METODE GAZCROMATOGRAFICE DE DETERMINARE A PESTICIDELOR DIN PRODUSELE ALIMENTARA DE ORIGINE ANIMALA
Determinarea reziduurilor de pesticide organoclorurate din produsele alimentare de origine animala
Pesticidele organoclorurate sint substante chimice de sinteza cu actiune insecticida, utilizate in agricultura si in zootehnie pentru combaterea daunatorilor plantelor si ectoparazitilor animalelor. De asemenea, sint utilizate cu success pentru stirpirea insectelor purtatoare de agenti care produc boli transmisibile la om si animale.
Substantele din aceasta grupa se caracterizeaza prin mare stabilitate chimica. Aceasta le asigura efect insecticide de lunga durata, dar si persistenta si concentrare in sol consecutive administrarilor repetate in sfera productiei vegetale. Persistenta unor insecticide organoclorurate in sol este de ordinal anilor cum este cazul DDT-ului si HCH-ului.
Patrunse in organismul omului si animalelor, de obicei prin intermediul alimentelor, respective al furajelor, aceste substante sint greu metabolizabile producindu-se deci acumularea si concentrarea lor in tesuturi.
Liposolubilitatea, a doua proprietate importanta a pesticidelor organoclorurate, face ca distributia lor in tesuturile animale sa nu fie uniforma, acumularea si concentrarea realizandu-se in primul rind la nivelul tesutului gras unde formeaza veritabile depozite.
Urmarea insusirilor aratate, se poate vorbi de patru trepte de concentrare in circuitul pesticidelor organoclorurate:
Sol à plante à animale à om.
Pesticidele organoclorurate sint recunoscute ca substante virtual vatamatoare pentru om, fiind incriminate pentru efectele neurotoxice, embriotoxice, teratogene, cancerigene, dereglarea activitatii enzimatice cu afectarea concomitenta in special a functiilor organelor de importanta vitala s.a. Pentru aceste considerente asistam astazi pe de o parte la restringerea sferei de utilizare si supravegherea severa a regimului acestor substante, iar pe de alta parte la excluderea din consumul omului a alimentelor al caror continut in reziduuri de pesticide organoclorurate depasest 232i88c e limitele maximale stabilite.
Metoda gazcromatografica A.O.A.C.
Principiul metodei
Reziduurile de pesticide organoclorurate din grasimea sau extractul eteric al probe ice se cerceteaza, sint antrenate selectiv cu acetonitril. Din acetonitril sint reluate cu eter de petrol si purificate prin adsorbtie selctiva pe coloana de florisil, iar de aici sint extrase, tot selectiv, cu ajutorul unui eluent format dintr-un amestec de eter de petrol, eter etilic si alcool etilic.
Lichidul de elutie concentrat este supus determinarii gazcromatografice. Continutul de reziduuri individuale, calculate si exprimat in mg la 1 kg produs, sau mg la 1 kg grasime din compozitia produsului (ppm), se stabileste fata de un standard de referinta care contine cantitati cunoscute din pesticidele ce se cerceteaza.
Aparatura, materiale si striclarie
-Aparat gazcromatograf model Carlo Erba; Tracor; Barber Colman; Varian; Packard, sau similar, cu urmatoarele caracteristici:
-Detector cu captura de electroni, cu folie de nichel (Ni ).
-Coloana din sticla in "U" sau "spirala", cu lungimea de 180 cm si diametrul interior de 4 mm.
-Gazul purtator: azotul, purificat pentru cromatografie. Pentru purificare suplimentara, pe circuitul de azot se inseriaza turnuri cu sita moleculara pentru retinerea apei.
-Umplutura de coloana, in una din urmatoarele doua retete:
a-4% SE-30+6% OV-210
by weight on
100/120 mesh Chromosorb WHP
b-1,5% OV-17+1,95% OV-210
by weight on
60-80 mesh Gas Chrom Q
-Dispozitiv de tocat si omogenizat probele.
-Omogenizatoare electrice model Ato-mix, cu cupe din sticla sau inox, de diferite capacitati (100-1000 ml), sau similar.
-Etuve electrice termoreglabile.
-Evaporatoare rotative model Buchi, sau similar, cu baloane de diferite capacitati (100-1000 ml), sau alt tip de concentratoare.
-Instalatie Soxhlet pentru extractie cu solventi organici.
-Stative-suport speciale, prevazute cu inele si cleme metalice.
