DETECTIA PESTICIDELOR UTILIZAND BIOSENZORI SERIGRAFIATI PE BAZA DE PRUSSIAN BLUE

DETECŢIA PESTICIDELOR UTILIZÂND BIOSENZORI   SERIGRAFIAŢI PE BAZĂ DE PRUSSIAN BLUE

Introducere

Aceasta lucrare de laborator prezinta o noua metoda de determinare a pesticidelor organo-fosforice si carbamice din apa utilizând electrozi serigrafiati modificati cu Prussian Blue.

Pesticidele se numara printre cei mai importanti poluanti ai mediului datorita toxicitatii mari si prezentei lor extinse în mediul înconjurator. De la cel de al Doilea Razboi Mondial, a crescut mult utilizarea pesticidelor în agricultura odata cu cresterea productiei mondiale de alimente. În acest context, emisiile de pesticide din timpul producerii lor, si mai important prezenta reziduurilor acestor substante si a metaboliti 919g61j lor lor în alimente, apa si sol a devenit o problema sociala de larg interes [1]. Printre numeroasele metode utilizate pentru determinarea pesticidelor, metodele cromatografice cum ar fi Cromatografia de Lichide de Înalta Performanta (HPLC) sau Cromatografia de gaze (GC) sunt utilizate ca metode de referinta [2,3]. Metodele enzmatice au fost adoptate ca alternative la metodele clasice pentru determinarea mai simpla si mai rapida a unor poluanti ai mediului [4,5].

Utilizarea enzimelor colinesterazice pentru determinarea bazata pe inhibitie a poluantilor au demonstrat un mare potential pentru analiza de screening a mediului [6-8]. Colinesteraza exista în sistemul nervos si în celulele rosii ale sângelui si joaca un rol fiziologic important, fiind responsabila de hidroliza acetiltiocolinei, un neurotransmitator ce opereaza la nivelul sinapselor nervoase. Reactia de hidroliza enzimatica a acetiltiocolinei în prezenta acetilcolinesterazei (AChE) este urmatoarea:

_AChE

CH₃COO(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃Cl^- + H₂O CH₃COOH + HO(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃Cl^- (1)

AChE este inhibata ireversibil de pesticidele organo-fosforice si carbamice, iar compararea activitatii enzimatice a acesteia înainte si dupa expunerea la proba analizata poate furniza infomatii privind nivelul poluarii. Masurarea activitatii enzimatice poate fi realizata utilizând metode electrochimice [6-9], chemiluminometrice [10] sau spectrofotometrice [11, 12]. În ultimii ani, o mare atentie a fost acordata proiectarii de biosensori electrochimici integrati pentru determinarea compusilor inhibitori ai activitatii colinesterazelor. Determinarea amperometrica a pesticidelor este mai precisa si mai sensibila comparativ cu determinarea potentiometrica care se bazeaza pe masurarea acidului acetic rezultat în urma hidrolizei enzimatice. A fost dezvoltat un sistem amperometric bi-enzimatic ce utilizeaza AChE impreuna cu colinesteraza (ChOD). În acest sistem colina rezultata în urma hidrolizei enzimatice este apoi oxidata de ChOD, produsul electrochimic activ (H₂O₂) fiind determinata amperometric.

_ChOD

HO(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃Cl^- + O₂ HOOC(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃Cl^- + H₂O₂ (2)

Biosenzorul utilizat în aceasta lucrare se bazeaza pe utilizarea unui traductor modificat cu Prussian Blue (PB) ce este cuplat cu AChE ca enzima, si cu acetiltiocolina ca substrat enzmatic. Tiocolina produsa în urma reactiei enzimatice este masurata utilizând electrozi serigrafiati (screen-printed electrodes, SPE) modificati cu PB. Masuratorile se realizeaza în picatura, la un potential de + 200 mV fata de electrodul de referinta de Ag/AgCl.

Efectul electrocatalitic al PB fata de tioli a fost discutat pentru prima data într-o lucrare anterioara [13].

Parte experimentala

Pricipiul metodei

Calitatea PB de catalizator a fost combinata cu tehnologia serigrafierii pentru constructia de senzori cu caractestici superioare pentru determinarea amperometrica a tiocolinei. Biosensorul pentru determinarea pesticidelor este bazat pe urmatoarea reactie:

_AChE

CH₃COS(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃Cl^- + H₂O CH₃COOH + HS(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃Cl^-

În urma reactiei enzimatice se produce ticolina, care este oxidata la electrodul modificat cu PB. Se utilizeaza electrozi serigrafiati modificati cu PB acoperiti cu o membrana enzimatica.

