultiva usor, crestere rapida);

- adulte (medii complexe, crestere lenta, precedate de un timp de latenta de cāteva zile);

-tesuturi tumorale.

b. Dispersarea mecanica (maruntirea embrionului) se realizeaza īntr-un mediu steril, cu ajutorul unui foarfece special. Daca nu se obtin rezultate satisfacatoare, fragmentele rezultate sunt supuse dispersarii chimice cu tripsina la 37°C, pe suprafata unui agitator magnetic.

Actiunea tripsinei se opreste prin racirea solutiei si apoi celulele se separa de solutia de tripsina prin centrifugare si se īnlatura supenatantul reprezentat de tripsina.

Se resuspenda sedimentul celular īntr-un mediu nutritiv, apoi se prepara o dilutie 1:10 a suspensiei celulare īn mediu nutritiv pentru efectuarea numararii.

c. Numararea cu camera de numarare (hemocitometru).

Din dilutia preparata (9 ml de mediu nutritiv, 1 ml din suspensia de celule) se pune o picatura pe suprafata unei camere de numarare, pentru a stabili densitatea celulelor din suspensie.

Dupa determinarea densitatii suspensiei celulare, se adauga un anumit volum de mediu nutritiv astfel īncāt sa se ajunga la numarul optim de celule pe mililitru, si anume 106 celule /ml.

d. Determinarea viabilitatii celulelor din suspensie cu ajutorul solutiei de albastru de triptan 0.5%;

-se adauga 0.1 mI solutie īn 0.9 ml de suspensie celulara.

-o picatura din acest amestec se examineaza la micro scopul fotonic

- celulele vii ramān necolorate, cele moarte aparānd albastru-violet.

Mortalitatea nu trebuie sa depaseasca 10%.

e. O cantitate din suspensia de celule pentru care s-a determinat viabilitatea si densitatea optima se repartizeaza pe suprafata recipientului de cultura, cāt mai uniform, cu ajutorul unei pipete Pasteur; se tine la termostat la 37°C, timp de 30 - 60 min. apoi se introduce mediul de cultura, astfel ca el sa nu antreneze fragmentele fixate pe peretii recipientului. Vasul se īnchide si se incubeaza la 37°C, fara a se agita timp de 3-4 zile.

Metoda este analoga si īn cazul utilizarii testurilor solide umane, embrionare sau adulte.

f. Controlul culturilor

Controlul mediului de cultura se efectueaza la 12-24 de ore pentru:

- contaminare (bacterii, fungi, virusi);

- constantele fizico-chimice (pH, proteine totale);

-aprecierea eficientei culturii (densitatea celulara pe suport, eficienta de formare a coloniilor).

Controlul morfologic al celulelor din culturi se face prin:

- microscopie fotonica pe preparate proaspete se examineaza celulele vii la microscopul cu contrast de faza sau pe preparate permanente fixate si colorate;

- histoautoradiografie;

- microscopie electronica.

Activitate practica

Cultura de limfociti din sāngele periferic

Reeditarea - Se ia 3ml sānge, prin punctie venoasa la plica cotu1ui, cu ajutorul unei seringi sterile, heparinata anterior recoltarii. Se poate recolta sānge si din punctie īn pulpa degetului, īnsa aceasta metoda comporta risc de infectie a culturii mai frecvent, motiv pentru care are aplicatie limitata.

Īnsamāntarea mediului - consta īn repartizarea mediului de cultura special īn flacoane de sticla sterile de 20 - 30 ml, īn care se va pune 10 ml de mediu de cultura īn conditii sterile. Se lasa sa ajunga la temperatura camerei, dupa care se plaseaza īn fiecare flacon 12 - 20 picaturi din sāngele recoltat (numarul picaturilor fiind īn functie de leucograma persoanei investigate).

Se īnchide flaconul cu un dop steril si se agita usor pentru omogenizare.

Cultura este tinuta la termostat la 37C° timp de 72 - 96 ore, interval īn care la fiecare 24 ore se verifica ph-ul si aspectul.

Acidifierea mediului este tamponata cu fosfat - tampon.

Culturile care īsi schimba culoarea sau devin tulburi, vor fi īntrerupte, deoarece cultura este compromisa.