SLOVENSKÝ LIEKOPIS

Vydanie prvé

SL 1

PHARMACOPOEA SLOVACA

Editio prima

PhS 1

Zväzok III. (2000)

Strany

D - H

Ministerstvo zdravotníctva Slovenskej republiky

Vydavateľstvo HERBA spol. s r. o.

Bratislava . 2000

SLOVENSKÝ LIEKOPIS

Vydanie prvé

Strany

D - H

SLOVENSKÝ LIEKOPIS

Odborná redakcia Prof. RNDr. PhMr. Milan Chalabala, DrSc.

PharmDr. Ruzena Martincová

PharmDr. Marta Benková, CSc.

Recenzoval:  Doc. RNDr. Jozef Sokolík, CSc.

Ministerstvo zdravotníctva Slovenskej republiky

Vydavateľstvo zdravotníckej literatúry HERBA spol. s r.o.

editor: Doc. RNDr. PhMr. Milan Lehký, CSc.

Vydanie prvé

Zväzok III., (strany 1401 - 2137)

Vsetky práva vyhradené. Toto dielo, ani ziadna jeho časť sa nesmie reprodukovať

bez súhlasu majiteľa práv.

Tlač: Kníhtlačiareň Svornosť, s. p.

Bratislava, 2000

ISBN: 80-967994-3-6

OBSAH

PREDSLOV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1405

OPRAVY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1407

VSEOBECNÁ ČASŤ  . . . . . . . . . . .

2. ANALYTICKÉ METÓDY  . . . . . . . .

FYZIKÁLNE A FYZIKÁLNO CHEMICKÉ METÓDY . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1411

Chromatografia na tenkej vrstve (1999 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1411

Otáčavý dichroizmus (1998) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1414

Celkový organický uhlík vo vode na farmaceutické pouzitie (2000) . . . . . . . . . . 1416

SKÚSKY TOTOZNOSTI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1418

Skúska totoznosti mastných olejov chromatografiou na tenkej vrstve (1999 rev.)1418

LIMITNÉ SKÚSKY PRE ANORGANICKÉ NEČISTOTY . . . . . . . . . . . . . . . . .1419

Nikel v hydrogenovaných rastlinných olejoch (2000) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1419

Kyselina 2-etylhexánová (2000) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1420

METÓDY STANOVENIA OBSAHU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1421

Peroxidové číslo (1999) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1421

Číslo zmydelnenia (2000 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1423

Nezmydelniteľné látky (1998 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1423

Ribóza v polysacharidových očkovacích látkach (1998) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1424

Mikrometóda - kulometrická titrácia (1999) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1425

BIOLOGICKÉ SKÚSKY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1426

Sterilita (2000 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1426

Dôkaz mykoplaziem (1998 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1434

Mikrobiologické hodnotenie nesterilných produktov: Celkový počet zivých

aeróbnych mikroorganizmov (2000 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1441

Mikrobiologické hodnotenie nesterilných produktov: Dôkaz specifických

mikroorganizmov (2000 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1445

Skúsky na cudzie agensy vo vírusových očkovacích látkach

na humánne pouzitie (1998 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1454

Skúska neurovirulencie perorálnej očkovacej látky proti poliomyelitíde (1997) . .1457

STANOVENIA BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1460

Stanovenie biologickej účinnosti ľudského koagulačného faktora VIII (1999 rev.)1460

Skúska funkcie Fc imunoglobulínu (1997) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1462

Stanovenie biologickej účinnosti ľudského koagulačného faktora VII (1999 rev.)1465

Stanovenie biologickej účinnosti ľudského koagulačného faktora IX (1998) . . . .1467

Stanovenie biologickej účinnosti heparínu v koagulačných faktoroch (1998). . . .1468

FARMACEUTICKO TECHNOLOGICKÉ METÓDY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1468

Kontaminácia časticami: častice neviditeľné voľným okom (2000 rev.) . . . . . . . .1468

Kontaminácia viditeľnými časticami (1999 rev.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1470

PRODUKTY FERMENTÁCIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1471

4. REAGENCIE  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1474

Reagencie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1474

Roztoky na stanovenie limitu nečistôt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1497

Tlmivé roztoky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1497

Odmerné roztoky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1499

NOVÉ A REVIDOVANÉ MONOGRAFIE (A - H) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1502

