Raport de Cercetare

Raport de Cercetare

Grant: Crearea unei banci de gene la albina (Apis mellifera) prin conservarea materialului biologic

Autor: Drd. Man Mihai Calin

Universitatea de stiinte Agricole si Medicina Veterinara Cluj Napoca

Cresterea de matci face parte din cele mai fascinante si mai importante sarcini pentru dezvoltarea economica a apiculturii. Stapânirea tehnicii ei este importanta atât pentru crescatorii profesionisti, cât si pentru cercetatorii din domeniu. Numai aceasta face posibila dirijarea perpetuarii coloniilor de albine în directii bine determinate si includerea ei într-un program de lucru superior. La ora actuala exista nenumarate metode de crestere a matcilor performante, prin metode de lucru rationale. Între timp si cercetarea a reusit sa dea raspunsuri multor întrebari ce se aflau în spatele acestor metode.

Scopul acestui proiect a fost de a identifica acele metode care s-au afirmat în practica si de a le aplica în directia realizarii unei banci de gene si obtinerii de matci selectionate si însamântate artificial din sperma, ouale si/sau larvele conservate. Un aspect de loc de neglijat este si posibilitatea conservarii biodiversitatii, si în mod special a rasei noastre locale Apis mellifera carpatica, care nu trebuie sa uitam ca desi nu este înca unanim recunoscuta pe plan mondial, în viitor poate furniza gene prin transferul carora sa se dobândeasca rezistenta la anumite boli, astfel sa fie salvate si alte rase.

Practicarea însamântarilor artificiale, cu bune rezultete la unele specii, a fost conditionata de conservarea celulelor sexuale în afara organismului. În acest sens s 525g66f -au obtinut rezultate remarcabile, fiind elaborate numeroase metode si formule de conservare a acestora.

În cazul însamântarilor artificiale, diluarea si conservarea materialului seminal ocupa un loc principal deoarece prin aceste operatii se asigura conditii optime de pastrare si utilizare a spermei. Problema diluarii si a conservarii spermei a constituit si constituie si în prezent o preocupare permanenta a specialistilor, în vederea perfectionarii continue a metodelor actuale, în scopul mentinerii cât mai mult timp a capacitatii fecundante a spermei.

Prin perfectionarea metodelor de conservare si mai ales prin congelare, s-a reusit ca în prezent sa se efectueze numeroase schimburi de material seminal, iar în perspectiva exista semnale de intensificare a comertului international cu material seminal congelat. De asemenea, însamântarile artificiale au început sa ia amploare, existând tot mai multi apicultori care câstiga încredere si vor sa utilizeze matci valoroase si selectionate, însamântate instrumental.

În ceea ce priveste conservarea de oua si larve de albina situatia nu sta nici pe departe atâr de bine ca si în cazul materialului seminal. Pe plan mondial rezultate pozitive si multumitoare practic nu exista pâna în momentul actual. Acesta este domeniul pe care trebuie sa fie concentrate experientele viitoare, precum si stabilirea unui protocol de identificare si izolare a genelor (cu ajutorul tehnicilor de inginerie genetica) precum si un studiu al mediului biochimic si fiziologic al spermatecii, care face posibila supravietuirea spermatozoizilor pe o perioada de mai multi ani, eventual cercetarea activitatii antibacteriene, evident existenta in aceasta sau în materialul seminal.

O parte din studii s-au efectuat pe baza chestionarelor completate de apicultori. Aceste chestionare au continut si întrebari referitoare la directiile de ameliorare urmarite în judetul Cluj, bolile frecvente si, cel mai important pentru cercetarile noastre, zonele considerate cu cel mai valoros material biologic.

Pe baza fisei chestionar completate de apicultorii clujeni am constatat ca pentru majoritatea (95%), modalitatea cea mai comoda de obtinere a matcilor este din productie proprie, doar 5% achizitioneaza matcile. Acestia au declarat ca matcile sunt aduse din zona Vatra Dornei sau Iasi, acestea fiind o varietate mai rezistenta si cu trompa mai scurta. Vârsta de reforma a matcilor cel mai des întâlnita este mai mica de 2 ani, dar s-au întâlnit si cazuri în care a fost mai mare de 2 ani si chiar de 3 ani. Majoritatea apicultorilor executa selectia prin alegerea celei mai bune matci, iar o mare parte dintre ei, respective 40%, nu urmaresc înmultirea anuala a efectivului de albine.

