DETERMINAREA COMPUsILOR FENOLICI DIN APĂ PRIN CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ

Introducere

Fenolul si fenolii substituiti reprezinta produse secundare comune multor procese industriale. La concentratii de ordinul ppb-urilor, în conditiile din mediu în functie de temperatura si pH, acesti compusi pot persista mai multe zile sau saptamâni. S-a demonstrat ca fenolii sunt toxici pentru majoritatea organismelor acvatice si chiar si la concentratii scazute au un efect advers asupra gustului si mirosului apei. De aceea, în cazul în care diferite tipuri de ape urmeaza sa fie folosite ca surse de apa pentru consum uman, se impune verificarea contaminarii lor cu acesti poluanti organici. În Comunitatea Europeana, concentratia maxim permisa pentru diferiti fenoli în apa potabila este deosebit de mica. În aceasta situatie, se impune utilizarea unei metode analitice care sa asigure selectivitate si sensibilitate ridicate.

În aceasta lucrare, este prezentata o metoda de determinare a fenolilor din ape folosind un procedeu de preconcentrare prin extractie selectiva a acestor compusi din apa pe cartuse adsorbante si determinare apoi a fenolilor extrasi de pe cartus prin cromatografie de lichide de înalta performanta cu detectie în UV.

Reactivi si aparatura

Acetonitril de puritate HPLC (Riedel de Haen); apa de puritate HPLC (Fluka), metanol de puritate HPLC (Fluka), acid acetic (Aldrich).

Cartus SPE de preconcentrare: Supelclean ENVI-Chrom P(Supelco)- copolimer stiren-divinil benzen ( dimensiunea particulelor: 80-160 µm; dimensiunea porilor: 110-175 Å).

Standard de fenoli: EPA 604-M Phenols Mix (Supelco)- format dintr-un amestec preparat în metanol de 11 analiti, aflati la diferite concentratii: fenol (500 µg/mL); 4-nitrofenol (2500 µg/mL); 2,4-dinitrofenol (1500 µg/mL); 2-clorofenol (500 µg/mL); 2-nitrofenol (500 µg/mL); 2,4-dimetilfenol (500 µg/mL); 4,6-dinitro-o-crezol(2500 µg/mL); 2,4-diclorofenol (500 µg/mL); 4-cloro-m-crezol (2500 µg/mL); 2,4,6-triclorofenol (1500 µg/mL); pentaclorofenol (2500 µg/mL).

Standard de fenoli: EPA 604-S Phenols Mix (Supelco)- format din 11 solutii de fenoli individuali, cu concentratia de 500 mg/L preparate în metanol, cu volum de 1 mL- fenol; 4-nitrofenol; 2,4-dinitrofenol; 2-clorofenol; 2-nitrofenol; 2,4-dimetilfenol; 4,6-dinitro-o-crezol; 2,4-diclorofenol; 4-cloro-m-crezol; 2,4,6-triclorofenol; pentaclorofenol) si o fiola cu amestec din toti fenolii mentionati anterior.

Sistem de extractie în faza solida tip Vacuum Manifold "Supelco" cu 12 pozitii.

Trapa de lichide tip Supelco SPE Vacuum Pump Trap Kit.

Pompa de vid Heidolph.

Determinarile propriu-zise au fost efectuate folosind un cromatograf de lichide de înalta performanta "Perkin Elmer" seria 200, echipat cu: pompa cuaternara; degazor pentru solventi; autosampler (pentru injectia automata în coloana cromatografica a unei cantitati de proba preselectata anterior si pentru spalarea automata a seringii); incinta termostatata pentru coloane cromatografice; detector UV-Vis tip "Diode Array" cu posibilitatea achizitiei simultane de spectre; calculator (soft).

Mod de lucru

Prepararea probei

Proba de apa se aciduleaza pâna la pH=2 în scopul prevenirii ionizarii compusilor fenollici.

Preconcentrarea probei pe cartus SPE:

se activeaza cartusul prin trecerea a 6 mL metanol cu un debit de 1 mL/min.

se conditioneaza cartusul prin trecerea a 6 mL apa acidulata (pH=2) cu un debit de 1 mL/min.

se trec prin cartus cu un debit de 2,5 mL/min, 100 mL de proba introdusa într-un vas aditional.

eluarea de pe cartus se realizeaza cu 2 mL amestec de solventi metanol/acid acetic 1%, cu un debit de 1mL/min.

Urmeaza analiza cromatografica a eluatului în vederea separarii componentilor si determinarii acestora.

Analiza cromatografica:

În vasele schimbatorului automat de probe (autosampler) se introduc standardele si probele de analizat (aproximativ 2 mL).

Se foloseste sistemul HPLC " Perkin Elmer " seria 200.

Se foloseste o coloana cu faza inversa "Brownlee" de tip Pecosphere C 18, cu diametrul porilor de 3 m, lungimea coloanei fiind de 83 mm si diametrul de 4,6 mm.

Se lucreaza cu elutie în gradient linear de faza mobila: de la 35 % acetonitril/apa (pH=2,2) pâna la 100 % acetonitril, în interval de 4 minute.