LIEKOVÉ FORMY  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2122

Lieky na inhaláciu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2123

LATINSKO - SLOVENSKÝ INDEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2127

PREDSLOV

V predslove k prvému zväzku Slovenského liekopisu sme vysvetlili, ze Slovenský liekopis 1 (SL 1) vydávame, aby sme zachovali pre Slovenskú republiku liekopisnú tradíciu, ktorá dokumentuje vysokú úroveň starostlivosti spoločnosti o liečivá a lieky. Uviedli sme tiez, ze SL 1, ktorý z hľadiska prístupu SR k Dohode o vypracovaní Európskeho liekopisu (Dohoda č. 50 Rady Európy) a členstva SR v Európskej liekopisnej komisii implementuje Európsky liekopis, Ph. Eur. 3, sme schopní z technických príčin vydávať len postupne. Kazdoročne bude vychádzať jeden zväzok s obsahom nových textov analytických metód a individuálnych článkov liečiv a pomocných látok. Formálna stránka zostavenia liekopisu zostane pri kazdom vydaní nezmenená a v záujme zachovania jeho kontinuity bude aj číslovanie strán pokračovať z predchádzajúceho dielu.

V predslove k druhému zväzku Slovenského liekopisu 1 sme citovali § 45 zákona 140/1998 Zb., ktorý definuje liekopis a zaraďuje ho do systému liekovej legislatívy zaručujúcej kvalitu, bezpečnosť a účinnosť liekov.

Tretí zväzok Slovenského liekopisu 1 obsahuje vo vseobecnej časti nové a revidované analytické metódy, zoznam reagencií doplnený o ďalsie reagencie vyplývajúce z liekopisných článkov; monografie v abecednom poradí D - H sú doplnené o revidované monografie v poradí A - C z I. zväzku. Do state liekových foriem je zaradený revidovaný vseobecný článok Lieky na inhaláciu.

Obsah liekopisu respektuje edičnú činnosť Európskej liekopisnej komisie, a preto sa do tohto zväzku premietajú aj inovácie relevantných statí a individuálnych článkov z Doplnkov 1998, 1999 a 2000 Európskeho liekopisu, 3. vydanie. Do obsahu sú zahrnuté opravy chybných textov, ktoré vyplývajú z predoslých dvoch zväzkov. Týmto spôsobom chceme poskytnúť uzívateľom liekopisu najnovsie zmeny v článkoch, ktoré vstúpili do platnosti v uvedenom roku vydania.

Ďakujeme za spoluprácu vsetkým odborníkom, ktorí nám pomáhajú pri realizácii tohto náročného normatívneho diela.

Doc. RNDr. Ľudevít Martinec, CSc. Prof. RNDr. PhMr. Milan Chalabala, DrSc.

riaditeľ predseda

Státneho ústavu pre kontrolu liečiv Slovenskej liekopisnej komisie SÚKL

v Bratislave v Bratislave

Prekladatelia a recenzenti:

PharmDr. Marta Benková, CSc.

MVDr. Daniela Bucsuházyová

RNDr. Ján Bujna

Doc. RNDr. Marián Bukovský, CSc.

PharmDr. Zuzana Čemická

Doc. RNDr. Daniel Grančai, CSc.

Prof. RNDr. PhMr. Milan Chalabala, DrSc.

PharmDr. Katarína Kisoňová

Mgr. Irena Klagová

Prof. Ing. Peter Kovács, DrSc.

Doc. RNDr. Ján Lučanský, CSc.

PharmDr. Ruzena Martincová

Mgr. Anna Mesiarová

Mgr. Marie Mlynárová, CSc.

Doc. Ing. Milan Nagy, CSc.

RNDr. Eleonóra Neuschlová

PharmDr. Iveta Nováková

RNDr. PhMr. Ing. Eva Radějová, CSc.

Mgr. Marta Skachová

RNDr. Peter Sláma

Doc. RNDr. Jozef Sokolík, CSc.

Mgr. Eva Solčanová

Ing. Eva Svoreňová

Doc. RNDr. Silvia Szücsová, CSc.

Prof. RNDr. MrPh. Magda Sarsúnová, DrSc.

Ing. Eva Tarábková

PharmDr. Ján Tomasch

Doc. MUDr. Emil Tomásik, CSc.

