DETERMINAREA ALACHLORULUI UTILIZÂND TEHNICA DIRECTĂ ELISA
Introducere
Aceasta metoda permite evaluarea cantitativa a alachlorului din apa utilizând tehnica ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Alachlorul face parte din Grupa I a compusilor ce determina efecte acute pentru sanatate si la concentratii mici. Determinarea este simpla si poate fi adaptata la utilizarea ca metoda de screening în punctele de prelevare a probelor.
Tehnica ELISA directa implica de obicei imobilizarea anticorpilor prin simpla absorbtie pe suprafata godeurilor placilor de analiza, urmata de adaugarea analitu 131e46b lui (alachlor) si a antigenului (analitului) marcat (alachlorului derivatizat marcat cu peroxidaza (HRP)) care va începe sa competitioneze pentru zonelor active ale anticorpului (anticorp specific pentru alachlor din oaie, purificat).
Utilizând un substrat mixt specific pentru antigenul marcat (în cazul nostru exp: 3,3', 5,5' - tetrametil benzidina si H2O2 în solutie tampon acetat 50 mM, pH-ul 5,2), concentratia analitului reactionat poate fi evaluata indirect prin determinarea concentratiei fractiei legate de marker.
Detectia spectrometrica la 450 mm permite determinarea cantitativa a alachlorului prin tehnica directa ELISA. Metoda este aplicata pentru determinarea alachlorului în probele de apa (de exemplu: apa potabila, apa de suprafata, amestecuri de ape reziduale menajere si industriale, ape subterane, apele reactive.
Acidul 2-[(2,6-dietil-fenil)(metoximetil)amino]-2-oxo-etan-sulfonic (ESA) interfera (cross reacts) cu alachlorul în tehnica ELISA. ESA nu este detectat ca standard HPLC sau GC [2].
Acetanilide înrudite cu alachlorul, pot interfera de asemenea în determinarea alachlorului. Pentru a preveni eventualele erori în analize, reactivitatea încrucisata (the cross reactivity) a anticorpului utilizat va fi evaluata pentru posibile interferente.
Aparatura
Micro placi cu 96 godeuri (NUNC, Brand Products).
Cititor universal pentru micro placi (EL800, Bio-tek Instruments INC)
Pipeta automata cu mai multe capete (8 pozitii).
Recoltarea, conservarea si depozitarea probelor
Probele se recolteaza în sticle de 40 mL în care s-au adaugat 3 mg tiosulfat de sodiu cristale înainte de a fi transportate de la locul de prelevare. La prelevarea apei de la robinet se va deschide robinetul pentru a permite curgerea pâna la stabilizarea temperaturii apei (1 - 2 minute). Se ajusteaza debitul la aproximativ 500 mL/min si se recolteaza proba din curentul de curgere. Proba se pastreaza sigilata (etansa) de la colectare pâna la analiza.
La prelevarea dintr-o masa de apa, se umple vasul de recoltare dintr-o zona reprezentativa. Echipamentul de prelevare a probelor inclusiv cele automate trebuie sa nu aiba tuburi de plastic, garnituri de plastic sau alte parti din plastic, din care pot se pot extrage prin dizolvare compusi ce pot interfera cu analitul din proba. Sondele de recoltare automatizate în care sunt pastrate probele o perioada mai lunga de timp vor utiliza vase de sticla racite.
Clorul rezidual din proba trebuie redus prin adaugarea a 50 mg/L sulfit de sodiu (poate fi adaugat solid cu agitare si amestecare pâna la dizolvare, sau preparat ca solutie).
Se ajusteaza pH-ul la 2 cu solutie 6 N de HCl. Sunt necesari peste 4 mL pentru a se realiza ajustarea.
Este foarte important ca proba sa fie declorurata înainte de a se adauga acidul pentru scaderea pH-ului. Nu este permisa adaugarea sulfitului si a acidului în sticle înainte de prelevarea probei. Acidul clorhidric trebuie adaugat probei la locul de prelevare pentru a întârzia orice degradare microbiologica a analitului. Proba trebuie înghetata sau racita la 4oC de la recoltare pâna la extractie. Studiile de conservare au demonstrat ca analitul este stabil timp de 14 zile în probe daca acestea au fost conservate. Probele refrigerate pot fi pastrate pâna la 30 de zile.