Materialul biologic utilizat în cercetarile noastre apartine rasei Apis mellifera carpatica Foti, varietatea de deal. S-a format în conditiile specifice climei, reliefului si bazei melifere de la noi din tara. Varietatea din Podisul Transilvaniei are o trompa cu lungimea de 6,44 mm, însusire ce o situeaza între albinele sure de munte caucaziene si cele italiene. Se caracterizeaza printr-un comportament deosebit de linistit pe faguri în timpul cercetarii. Este putin predispusa la furt si are un instinct moderat de roire. În timpul roirii cladeste  cca 30-50 de botci si numai în cazuri exceptionale 200. Prezinta predispozitie accentuata pentru blocarea fagurilor cu miere, particularitate biologica care îngreuneaza întretinerea sa în stupi orizontali. Este o albina foarte productiva, productia de miere record a fost de 160 kg pe familie. Propolizeaza slab cuibul, este bine adaptata la conditiile din tara noastra, având însusirea de a sesiza venirea ploilor, situatie în care albinele se întorc la stup. Importata în Argentina s-a comportat mai bine decât albina locala.

În urma activitatii de recoltare a spermei de trântor am obtinut urmatoarele rezultate:

Conservarea in vitro a spermei de mamifere a facut posibila organizarea eficienta a unor banci de gene destinate selectiei si îmbunatatirii septelului. Tema de fata a fost abordata cu speranta ca aceasta va devini o realitate si în domeniul industriei apicole. În ultimii ani preocuparile cercetatorilor si a crescatorilor de albine au fost îndreptate catre obtinerea unui numar cât mai mare de matci cu însusiri biologice valoroase, la un pret de cost cât mai scazut. Ideea realizarii unei banci de gene la albine provine din necesitatea stocarii unor caractere valoroase, ce vor folosi la producerea matcilor necesare si ameliorarii populatiilor existente sau în scop stiintific.

Consideram realizarea unei banci de gene la insecte este de maxim interes atât pentru inginerii zootehnisti si biotehnologi, cât si pentru toti apicultorii din tara.  Selectia în apicultura constituie sectorul cel mai înapoiat al activitatii stiintifice si practice, ceea ce este demonstrat prin lipsa raselor performante de albine create ca urmare a unei activitati dirijate. Cauzele principale ale acestei stari sunt determinate de elaborarea insuficienta a aspectelor teoretice de selectie si lipsa unei banci de gene pentru stocarea materialului biologic valoros. Intentia noastra este de a organiza "Banca de gene" astfel încât ea sa ofere materialul biologic necesar ameliorarii acestei specii. Procesul de ameliorare al albinelor este mai dificil de realizat comparativ cu alte specii, datorita unor particularitati biologice specifice, dar ar fi mult usurat prin stocarea materialului biologic provenit de la indivizi din familii cu însusiri valoroase. Principalul obiectiv este identificarea unor metode eficiente de imbunatatire a productiilor albinelor in directii cum ar fi cresterea productiilor si a comportamentului igienic sau scaderea agresivitatii si a instinctului de roire. Ameliorarea albinei melifere presupune controlul ascendentei. Prin selectie se permite anumitor tipuri de indivizi sa produca mai multi descendenti decât alte tipuri. Pentru a putea realiza un progres genetic important într-o poulatie este neaparat nevoie de a crea niste stocuri de material biologic provenit de la indivizii valorosi. Stocarea genotipurilor cu o valoare de exceptie, pe lânga perfectionarea rasei Apis mellifera carpatica, poate sa aduca si alte avantaje cum ar fi fluidizarea si simplificarea comertului international cu material biologic cu o valoare genetica ridicata. Constituirea de banci criogenice are ca scop atât conservarea biodiversitatii prin prezervarea genotipurilor valoroase cât si a speciilor sau raselor aflate într-un real pericol de disparitie. Pentru aceasta consideram foarte important realizarea acestui prim pas.