RNDr. Mária Uhríková

Ing. Helena Vaňová

RNDr. Miroslav Vrábel

OPRAVY

SLOVENSKÝ LIEKOPIS 1 - I. zväzok

Str. 22 - Skúsky totoznosti

2. veta: Musia s dostatočnou istotou overiť, či produkt zodpovedá opisu uvedenému na stítku.

opraviť na: Musia s dostatočnou istotou overiť, či produkt zodpovedá označeniu uvedenému na stítku.

Str. 88 - 2.2.32. Strata susením

1. veta: Predpísané mnozstvo skúsanej látky vopred vysusenej za predpísaných podmienok pre skúsanú látku sa prenesie do navazovačky.

opraviť na: Predpísané mnozstvo skúsanej látky sa presne odvázi do navazovačky vopred vysusenej za predpísaných podmienok pre skúsanú látku.

Str. 131 - 2.5.11. Komplexometrické titrácie - Vápnik

2. riadok: ... asi 15 mg kalkonkarboxylovej kyseliny R sa titruje ...

opraviť na: ... asi 15 mg kyseliny kalkonkarboxylovej s chloridom sodným R sa titruje ...

Str. 255 - 2.9.13. Mikroskopické limitné stanovenie veľkosti častíc

2. riadok: ... v 10,0 ml vhodného média, v ktorom sa prások nesmie nerozpúsťať.

opraviť na: ... v 10,0 ml vhodného média, v ktorom sa prások nesmie rozpúsťať.

Str. 506 - Reineckova soľ, roztok R

Roztok 1 g/l.

opraviť na: Roztok 10 g/l.

Str. 537 - Voda destilovaná R

Pripravuje sa destiláciou vody R.

opraviť na: Je voda R pripravená destiláciou.

Str. 560 - Arzenitan sodný 0,2 mol/l VS

opraviť na: Arzenitan sodný 0,1 mol/l VS

Str. 565 - Jód 0,01 mol/l VS

K 20,0 ml jódu 0,1 mol/l VS sa pridá 0,3 g jodidu draselného R a doplní sa vodou R do 100,0 ml.

opraviť na: K 20,0 ml jódu 0,05 mol/l VS sa pridá 0,3 g jodidu draselného R a doplní sa vodou R do 100,0 ml.

SLOVENSKÝ LIEKOPIS 1 - II. zväzok

Str. 660 - 2.2.6. Index lomu

doplniť vetu: Ako výsledok merania sa berie aritmetický priemer najmenej piatich meraní.

Str. 915 - Optická otáčavosť

1. riadok: ... v roztoku hydrogénftalanu sodného R 4 g/l ...

opraviť na: ... v roztoku hydrogénftalanu draselného R 4g/l ...

VSEOBECNÁ ČASŤ

ANALYTICKÉ METÓDY

2.2. FYZIKÁLNE A FYZIKÁLNO CHEMICKÉ METÓDY

2.2.27. CHROMATOGRAFIA NA TENKEJ VRSTVE

Princíp. Chromatografia na tenkej vrstve je separačná metóda, pri ktorej sa stacionárna fáza pozostávajúca z vhodného materiálu nanesie v rovnomernej tenkej vrstve na podklad (platňu) zo skla, kovu alebo plastu. Roztoky analyzovaných látok sa nanásajú na platňu pred vyvíjaním. Delenie je zalozené na adsorpcii, rozdeľovaní, výmene iónov alebo na kombinácii týchto mechanizmov. Vykonáva sa migráciou (vyvíjaním) solutov (roztokov analyzovaných látok)
v rozpúsťadle alebo vo vhodnej zmesi rozpúsťadiel (mobilná fáza) pozdĺz tenkej vrstvy (stacionárna fáza).

ZARIADENIE

Platne. Chromatografia sa vykonáva za pouzitia platní pokrytých vrstvou, ako sa opisuje v stati Reagencie (4.1.1).

Predpríprava platní. Ak treba, platne sa pred pouzitím umyjú. Môze sa to urobiť migráciou vhodného rozpúsťadla alebo sa platne impregnujú, napr. vyvíjaním, ponorením alebo postriekaním. Ak treba, platne sa môzu v čase pouzitia aktivovať zahrievaním 1 h v susiarni pri teplote 100 °C az 105 °C.