-Seringi de injectare
model
-Sticlarie uzuala de laborator. In plus:
-Pilnii de separare de 100 si de 500 ml ( se recomanda ca robinetul si dopul sa fie confectionate din teflon).
-Coloane cilindrice din sticla, cu lungimea de 40 cm si diametrul interior de 22 mm, efilate la partea inferioara si prevazute cu rondea din stricla poroasa ( in locul acesteia se poate folosi vata de sticla sau chiar vata de bumbac special tratata).
-Instalatie din sticla prevazuta cu coloana Vigreux, pentru purificarea prin distilare fractionate a solventilor organici.
-Eprubete gradate de 10 ml prevazute cu dop slefuit ( se prefera dopul din Teflon).
-Seringi de sticla cu ac metallic lung.
Reactivi
-Eter de petrol pentru cromatografie;
-Eterul etilic pentru cromatografie (fractiunea 34-35ºC).
-Acetonitril pentru cromatografie, de puritate "nanograd" (fractiunea 81-82ºC).
-Sulfat de sodiu anhidru c.p.
-Solutie apoasa de sulfat de sodium 2%.
-Florisil, granulatie 60-100 mesh, pentru cromatografie.
-Lichidul de elutie nr.1: 6 parti eter etilic (continind la rindul sau 2% alcool etilic absolute) +94 parti eter de petrol (6%).
-Lichidul de elutie nr.2: 15 parti eter etilic (continind la rindul sau 2% alcool etilic absolute)+85 parti eter de petrol (15%).
-Solutiile standard se prepara din substantele de maxima puritate, care se dizolva in hexan sau eter de petrol, in asa fel incit in final concentratia acestora pe microlitru sa fie de ordinul nanogramelor (0,00000000-g).
Mod de lucru
Metoda de lucru are trei etape relativ distincte:
a-Obtinerea si purificarea grasimii din proba de cercetat (pentru produsele la care conditia este raportata la grasime), sau obtinerea si purificarea extractului eteric concentrat (pentru probele la care conditia este raportata la produsul ca atare).
b-Extractia si purificarea reziduurilor de pesticide organoclorurate din grasimea sau extractul eteric al probei ce se cerceteaza. Reziduurile purificate sint aduse in final in solutie eterica.
c-Inregistrarea gazcromatografica si calcularea rezultatelor.
Metoda gazcromatografica simplificata
Metoda se aplica cu rezultate bune numai pentru determinarea reziduurilor de pesticide organoclorurate din carne si din produse de carne.
Principiul metodei
O anumita cantitate de grasime din produsul supus controlului (extrasa si purificata dupa tehnica clasica) solvita intr-o anumita cantitate de eter de petrol, este trecuta direct pe coloana de alumina neutral. Din coloana, reziduurile de pesticide organoclorurate sint antrenate selectiv cu o cantitate riguros determinata de eter folosit ca eluent. Solventul de elutie este supus concentrarii si folosit in aceasta forma pentru determinarea gazcromatografica.
Materiale
-Aparatura specifica si sticlarie uzuala de laborator.
-Coloane cilindrice din sticla cu lungimea de 300 mm si diametrul interior de 12 mm, prevazute la partea inferioara cu rondea filtranta din sticla poroasa si robinet din teflon.
Reactivi
-Eter de petrol pentru gazcromatografie, de puritate nanograde.
-Acetona pentru cromatografie.
-Alumina neutral (aluminium oxid neutral), Al O
Inainte de folosire, alumina se trateaza timp de 4 ore la temperatura de 800ºC pentru eliminarea hidroxililor de pe suprafata, respectiv Al(OH) si apoi se raceste la temperatura de 130ºC. In continuare alumina racita este supusa dezactivarii prin adaus de 5% apa. In acest scop, 100 parti alumina se introduc intr-un balon cu dop rodat, se adauga 5 parti apa distilata, se acopera cu dopul, se agita energic si se lasa in repaus 4 ore pentru echilibrare. In aceasta forma alumina dezactivata poate fi folosita maximum 2 zile.
-p-metoxyazobenzen (p-benzenazoanisole; p-phenylazoanisole), respectiv, CH -O-C H N=NC H
Pentru prepararea solutiei de lucru, se dizolva 0,3 g substanta in 100 ml hexan si se pastreaza la intuneric.
Inregistrarea gazcromatografica
-Inregistrarea standardului:
Se verifica daca aparatul este in regim normal de lucru.
Se injecteaza 5 microlitri din solutia standard de lucru si se inregistreaza. Se repeta operatia de doua ori; se ia in calcul cea de a treia injectare ( inregistrare).