În acest scop ne-am propus sa experimentam mai multe variante de recoltare a materialului biologic provenit de la albine si sa evaluam rezultatele obtinute în urma fiecareia. Tehnicile de recoltare  cu cele mai bune rezultate vor fi urmate de conservarea materialului biologic, dar nu înainte de a pune la punct detaliile privitoare la asa numitele "variabile ale criobiologiei", de care independent sau în combinatie, depinde supravietuirea sau moartea celulelor supuse crioconservarii. Acestea sunt

- tipul si concentratia agentului crioprotector,

- modul de formare a cristalelor de gheata intracelulare,

- rata scaderii temperaturii de la -5 ^oC la - 70 ^oC,

- temperatura de stocare a probelor biologice crioconservate,

- rata decongelarii probelor de la temperatura de -70 ^oC la cea de

-5 ^oC,

- tehnica evacuarii agentului crioprotector din celulele supuse criostocarii.

În paralel cu crioconservarea gametilor si embrionilor, se perfectioneaza si tehnicile de conservare de scurta durata, la temperaturi de refrigerare 2-5 ^oC, si la temperatura camerei.

Activitatea de cercetare a fost axata, la început pe stabilirea unor tehnici de recoltare a oualor de albina din fagure, fara a le deteriora, tinându-se cont de factorii care pot influenta reusita conservarii lor, urmând ca în faza a doua sa stabilim metoda optima de stocare.

În continuare a trebuit sa fie determinat agentul protector cel mai potrivit. Acestuia trebuie sa i se stabileasca continutul în substante nutritive necesar activarii si mentinerii metabolismului oualor, cantitatea de antibiotice necesara aseptizarii lor si pH-ul potrivit. De asemenea acesta trebuie sa contina substante crioprotectoare în cazul congelarii în azot lichid, sa aiba un pret de cost redus si durata de pastrare si stabilitatea cât mai mari.

Dupa aceste faze, urmeaza experimentarea diferitelor tehnici de conservare pentru a fi stabilita cea mai potrivita în acest caz, de asemenea recipientul în care urmeaza a fi conservate. Se vor lua în studiul conservarea la temperatura camerei, prin refrigerare si prin congelare, în functie de durata scurta sau lunga ce urmeaza a fi stocate. De asemenea au fosti urmarite aspectele legate de tipul de celule si influenta sexului oualor asupra conservarii.

În ultima etapa a cercetarii au fost obtinuti produsi din materialul biologic conservat, utilizând însamântarea instrumentala.

Cresterea matcilor tinere îsi are locul ei bine stabilit în ciclul anual al familiei de albine. Ea nu poate avea loc permanent ci este legata de anumite conditii si factori de declansare. O colonie de albine "normala" nu creste matci tinere. Activitatea crescatorilor de matci se orienteaza tocmai asupra cercetarii la nivel optim a acestor premise în colonie si a utilizarii rationale a factorilor de declansare. Cresterea de matci ca atare este o problema a coloniei de albine

Daca ar fi sa dam o definitie foarte superficiala, o familie de albine se compune din matca, un numar variabil de albine lucratoare, în anumite perioade ale anului un numar esential mai redus de trântori, puiet în diferite stadii si faguri cu rezerve de hrana. Dar prin structura ei intensa colonia de albine este o formatiune foarte complexa, în cadrul careia exista înca multe aspecte nelamurite sau controversate. Totusi se poate spune ca esenta cercetarilor în domeniu este reprezentata de relatiile multiple dintre albinele lucratoare si între ele si matca sau puiet.

Relatiile dintre lucratoare si matca sunt cele care fac, în primul rând, obiectul studiului din acest an. Lucratoarele sunt cele care dirijeaza si îndeplinesc functiile vitale prin curatirea unor zone de fagure disponibile; restrângerea suprafetei de puiet prin reducerea cantitatii de laptisor de matca sau prin îndepartarea unei parti din oua si larve; hotarârea cantitatii de puiet de trântor si cea de crestere a unor matci tinere; intensitatea activitatii de cules.