Chromatografická komora s rovným dnom alebo dvojitým zliabkom je z inertného priehľadného materiálu s rozmermi prispôsobenými veľkosti pouzitých platní a vybavená tesne priliehajúcim krytom. Na horizontálne vyvíjanie je komora vybavená zliabkom na mobilnú fázu a dopĺňajúcim zariadením na presmerovanie mobilnej fázy na stacionárnu fázu.

Mikropipety, mikrostriekačky, kalibrované jednorazové kapiláry alebo iné aplikačné zariadenia vhodné na správne nanásanie roztokov.

Fluorescenčné detekčné zariadenie na meranie priamej fluorescencie alebo zhásanie fluorescencie.

Reagencie na vizualizáciu sú reagencie na detekciu separovaných skvŕn postriekaním pri vystavení parám alebo ponorením.

METÓDA

Vertikálne vyvíjanie. Steny chromatografickej komory sa vylozia filtračným papierom. Do chromatografickej komory sa naleje také mnozstvo mobilnej fázy, aby sa po nasýtení filtračného papiera dosiahla potrebná hladina na ponorenie pouzitej platne. Aby sa chromatografická komora nasýtila, uzavrie sa vekom a nechá sa 1 h stáť pri teplote 20 °C az
25 °C. Ak nie je určené inak, chromatografické delenie sa vykonáva v nasýtenej komore.

Predpísaný objem roztokov sa nanesie v malých častiach, aby sa vytvorili pásy alebo okrúhle skvrny vo vhodnej vzdialenosti od dolného okraja a od bočných okrajov platne. Roztoky sa nanesú na čiaru rovnobeznú s dolným okrajom platne vo vzdialenosti medzi skvrnami najmenej 10 mm.

Po odparení rozpúsťadla z nanesených roztokov sa platňa vlozí do chromatografickej komory tak, aby bola polozená čo najzvislejsie a aby sa skvrny alebo pásy nachádzali nad hladinou mobilnej fázy. Komora sa uzavrie a udrzuje sa pri teplote 20 °C az 25 °C, chránená pred svetlom. Keď mobilná fáza dosiahne predpísanú vzdialenosť, platňa sa vyberie, vysusí
a chromatogramy sa detegujú predpísaným spôsobom.

Pri dvojrozmernej chromatografii sa platne vysusia po prvom vyvíjaní a vykoná sa druhé vyvíjanie v kolmom smere na prvé vyvíjanie.

Horizontálne vyvíjanie. Predpísaný objem roztokov sa nanesie v malých častiach, aby sa vytvorili okrúhle skvrny s priemerom 1 mm az 2 mm alebo pásy s rozmermi 5 mm az
10 mm x 1 mm az 2 mm vo vhodnej vzdialenosti od dolného okraja a od bočných okrajov platne. Roztoky sa nanásajú na čiaru rovnobeznú s dolným okrajom platne vo vzdialenosti medzi skvrnami najmenej 5 mm.

Po odparení rozpúsťadla sa z nanesených roztokov injekčnou striekačkou alebo pipetou prenesie potrebné mnozstvo mobilnej fázy do zliabka komory; platňa sa umiestni horizontálne do chromatografickej komory a spojí sa s mobilnou fázou v smere podľa návodu výrobcu. Ak je to predpísané, platňa sa vyvíja so startom na obidvoch koncoch. Komora sa uzavrie a udrzuje sa pri teplote 20 °C az 25 °C. Keď mobilná fáza dosiahne vzdialenosť predpísanú v článku, platňa sa vyberie, vysusí a chromatogramy sa detegujú predpísaným spôsobom.

Pri dvojrozmernej chromatografii sa platne vysusia po prvom vyvíjaní a vykoná sa druhé vyvíjanie v kolmom smere na prvé vyvíjanie.

VIZUÁLNE HODNOTENIE

Skúska totoznosti. Hlavná skvrna na chromatograme skúsaného roztoku sa vizuálne porovnáva so zodpovedajúcou skvrnou na chromatograme referenčného roztoku z hľadiska farby, veľkosti a retenčného faktora (R_f) obidvoch skvŕn.