Picurile de pe cromatograma standard servesc ca elemente de referinta pentru calcularea rezultatelor, atit la probele ce se analizeaza cit si la probele de recuperare.
-Inregistrarea probei de recuperare:
Se injecteaza 5 microlitri si se inregistreaza. Procentul de recuperare se stabileste pe baza raportului intre inaltimea picurilor fata de standard.
-Inregistrarea probei blanc:
Se injecteaza 5 microlitri si se inregistreaza. In cazul in care pe cromatograma apar unele picuri cu timpi de retentie identici cu ai picurilor de pe cromatograma standard, dovedeste ca uleiul folosit ca proba blanc nu este liber de pesticide. In acest caz, inaltimea reala a picurilor de pe cromatograma probei de recuperare se corecteaza corespunzator.
-Inregistrarea probelor:
Se injecteaza pe rind cite 5 microlitri din fiecare proba si se inregistreaza. La mijlocul seriei de probe (intre proba a 5-a si a 6-a) se mai injecteaza un standard de lucru pentru verificare.
In cazul in care aparatura este prevazuta cu echipamente adecvate, injectarea se face automat. In cazul aparaturii clasice injectarea se face manual.
Durata unei inregistrari este de cca. 30 minute.
Calculul rezultatelor
In cazul aparaturii moderne rezultatele se calculeaza automat pe baza ariei picurilor si se inregistreaza pe banda.
In cazul aparaturii clasice, calculul rezultatelor se face pe baza inaltimii picurilor, prin masuratori pe cromatograma.
Calculul preliminar al rezultatelor probelor in lucru:
Se identifica picul fiecarui reziduu in parte pe cromatograma standard pe cromatograma probei (pe baza timpilor individuali de retentie) masurindu-se inaltimea ( de la linia de baza la virful picului) cu ajutorul riglei sau compasului cu ace, in mm.
Metoda gazcromatografiei modificata (dupa Stijve
Este o varianta modificata dupa metoda Stijve, la rindul ei modificata dupa metoda Langlois.
Se poate folosi pentru determinarea reziduurilor de pesticide organoclorurate din toate categoriile de produse alimentare de origine animala si vegetala, dar in mod particular pentru produsele din oua.
Principiul metodei
Proba supusa analizei se trece pe coloana de florisil partial dezactivat, se elueaza cu un amestec de eter de petrol-diclormetan si extractul astfel obtinut se evapora la sec. Extractul uscat se reia cu hexan, se trece pe alta coloana de florisil si se elueaza in doua fractiuni: prima fractiune cu hexan, cea de a doua cu un amestec de hexan-eter etilic, apoi fiecare fractiune este supusa cromatografierii.
Reactivi
-Hexan, pentru cromatografie.
-Eter de petrol p.a., purificat prin distilare pe coloana Vigreux sau Raschig.
-Eter etilic
-Diclormetan
-Amestec de elutie, format din 8 parti eter de petrol si 2 parti diclormetan (v/v).
-Amestec de elutie, format din 96 parti hexan si 4 parti eter etilic (v/v).
-Sulfat de sodiu anhidru p.a.
-Florisil 60-100 mesh, incalzit peste noapte (16-18 ore) la 550ºC si in continuare inca 5 ore la 130ºC.
Aparatura, sticlarie si materiale de laborator
-Coloanele cilindrice din sticla, cu robinet, de preferinta prevazute la partea inferioara cu rondea din sticla poroasa (in lipsa acesteia se poate folosi vata de sticla), avind diametrul interior de 22 mm si inaltimea de 30-40 cm.
-Coloanele cilindrice din sticla, cu robinet, avind diametrul interior de 8 mm si inaltimea de 20 cm.
-Eprubetele cilindrice gradate de 10 si 15 ml, cu dop din teflon.
-Pipete tip Pasteur, prevazute cu para mica de cauciuc (asemanatoare cu pipetele de instilare pentru ochi).
-Celelalte materiale, obiecte, sticlarie, aparatura si instalatii, ca la metoda A.O.A.C.
Metoda gazcromatografica A.O.A.C.
Metoda este foarte apropiata de cea descrisa la determinarea reziduurilor de pesticide organoclorurate, prezentind doar unele particularitati la extractia si purificarea reziduurilor si la inregistrarea gazcromatografica.