Faza mobila circula prin coloana cromatografica cu un debit de 2,5 mL/min. Analiza cromatografica efectuata în aceste conditii dureaza cinci minute. Ordinea de elutie din coloana cromatografica este urmatoarea: fenol; 4-nitrofenol; 2-clorofenol; 2,4-dinitrofenol; 2-nitrofenol; 2,4-dimetilfenol; 4-cloro-m-crezol; 2,4-diclorofenol; 4,6-dinitro-o-crezol; 2,4,6-triclorofenol; pentaclorofenol.

În cazul unor probe de apa cu compozitie mai complexa, pentru o mai buna separare a compusilor fenolici, poate fi folosita o alta coloana cromatografica: tip Supelcosil LC-8, cu dimensiunile 15 cm lungime x 4,6 mm d.i. cu diametrul particulelor de 5 µm. Se lucreaza tot cu elutie cu gradienti a fazei mobile (A: metanol/1% acid acetic; B:H₂O/1 % acid acetic) si anume: 5-100 % A + 95 - 0% B în 30 minute. Faza mobila circula prin coloana cromatografica cu un debit de 1 mL/min. Timpul de analiza necesar pentru a separa cei 11 compusi fenolici este de 11 minute, ordinea de elutie din coloana cromatografica fiind urmatoarea: fenol; 4-nitrofenol; 2,4-dinitrofenol; 2-clorofenol; 2-nitrofenol; 2,4-dimetilfenol; 4,6-dinitro-o-crezol; 2,4-diclorofenol; 4-cloro-m-crezol; 2,4,6-triclorofenol;pentaclorofenol.

În ambele situatii, temperatura coloanei este setata la 30 ºC, masuratoarea fiind efectuata cu un detector UV-Vis tip Dyode Array cu achizitie spectrala simultana, compusii fenolici fiind monitorizati simultan la doua lungimi de unda: 254 nm si 280 nm.

Pentru stabilirea timpului de retentie corespunzator fiecarui compus fenolic din amestec se foloseste standardul de fenoli: EPA 604-S Phenols Mix (Supelco- format din 11 solutii de fenoli individuali, cu concentratia de 500 mg/L. Se dilueaza fiecare compus fenolic 1:50 cu metanol. Prin injectarea în sistemul cromatografic a câte 60 µL din fiecare solutie diluata de compus fenolic corespunzând la 0,6 µg, se determina timpul de retentie corespunzator fiecaruia. Prin urmare, identificarea compusilor fenolici separati din proba de analizat se va realiza automat prin intermediul soft-ului cromatografului, prin compararea timpilor de retentie ai acestora cu timpii de retentie ai standardelor introduse în prealabil în sistemul HPLC.

Dozarea cantitativa a compusilor fenolici se realizeaza prin interpolarea ariei picului cromatografic corespunzator fiecarui compus separat, pe curba de etalonare trasata folosind amestecuri de diferite concentratii de solutii standard de compusi fenolici preparate în metanol (v/v).

Pentru a asigura o buna reproductibilitate a timpilor de retentie corespunzatori compusilor fenolici, precum si pentru o buna precizie a determinarilor, înainte de începerea analizelor cromatografice, este necesar un interval de stabilizare a sistemului cromatografic de cel putin o ora.

Trasarea dreptei de calibrare

Se traseaza o dreapta de calibrare în patru puncte. În acest scop, standardul de amestec de fenoli EPA 604-M "Supelco" este diluat cu metanol în proportie de 1:25 (v/v), 1:50(v/v), 1:100 (v/v), respectiv 1:125 (v/v). Concentratiile corespunzatoare amestecului de compusi fenolici din cele patru solutii astfel obtinute, exprimate in mg/L sunt prezentate în tabelul A. Cantitatile de fenoli exprimate în µg din solutiile standard preparate pentru trasarea dreptei de calibrare sunt prezentate în tabelul B.

În patru vase ale schimbatorului automat de probe al cromatografului se introduc aproximativ câte 2 mL din fiecare din cele patru solutii, din care se vor injecta automat câte 60 µL.

Dupa obtinerea cromatogramelor corespunzatoare fiecarui amestec de fenoli injectat, aparatul identifica compusul pe baza timpului de retentie si integreaza automat ariile corespunzatoare fiecarui maxim. Cele patru cromatograme obtinute se considera drept standarde de calibrare, iar din nou în regim automat softul aparatului genereaza dreptele de calibrare corespunzatoare fiecarui component la cele patru concentratii. Se pot obtine diverse tipuri de drepte de calibrare. Cea mai folosita (aleasa si în cazul nostru) este dreapta de gradul I cu intersectarea originii. Daca se doreste extinderea "dreptei de calibrare" la valori mari de concentratie este recomandabila folosirea unei ecuatii de gradul II cu conditia ca abaterea maxima de la liniaritate sa nu depaseasca 25 %.

Se poate constata ca prin adsorbtia pe cartus a 100 mL de proba contaminata cu compusi fenolici, urmata de eluarea cu 2 mL de amestec metanol/acid acetic 1%, majoritatea compusilor fenolici pot fi fara dificultate determinati la concentratii sub valoarea de 0,1 ppb folosind detectia în UV.

Tabel A. Concentratiile (exprimate în mg/L) ale compusilor fenolici folositi la trasarea dreptei de calibrare

Tabel B. Cantitatile de fenoli exprimate în µg din solutiile standard preparate pentru trasarea dreptei de calibrare, pentru un volum de injectie de 60 µL