Retenčný faktor (R_f) je definovaný ako pomer vzdialenosti čela skvrny od bodu nanásky
k vzdialenosti čela rozpúsťadla od bodu nanásky.

Overenie deliacej schopnosti pre skúsku totoznosti. Bezne postačuje skúska o zhode opísaná
v stati Reagencie (4.1.1). Len vo výnimočných prípadoch sa v článku predpisuje preskúsanie ďalsieho kritéria.

Skúska na príbuzné látky. Sekundárna skvrna (skvrny) na chromatograme skúsaného roztoku sa vizuálne porovnáva buď so zodpovedajúcou skvrnou na chromatograme referenčného roztoku, ktorý obsahuje nečistoty, alebo so skvrnou na chromatograme referenčného roztoku pripraveného z riedenia skúsaného roztoku.

Overenie deliacej schopnosti. Poziadavky na overenie deliacej schopnosti sa uvádzajú
v príslusných článkoch.

Overenie detekčnej schopnosti. Detekčná schopnosť vyhovuje, ak je skvrna alebo pás na chromatograme najzriedenejsieho referenčného roztoku zreteľne viditeľná.

KVANTITATÍVNE MERANIE

Poziadavky na rozlísenie a separáciu sú uvedené v jednotlivých článkoch.

Látky reagujúce na UF-viditeľné svetlo, oddelené chromatografiou na tenkej vrstve, sa môzu stanoviť priamo na platni za pouzitia vhodného prístroja. Pohybovaním platne alebo meracieho prístroja sa na platni meria odraz alebo priepustnosť dopadajúceho svetla. Podobne mozno merať aj fluorescenciu za pouzitia vhodného optického systému. Látky obsahujúce rádionuklidy sa môzu kvantitatívne stanovovať tromi spôsobmi: priamo posúvaním platne pozdĺz vhodného meracieho prístroja alebo naopak pozri Rádiofarmaká (125) , narezaním platne na pásy a meraním rádioaktivity na kazdom jednotlivom páse za pouzitia vhodného meracieho prístroja alebo zoskrabaním stacionárnej fázy, jej rozpustením vo vhodnej scintilačnej zmesi a meraním rádioaktivity za pouzitia kvapalinového scintilačného počítača.

Prístroj. Prístroj na priame meranie na platni sa skladá

- zo zariadenia na presné polohovanie a reprodukovateľné rozdelenie mnozstva látok na platni,

- z mechanického zariadenia na pohyb platne alebo meracieho prístroja pozdĺz osi x alebo y,

- zo zapisovača a vhodného integrátora alebo počítača

- pre látky reagujúce na UF-viditeľné svetlo: na meranie odrazu alebo priepustnosti sa pouzíva fotometer so zdrojom svetla, optické zariadenie schopné vyrábať monochromatické svetlo
a fotobunka vhodnej citlivosti; v prípade merania fluorescencie sa vyzaduje prídavný monochromatický filter, ktorý vyselektuje určitú spektrálnu oblasť emitovaného svetla;

- pre látky obsahujúce rádionuklidy: vhodný počítač rádioaktivity. Rozsah linearity počítačového prístroja sa musí overiť.

Postup. Roztok skúsanej látky (skúsaný roztok) sa pripraví postupom predpísaným v článku. Ak treba, pripravia sa referenčné roztoky skúsanej látky za pouzitia toho istého rozpúsťadla ako na prípravu skúsaného roztoku. Na platňu sa nanesie rovnaký objem z kazdého roztoku a vyvíja sa.

Látky reagujúce na UF-viditeľné svetlo: Najmenej tri referenčné roztoky skúsanej látky sa pripravia v koncentráciách, ktoré predstavujú očakávanú hodnotu v skúsanom roztoku, (asi 80 %, 100 % a 120 %) a nanesú sa na platňu. Ak treba, platňa sa postrieka predpísaným činidlom, a zaznamená sa odraz, priepustnosť alebo fluorescencia na chromatogramoch skúsaného roztoku a referenčných roztokov. Namerané výsledky sa pouzijú na výpočet mnozstva látky v skúsanom roztoku.

Látky obsahujúce rádionuklidy: Pripraví sa skúsaný roztok obsahujúci asi 100 % očakávanej hodnoty a nanesie sa. Rádioaktivita sa stanoví ako závislosť dĺzky dráhy a v kazdom získanom píku sa vyjadrí ako percentuálny obsah celkovej rádioaktivity.