Inregistrarea gazcromatografica
Se lucreaza cu gazcromatograful Carlo Erba, tip Fractovap, model 2350-sau similar, cu urmatorul echipament si in urmatoarele conditii de lucru:
-Detector termoionic NPSD (KC1TD);
-Coloana de sticla, cu lungimea de 3 m si diametrul interior de 4 mm;
-Umplutura de coloana: 10% DC 200 pe Chromosorb WHP, 80-100 mesh;
-Gaz purtator: heliu;
-Gaze auxiliare (pentru flacara): hidrogen si aer;
-Concentratia solutiilor standard: 1-10 ng/microlitru;
-Calculul si raportarea rezultatelor, in aceleasi conditii ca si la organoclorurate.
Nota : in functie de dotarea laboratorului si de experienta specialistului se pot adduce unele modificari echipamentului si conditiilor de lucru, cum ar fi: coloana cromatografica cu alte caracteristici si dimensiuni; alta reteta de umplutura de coloana; alt gaz purtator; alte debite pentru gazul purtator si pentru cele auxiliare; alte concentratii ale solutiilor standard etc.
Metoda si tehnica de lucru se considera acceptabile, atunci cind procentul de recuperare este de cel putin 80%.
Determinarea dietilstilbestrolului (DES) prin gazcromatografie
In tesuturi, DES este present in special sub forma de compus monoglucuronid (DES-MG). Acest compus se formeaza in ficat si se elimina prin urina. Intrucit nivelele de acumulare sint de obicei scazute, este necesara o metoda foarte sensibila pentru detectare. Metoda ce se descrie, asigura un nivel de detectie de 2 ppb (0,002 ppm).
Principiul metodei
DES-MG se extrage din tesuturi cu metanol, extractul se centrifugheaza, iar supernatantul se colecteaza si se masoara (vol). Se evapora metanolul si DES-MG se trece in solutie apoasa la pH 5,0. Se hidrolizeaza cu betaglucuronidaza si DES-ul se extrage cu cloroform. Purificarea se face prin partitie intre solutia apoasa de hidroxid de sodiu si cloroform, iar identificarea prin gazlichidcromatografie in captura de electroni a derivatului trifluoroacetat de DES.
Este necesar ca citirea cromatografica sa se faca in ziua obtinerii extractelor purificate.
Analiza gaz-cromatografica a uleiurilor volatile de Valeriana
Una dintre cele mai importante parti ale lucrarii de fata a constat in studiul fitochimic
a unora dintre cele mai importante prinipii active din rizomii si radacinile de valeriana si
anume uleiul volatil si aciziil valerenici.
Pe parcursul acestor studii am urmarit influenta tipurilor de specii si soiuri/clone
analizate asupra acumularii uleiului volatil si a acizilor valerenic in radacinile de valeriana.
Analiza uleiurilor volatile de valerina s-a realizat prin tehnici gazcromatografice
utilizand doua tipuri de detectori (spectrometrul de masa (MS) si detectorul de ionizare in
flacara (FID)) si a presupus atat identificarea compusilor prezenti (analiza calitativa), cat si
cuantificarea acestora (analiza cantitativa).
Identificarea compusilor prezenti in uleiurile volatile s-a stabilit ca urmare a analizelor
complexe GC-MS in care au fost utilizate doua tipuri de coloane (de polaritati diferite) si doua
tehnici de ionizare a compusilor separati, respectiv ionizare prin impact electronic (70eV) si
ionizare chimica (CH4, NH3).
In urma analizelor efectuate, s-a demonstrat ca uleiul volatil analizat este un amestec
complex de mono-si sesquiterpenoide (au fost separati in medie 130 de compusi),
preponderent alcatuit din sesquiterpenoide, care de altfel sunt si cei mai importanti compusi
implicati in activitatea farmacologica.
Principalele hidrocarburi monoterpenice detectate in uleiul volatil au fost: α si β-
pinenul, α-fencenul, α-felandrenul. Pe langa hidrocarburi, in ulei au fost identificati si
compusi oxigenati monoterpenici cum ar fi: borneolul si esterii sai, mirtenolul si esterii sai,
diferiti alcooli ai terpinenului (1 sau 4 terpineol), linalool, eucaliptol, mentol sau camfor, iar
diferentele dintre speciile cultivate de valeriana sunt nesemnificative.
Uleiul volatil obtinut din plantele recoltate din flora spontana este mai sarac in compusi monoterpenici decat cel din speciile cultivate, insa si in acest caz reprezentantii
majoritari sunt prezenti.