Pregatirea probei
Alachlorul este extras si concentrat din proba prin SPE (solid phase extraction) utilizând ca faza solida de extractie un disc de 25 mm, SDB -xc (3M Empore TM, sau echivalent).
Dupa realizarea concentrarii, discul SDB se amplaseaza în pozitie orizontala într-un vas cu gura larga. Se adauga 2 mL de metanol (puritate analitica) peste discul SDB, se acopera si se agita pe o platforma orbitala de agitate timp de 15 min. Se transfera solutia de metanol într-o fiola de 4 mL cu dop de teflon. Se utilizeaza o pipeta sau o seringa pentru a lua o cota parte din proba si se dilueaza cu apa deionizata la minim 1 : 100. Vasul cu restul de proba se sigileaza cu parafilm si se depoziteaza în frigider.
Nota: Daca concentratia probei este mai mare de 0,5 µg, sunt necesare dilutii ulterioare pentru a se încadra în domeniul de analiza a metodei. Daca intervalul de concentratie este necunoscut se pot realiza mai multe dilutii.
Metoda analitica
Experiment 1. Optimizarea concentratiilor de antigen marcat si anticorp
Se introduc în godeurile placii câte 100 µl solutie de anticorp (în intervalul 0-1000 mg/L în 50 mM solutie tampon carbonat, pH 9,6 , în coloanele 1 - 12 prin dilutii succesive) si se lasa pentru absorbtie la 4oC, peste noapte.
Dupa ce este îndepartata solutia reziduala, placa este spalata cu tampon fosfat salin (PBS) (aprox. 200 µL/ godeu).
100 µL din diferite concentratii ale antigenului marcat (în intervalul 1/100 - 0 antigen marcat diluat în PBS) este adaugat pe a doua dimensiune (rândul de la A la H) prin dilutii succesive si se lasa la incubat timp de 5 ore.
Solutia reziduala este îndepartata, placa este spalata si uscata dupa cum a fost descris la pct. 2.
200 µL din solutia substrat este adaugata în fiecare godeu. Dupa un timp de reactie de 10 min aceasta se stopeaza prin adaugarea a 50 µl de solutie 4 M de H2SO4 si se incubeaza din nou pentru 25 - 30 min.
Absorbanta este citita la 450 nm. Concentratiile optime ale antigenului marcat si ale anticorpului sunt alese ca fiind cele care determina o legare la anticorp de 40 -70 % .
Experiment 2. Calibrarea analitului si analiza probelor reale
Placa este acoperita cum a fost descris la pasul 1, experiment 1, exceptând numai concentratia optima a anticorpului utilizat. Incubarea se realizeaza peste noapte la 4oC.
Solutia reziduala se îndeparteaza si placa este spalata dupa cum a fost descris la pct. 2, experiment 1.
Calibrarea analitului (de la 0 ppm la 1 ppm alachlor) se face de-a lungul placii cu diferite matrici de probe, dupa cum urmeaza:
Antigenul marcat este adaugat astfel încât sa fie atinsa concentratia optima, iar volumul final în fiecare godeu sa fie 100 µl. Se incubeaza timp de 5 ore.
Solutia reziduala se îndeparteaza si placa este spalata dupa cum a fost descris la pct. 2, experiment 1.
200 µl din solutia substrat este adaugata în fiecare godeu. Dupa un timp de reactie de 10 min, aceasta se stopeaza prin adaugarea a 50 µl de solutie 4 M de H2SO4 si se incubeaza din nou pentru 25 - 30 min.
Absorbanta este citita la 450 nm.
Raport
Descrieti principiul de lucru al metodei.
Explicati cum se alege cel mai bun anticorp si cum se efectueaza dilutiile antigenului marcat.
Estimati IC50 intervalul dinamic si limita de detectie la determinarea alachlorului utilizând curba de dilutie în solutie tampon si în proba.
Aproximati influenta matricei în fiecare caz (prin calcularea raportului între IC50, semnalul calibrarii în solutie tampon si semnalul corespunzator în cazul dilutiei cu urina.)
Estimati concentratia alachlorului într-o proba necunoscuta.
|