Daca lucratoarele detin în mod direct functiile hotarâtoare din colonia de albine, matca exercita la rândul sau o influenta cel putin tot atât de mare. Numai în prezenta matcii lucratoarele pot sa-si exercite functiile vizând colectivitatea. Matca este punctul de referinta central, obligatoriu pentru îndeplinirea sarcinilor biologic necesare. Într-o colonie orfana înceteaza activitatea de crestere, scade randamentul de cules si dispozitia de aparare precum si coeziunea coloniei. Fenomenele care apar dupa pierderea matcii au un caracter aproape dramatic. Crescatorii de matci au învatat ca tocmai de aceste fenomene trebuie sa profite, familiile orfane facând obiectul multor studii comportamentale.

La câteva ore dupa îndepartarea matcii unele celule cu puiet tanar de lucratoare sunt deja aprovizionate mai abundent cu laptisor. Dupa 24 de ore larvele din acestea înnoata în laptisor iar celulele respective sunt transformate în botci. Se pare ca numarul de botci astfel construite estre o unitate de masura corecta pentru cantitatea de laptisor disponibila.

La 3-4 zile dupa orfanizare în tuburile ovariene ale unor lucratoare apar semne vizibile ale dezvoltarii ovocitelor. Dupa 10 zile exista oua complet dezvoltate. În cazul raselor europene primele oua sunt depuse dupa 30 de zile, la alte rase mult mai repede. Aceste aspecte pot fi exploatate în directia producerii trântorilor.

În functie de motivul pentru care albinele încep sa creasca matci acestea se pot diferentia în matci de roire, matci de salvare sau matci de înlocuire linistita.

Este frecventa parerea ca fiind vorba de procedeee diferite si rezultatul este diferit. Numitorul comun al proceselor care duc la cresterea de noi matci este deplasarea echilibrului coloniei în favoarea lucratoarelor. Aceasta deplasare se realizeaza foarte repede dupa ce semnalul emis de matci dispare complet. Toate procesele si corelatiile de cauzalitate ce intervin în înlocuirea naturala a matcilor sunt importante pentru cresterea lor indusa artificial.

Insamântarea artificiala. Pentru utilizarea curenta aparatele de însamântat trebuie sa fie cât mai simple si sigure. În prezent, exista mai multe firme ce produc astfel de aparate. În vederea însamântarii, camera acului matcii trebuie sa fie facuta accesibila. Matca se fixeaza în stativ introdusa într-un tubulet, cu capul în jos. Blocul matcii înlesneste si alimentarea cu gaz si fixarea unghiului de însamântare. Suportul pentru matca se compune dintr-un tub de rasina acrilica treansparenta. La unul din capete deschiderea are 6,6 mm, la celalalt se îngusteaza pâna la 4,8 mm, diametrul interior.

S-a dovedit ca cel mai bine se lucreaza când axul matcii formeaza cu verticala un unghi de aproximativ 30^o. Seringa poate avea aceeasi înclinatie ca si matca sau putin mai mare.

Camera acului matcii fixate se deschide cu ajutorul a doua cârlige fine. Cârligul din partea stânga îndeplineste functia de prindere si departare a ultimului sternit al matcii. Cârligul din partea dreapta are rol de prindere a acului matcii si ridicare a lui. Ghidarea cârligelor se face cu ajutorul mânerelor prin intermediul a doua articulatii cu bile. De un cârlig al acului bun depinde în mare masura reusita însamântarii.

Seringa este simpla, pistonul din interior fiind înlocuit de lichid. Schimbarea de presiune pentru absorbtie, respectiv evacuare, sunt provocate de miscarile unei membrane de cauciuc. Seringa permite introducerea unei rationalizari în munca, utilizând mai multe în acelasi timp, fiecare continând sperma necesara însamântarii a 2-3 matci.

Daca doua persoane lucreaza în echipa, munca de recoltare a materialului seminal si cea de însamântare pot fi separate. O echipa de trei persoane poate lucra pe "banda rulanta": un specialist se ocupa de însamântare, un altul preleveaza sperma în mai multe seringi si un apicultor aduce matcile si trântorii necesari, apoi reintroduce matcile însamântate în nucleele lor. În acest mod randamentul creste substantial.