Reactivi

glutarladehida 25 % (solutie apoasa);

Nafion;

Aceticolinesteraza (AchE) (EC 3.1.1.7) 244 U/mg;

Hexacianoferat de potasiu;

Clorura ferica;

Paraoxon (dietil-p-nitrofenilfosfat).

Ca tampon de lucru s-a utilizat tamponul fosfat de poatasiu salin (0,05 M ce contine KCl 0,1 M, pH 7,4).

Toti reactivii folositi trebuie sa fie de puritate analitica.

Aparatura

Determinarile se realizeaza utilizând un potentiostat portabil PalmSens Electrochemical Sensor Interface (Palm Instruments BV, Olanda).

Prepararea electrozilor

Electrozii serigrafiati utilizati sunt preparati cu o masina de serigrafiat 245 DEK (Weymouth, Anglia), utilizând pentru imprimarea electrodului de lucru o cerneala pe baza de grafit (Electrodag 421) produsa de Acheson Italiana (Milano, Italia). Serigrafierea se realizeaza pe un suport flexibil format dintr-un film de poliester (Autostat HT5) obtinut de la Autotype Italia (Milano, Italia). Electrozii sunt produsi în folii de câte 20. Diametrul electrodului de lucru este de 0,3 cm, ceea ce determina o arie geometrica aparenta de 0,07 cm², contra-electrodul este pe baza de cerneala grafitica, iar electrodul de referinta este de clorura de argint.

Modificarea electrozilor cu Prussian Blue

Electrozii serigrafiati sunt modificati prin plasarea unei picaturi (10 mL) de solutie precursor pe suprafata electrodului de lucru. Aceasta solutie este obtinuta prin amestecarea a 5 mL de FeCl₃ 0,1 M preparat în HCl 10 mM cu 5 mL de K₃[Fe (CN) ₆] 0,1 M preparat în HCl 10 mM. Picatura trebuie plasata cu atentie numai pe suprafata electrodului de lucru astfel încât sa se evite formarea PB pe electrodul de referinta sau pe contra-electrod, fapt care ar duce la cresterea apreciabila a rezistentei interne a sistemului. Dupa 10 minute, electrozii sunt clatiti cu 3 mL HCl 10 mM. Electrozii sunt apoi lasati 90 min în etuva la 100 °C pentru a obtine un strat activ si stabil de PB. Electrozii modificati cu PB se pastreaza uscati, la temperatura camerei si la întuneric.

Imobilizarea acetilcolinesterazei

Acetilcolinesteraza a fost imobilizata pe suprafata electrozilor modificati cu PB utilizând metoda legarii încrucisate. Astfel, 4 mL de amestec glutaraldehida 1 % în apa, Nafion 5 % în alcool, BSA 3 % în apa si AChE 0,01 U au fost lasati sa se usuce aproximativ 30 min pe suprafata electrodului de lucru. Dupa preparare biosenzorii au fost pastrati în tampon la 4 °C.

Procedura de determinare a pesticidelor

Determinarea pesticidelor se bazeaza pe masurarea activitatii enzimatice înainte si dupa punerea în contact a biosenzorului cu proba. Masurarea activitatii enzimatice înainte de punerea în contact cu proba se realizeaza dupa cum urmeaza:

mL de tampon sunt plasati pe electrod, dupa care se aplica un potential de + 200 mV vs. Ag/AgCl si se înregistraza curentul (aprox. 5 nA). Dupa efectuarea masuratorii solutia tampon este îndepartata de pe suprafata biosenzorului.

mL de tampon de lucru ce contine tiocolina 3 mM sunt adaugati pe electrod si se înregistreaza curentul (aproximativ 80 nA). Curentul obtinut ce se datoreaza oxidarii ticolinei se obtine facând diferenta dintre curentul înregistrat în etapa 2 minus cel înregistrat în etapa 1. Valoarea obtinuta corespunde enzimei neinhibate (I₀).