Principala provocare a constat in identificarea compusilor sesquiterpenici (majoritari
in uleiul volatil). Pe baza rezultatelor obtinute, acestia au fost grupati in 4 mari subtipuri
structurale: tipul kessanului (kessan, α-kessil acetat si α-kessanil acetat), tipul valeranului
(alcooli (valerenol), aldehide (valerenal), acizi (acidul valerenic), esteri ai valerenolului cu
acizii acetic, izovaleric si hexanoic (Z/E - valerenil acetat, Z/E - valerenil izovalerat,
valerenil hexanoat)), tipul elemanului (elemenii (β, γ, δ), elemolul, germacrenii, valerianolul,
farnesenul, curcumenul sau bisabolenul) si tipul valeranonei (valeranona, 15-etoxivaleranona, sau alti compusi inruditi cum ar fi criptofauronolul, criptofauronilul acetat
si izovalerat), primele 2 fiind specifice radacinilor de valeriana.
In cazul compusilor separati, dar neidentificati, fost determinata masa moleculara si li s-a atribuit o formula bruta.
Prin compararea din punct de vedere calitativ a uleiurilor analizate se poate
concluziona ca diferentele de compozitie, fiind mai importante la plantele recoltate din flora
spontana. Exista unii compusi prezenti doar in uleiul volatil al acestor probe, pentru marea
majoritate insa, s-a atribuit doar formula bruta. Alti compusi au fost identificati fiind vorba de
terpene precum: α-patchoulenul, seychellenul sau 7-epi-α-selinenul.
Au fost identificate si alte clase de compusi volatili, antrenabili cu uleiul la
hidrodistilare si anume derivati fenilpropanici (eugenol si derivati ai acestuia), si acizi grasi
(acidul palmitic). Acesti compusi sunt prezenti in toate probele analizate.
Confirmarea structurilor identificate s-a realizat prin analiza cromatografica
suplimentara a uleiurilor, utilizand o colana de polaritate opusa si detectie MS (ionizare prin
impact electronic), separarea in acest caz fiind inferioare celei realizate pe coloana nepolara
(aprox. 70 de compusi). Schimbarea tipurilor de interactiuni cu faza stationara (concretizata
prin schimbarea parametrilor de retentie), a permis confirmarea structurii pentru unii compusi,
cum ar fi elemolul, globulolul, viridoflorolul.
Pe baza deteminarilor efectuate, se poate afirma ca din punct de vedere calitativ, in
toate speciile si soiurile/clonele de valeriana analizate, sunt prezenti compusii majoritari si ca
pentru cea mai mare parte din compusi s-a reusit identificarea si stabilirea unei structuri
chimice.
Determinarea cantitativa (metoda normalizarii ariilor) s-a realizat in urma separarii
compusilor pe coloana nepolara si utilizand ca metoda de detectie ionizarea in flacara (FID).
In urma determinarilor cantitative se poate concluziona ca exista diferente
semnificative in ceea ce priveste proportia dintre compusii uleiurilor volatile provenite de la
diferite specii cultivate in campul experimental al USAMV. Diferente si mai accentuate s-au
constatat la compararea speciilor cultivate cu specia Valeriana officinalis recoltata din flora
spontana. Cu exceptia plantelor recoltate din flora spontana, compusul majoritar al uleiurilor
provenite din soiuri/clone este acetatul de bornil.
In ceea ce priveste compusii specifici valerianei, se caracterizeaza prin concentratii
medii spre mari (1-10%) in plantele cultivate, in timp ce pentru plantele recoltate din flora
spontana sunt mult mai scazute (exceptie face α-kessanil acetatul, care realizeaza concentratii
superioare in plantele endemice).
Reprezentantii compusilor nespecifici radacinilor de valeriana (ex. valeranona), se
caracterizeaza de concentratii mici si medii 0,1-3% pentru plantele cultivate. Plantele recoltate
din flora spontana se caracterizeaza prin concentratii crescute de valeranona (compusul
majoritar 12,2%), criptofauronil acetat (4%) si a altor compusi neidentificati, cu mase variate,
separati la timpii de retentie diferiti.
In concluzie putem afirma ca diferentierea dintre specii, soiuri/clone si plante recoltate din diferite habitate se poate face pe baza compozitiei chimice. Totusi, trebuie mentionat faptul ca nu exista o regula dupa care se face acumularea principiilor active, dar ca in general se pare ca plantele care biosintetizeaza concentratii mai mari dintr-un compus au randamente mai scazute pentru altii.
BIBLIOGRAFIE
Nicolae Popescu, Gavrila Popa, Vasile Stanescu :
"Determinari fizico-chimice de laborator pentru produsele alimentare de origine animala", Editura CERES
|