Seringa de însamântare este deplasata mecanic printr-un angrenaj fin. Se introduce în sina unui bloc de ghidare din plexiglas si se însurubeaza. Întregul bloc este fixat pe aceeasi coloana de stativ pe care se afla si cârligul acului. Înainte sau dupa introducerea vârfului în vagin este posibil ca aceste sa trebuiasca ridicat putin si apoi coborât. Vârful trebuie sa treaca de valvula vaginalis. Dirijarea acestor miscari se face printr-un surub de reglare, actionat în felul urmator:

se împinge putin vârful seringii în deschiderea vaginului;

se îndreapta putin catre partea ventrala prin rasucirea surubului de reglare;

se trece prin fata valvulei vaginalis în oviductul median;

Bioxidul de carbon necesar pentru narcozarea matcii se obtine din butelii de diverse tipuri constructive. Pentru micsorarea presiunii este necesar un ventil de reducere cu manometru. Furtunul din PVC, prin care se face alimentarea, este bine sa fie întrerupt si trecut printr-un vas cu apa. Astfel curentul de gaz se poate regla dupa frecventa si sunetul bulelor de gaz ce se ridica.

Microscopul este suficient daca mareste de 20 de ori. Sunt însa importante optica si stativul. Trebuie sa aiba loc aparatul de însamântare, distanta de lucru trebuie sa fie suficient de mare ca sa permita manipularea nestânjenita si caderea luminii într-un unghi cât mai înclinat posibil. Tubul trebuie instalat atât de sus încât câmpul de vizibilitate sa fie instalat deasupra extremitatii superioare a suportului pentru matca.

Foarte importanta este luminarea alba, rece, a matcii. Se utilizeaza lampi de microscopie de 6 V, majoritate aparatelor moderne fiind prevazute cu filtre de caldura. Lumina se poate concentra asupra unui câmp limitat în care luminozitatea este mult mai mare.

Vârfurile din sticla au fost deja folosite înaintea celor confectionate din acril. Ele pot fi confectionate cu un diametru mai fin decât vârfurile din material plastic si sunt mai ieftine. În plus au suprafetele mai netede si posibilitatea de a rani matca mai redusa. Sunt mai usur de curatat si dezinfectat, dar si mai fragile si mai greu de fixat în capatul seringii.

Pentru a se deprinde în mod corect tehnica întamântarii instrumentale a matcilor este indicata învatarea pe lânga o persoana experimentata. Masurile de precautie care trebuie sa fie respectate sunt urmatoarele:

matcile sa fie crescute în conditii optime, pentru a fi de dimensiuni cât mai mari.

daca matcile dintr-o anumita susa sunt greu de însamântat, se încearca alta susa. Susele si rasele difera foarte mult în ceea ce priveste usurinta de a le însamânta. La unele, pliul valvei este deseori vizibil, iar la altele niciodata.

Vârful seringii trebuie sa fie atât de fin încât sa intre usor în oviductul comun; în acelasi timp el trebuie sa aiba un diametru interior cât se poate de mare. Gasesc ca un diametru exterior de 0,25 mm si un diametru interior de 0,15 mm este satisfacator pentru uzul curent (masuratori facute înainte ca vârful sa fie slefuit). Începatorii lucreaza mai bine cu o seringa al carei diametru exterior este de 0,23 mm. Diametrul interior trebuie sa fie atunci în jur de 0,13 mm, dimensiune aproximativ egala cu diametrul interior minim posibil. Diametrul exterior pâna la 0,3 mm poate fi satisfacator pentru matcile mai mari.

Diametrul interior al vârfului seringii începe sa se largeasca imediat în interiorul capului: e mai usor sa se traga sperma printr-o astfel de seringa decât printr-una care are diametru uniform pe toata distanta.

Se lucreaza - daca se poate - în atmosfera umeda. În atmosfera uscata tesuturile expuse ale matcii se usuca repede, ceea ce face ca introducerea seringii sa se faca mai greu; de asemenea, sperma poate sa se usuce la capatul seringii, împiedicând aspirarea unei cantitati suplimentare. Din când în când, daca este nevoie, vârful trebuie umezit cu o solutie de streptomicina îmbibata pe o celofibra sterila.