Biosenzorul este spalat cu solutie tampon si se incubeaza timp de 30 min în 5 mL proba, sub agitare. În timpul incubarii AChE este inhibata daca în proba exista pesticide.

Dupa aceasta, biosensorul este spalat cu tampon si se repeta a doua etapa, înregistându-se activitatea enzimatica reziduala.

Curentul datorat oxidarii ticolinei, produs dupa inhibarea enzimei, este dat de diferenta dintre curentul înregistrat în etapa 4 minus cel înregistrat în etapa 1 (I₁).

Inhibitia procentuala se calculeaza pe baza urmatoarei formule:

I%= [(I₀-I₁)/I₀]·100

Reactivarea biosensorului

Acest tip de senzori sunt de unica folosinta, dar este posibila masurarea pesticidelor de mai multe ori utilizând acelasi electrod. Practic, este posibila utilizarea aceluiasi biosensor reactivând enzima cu piridin-2-aldoxima methocolura (2-PAM). Dupa fiecare proba analizata, biosensorul se spala cu apa distilata si se relizeaza regenerarea lui prin plasarea pe acesta a unei picaturi de solutie 2-PAM 5 mM timp de 30 sec. Apoi, biosensorul este spalat si o alta picatura de solutie tampon ce contine substratul enzimatic este adaguata pe suprafata senzorului pentru masurarea activitatii enzimei regenerate. Acest procedeu permite utilizarea unui biosenzor de mai multe ori.

Pentru masurarea unei concentratii necunoscute de pesticid prezent în apa este necesara parcurgerea tuturor celor patru etape si respectiv, calcularea inhibitiei procentuale. Concentratia pesticidului se calculeaza folosind curba de calibrare ce ar trebui obtinuta înainte de analizarea propriu-zisa a probelor.

Modul de lucru

Curba de calibrare este necesara pentru masurarea si calcularea inhibitiei pentru urmatoarele concentratii de paraoxon: 0, 10, 20, 30, 40 si 50 ppb. Solutiile de paraoxon se prepara în apa distilata si se urmeaza etapele 1-4 ale procedurii prezentate anterior. Gradul de inhibitie ale biosenzorului în functie de concentratia paraoxonului se reprezinta grafic si se calculeaza parametrii dependentei lineare rezultate.

Analiza probei si calcularea concentratiei pesticidului. Doua probe de apa potabila în care a fost adaugat paraoxon vor fi analizate pentru determinarea concentratiei pesticidului. Inhibitia enzimatica calculata pentru fiecare proba va fi introdusa în ecuatia calculata anterior si se calculeaza concentratia paraoxonului din fiecare proba.

Bibliografie

1. FAO, Agriculture towards 2010, in: C 93/94 Document of 27^th Session of the FAO Conference, Rome, 1993.

2. Standard methods for examination of water and wastewater 20^th ed.; American Public Health Association; Washington,1998; pp 6/85-6/90.

3. Liska I.; Slobodnik J. J.Cromatogr.A, 1996, 733, 235-258.

4. Preininger C.; Wolfbeis O.S. Biosens. Bioelectron, 1996, 11, 981-990.

5. Bagirova, N.A.; Shekhovtsova, T. N.; van Huystee, R. B., Talanta,

6. Bernabei M.; Chiavarini S.; Cremisini C.; Palleschi G., Biosens. Bioelectron, 1993, 8, 265-271.

7. Cremisini, C.; Di Sario, S.; Mela, J.; Pilloton, R.; Palleschi, G., Anal. Chim. Acta,

8. Hart A.L.; Collier W.A.; Janssen D., Biosens. Bioelectron,

9. Solč S.; Merkoci A.; Alegret S., Crit. Rev. in Anal. Chem., 7, 2003, 33(2), 9-126.

10. Danet A.F.; Badea M.; Aboul-Enein H.Y., Biopolymers (Biospectr.)

11. Pogačnik L.; Franko M., Biosens. Bioelectron,

12. Ellman, G.L.; Courtney K.D.; Andres V; Featherstone R.M., Biochem. Pharmacol

13. Ricci, F.; Arduini, F.; Amine, A.; Moscone, D.; Palleschi, G., J. Electroanal. Chem. 2004, 563, 229-237.

14. Ricci, F.; Amine, A.; Tuta C.; Ciucu A., Lucarelli F.; Palleschi, G., Anal. Chim. Acta 2003, 485, 111-120.