Desi sunt multe metode de întretinere a matcilor de la eclozionare pâna în momentul însamântarii, acumularea de fecale care se produce în unele cazuri, împiedica însamântarea; de exemplu, un rect dilatat deplaseaza aparatul reproducator din locul lui ceea ce face ca vârful seringii sa gaseasca mai greu intrarea spre oviduct si, de asemenea, îngreuneaza izolarea acului. Acumularea de fecale este mai mica, în ordine descrescatoare, în cazul urmatoarelor metode:

(1) mai multe matci în custi, în însasi colonia crescatoare;

(2) o singura matca închisa în cusca, într-un nucleu de împerechere;

(3) o singura matca libera în nucleu de împerechere.

Evident, pentru începatori metoda (3) este cea mai buna. Se poate încerca fortarea unei matci cu punga rectala plina sa defece, prin zborul la geam. Chiar daca nu se înregistreaza întotdeauna un succes, procentul mare de succese justfica încercarea.

Operatorul cu experienta poate folosi o marire la microscop de 10 ori pâna la 12 ori în timp ce umple seringa si o introduce în matca. Pentru începator, se recomanda un sistem de marire de putere mai mica (6 - 10 ori) pentru încarcarea seringii si o putere mai mare (20 ori) pentru introducerea ei.

Începatorul va învata mai întâi prelevarea spermei în seringa, si abia dupa aceea va începe sa lucreze cu matcile. În acest timp el va dobândi experienta în alegerea si tratarea trântorilor si în obtinerea spermei mai pure, neamestecata cu mucus. Abia atunci când pentru umplerea unei seringi cu 8 µl sperma îi sunt suficiente 15 minute (un tehnician experimentat are nevoie de jumatatea acestui timp) va începe sa se ocupe de matca.

În manevrarea matcii va exersa mai întâi utilizarea cârligelor, dupa aceea va încerca însamântarea cu o solutie salina. Se poate folosi si aceeasi matca la mai multe încercari, dar nu prea des în aceeasi zi.

Recoltarea spermei a fost executata în urmatorul mod: Am pregatit seringa pentru recoltare umplându-i vârful cu solutie salina. Ca solutie salina am folosit solutia fiziologica a lui Hyes (9 g clorura de sodiu, 0,2 g clorura de calciu, 0,2 g clorura de potasiu, 0,1 g hidrocarbonat de sodiu, totul dizolvat în 1000 ml apa distilata). Dupa aspirarea unei picaturi de solutie salina se aspira o mica bula de aer si se poate începe recoltarea. Trantorul care a ejaculat se pozitioneaza la vârful siringii sub microscop. Dupa realizarea contactului se aspira separat sperma de secretia glandelor anexe. Se evita plasarea capatului seringii în mucus, precum si colectarea acestuia. Între doua recoltari se lasa un gol de aer si se aspira putina solutie salina pentru a evita uscarea.

Am efectuat trei recoltari de sperma la mai multi trântori de 14, 21 si respectiv 30 de zile. Un procent de 60% dintre ei au ejaculat, cantitatea medie de sperma fiind de 1,3 l. Reactia spermei a fost neutra (pH 6,8), numarul spermatozoizilor la 1 l de sperma de aproximativ 7,6 milioane. Numararea spermatozoizilor am realizat-o cu ajutorul unei camere de numarat pentru hematii.

Selectia în apicultura constituie sectorul cel mai înapoiat al activitatii stiintifice si practice, ceea ce este demonstrat prin lipsa raselor performante de albine create ca urmare a unei activitati dirijate. Cauzele principale ale acestei stari sunt determinate de elaborarea insuficienta a aspectelor teoretice de selectie si lipsa unei banci de gene pentru stocarea materialului biologic valoros.

Proiectul are ca scop lamurirea catorva aspecte referitoare la cresterea matcilor necesare producerii gerplasmului pentru infiintarea unei banci de gene la albina (Apis mellifera) prin utilizarea tehnicilor de conservare a materialului biologic, cu ajutorul careia vom aduce o contributie la ameliorarea rasei locale (Apis mellifera carpatica). Intentia noastra este de a organiza "Banca de gene", astfel încât ea sa ofere materialul biologic necesar ameliorarii acestei specii.

Cheia succesului în conservarea materialului biologic de albina este foarte posibil sa se gaseasca în spermateca. Prin studiul mediului biochimic si fiziologic care face posibila supravietuirea spermatozoizilor timp de mai multi ani în aceasta, se poate gasi si modalitatea optima de conservare pe termen lung a materialului seminal.