Ak nie je predpísané inak, stanovenie je platné len vtedy, ak je rozlísenie (R_s) medzi zmeranými píkmi na chromatograme väčsie ako 1,0.

Rozlísenie (R_s) sa vypočíta podľa vzorca

z_b > z_a

kde z_b, z_a = vzdialenosť medzi bodom startu a kolmicou spustenou z maxima dvoch susedných píkov pozdĺz základne v milimetroch,

b_0,5a, b_0,5b = sírka píkov v polovici výsky v milimetroch.

Ak sa určenie limitných hodnôt pre nečistoty stanovuje fotometricky, pomer signálu k sumu (S/S) je dôlezitým parametrom na vyjadrenie limitu detekcie.

Pomer signálu k sumu (S/S) sa vypočíta podľa vzorca

kde H = výska píku zodpovedajúceho zlozke na chromatograme predpísanej referenčnej lát- ky, meraná od maxima píku po základňu signálu pozorovaného nad vzdialenosťou,

ktorá sa rovná 20-násobku sírky v polovici výsky,

h = maximálna amplitúda pozadia sumu na chromatograme po nanesení slepého roz- toku pozorovaná nad vzdialenosťou, ktorá sa rovná 20-násobku sírky v polovici

výsky píku na chromatograme získanom z predpísanej referenčnej látky a leziacom

priblizne na mieste, kde by sa mal nachádzať.

2.2.41. OTÁČAVÝ DICHROIZMUS

Rozdiel absorbancie ľavotočivého a pravotočivého polarizovaného svetla v absorpčnom páse pri opticky aktívnych látkach sa nazýva otáčavý dichroizmus.

Priamym meraním sa získa priemerná hodnota

DA = A_L A_P ,

kde A = absorbancia otáčavého dichroizmu,

A_L = absorbancia ľavotočivého polarizovaného svetla,

A_P = absorbancia pravotočivého polarizovaného svetla.

Otáčavý dichroizmus sa vypočíta podľa vzorca

kde = molárny otáčavý dichroizmus alebo molárny diferenciálnodichroistický koeficient absorbancie, vyjadrený ako liter . mol . cm

_L = molárny koeficient absorbancie (2.2.25) ľavotočivého polarizovaného svetla,

_P = molárny koeficient absorbancie pravotočivého polarizovaného svetla,

c = koncentrácia skúsaného roztoku v mol/l,

1 = hrúbka kyvety v centimetroch.

Na určenie charakteristiky otáčavého dichroizmu sa môzu pouziť aj tieto jednotky:

Faktor dissymetrie:

kde ε = molárny koeficient absorbancie (2.2.25).

Molárna elipticita:

Niektoré typy prístrojov znázorňujú priamo hodnotu elipticity Q vyjadrenú v stupňoch. Ak sa pouzije takýto typ prístroja, molárna elipticita Q sa môze vypočítať za pouzitia tejto rovnice:

kde = molárna elipticita vyjadrená v stupňoch . cm . decimol

Q = hodnota elipticity odčítaná na prístroji,

M = relatívna molekulová hmotnosť skúsanej látky,

c = koncentrácia skúsaného roztoku v g/ml,

l = hrúbka kyvety v centimetroch.

Vzťah molárnej elipticity k molárnemu otáčavému dichroizmu sa môze vyjadriť aj touto rovnicou:

Molárna elipticita sa často pouzíva pri analýze bielkovín a nukleových kyselín. V tomto prípade sa molárna koncentrácia vyjadruje ako monomérny zvysok, ktorý sa vypočíta podľa vzorca

molekulová hmotnosť

počet aminokyselín

Priemerná relatívna molekulová hmotnosť monomérneho zvysku je 100 az 120 (zvyčajne 115) pri bielkovinách a asi 330 pri nukleových kyselinách (vo forme sodnej soli).

Prístroj. Ako svetelný zdroj (S) slúzi xenónová lampa; svetlo prechádza cez dvojitý monochromátor (M) s kremennými hranolmi (P₁, P₂). Lineárny lúč z prvého monochromátora sa stiepi na dva lúče, ktoré sa v druhom monochromátore polarizujú v pravom uhle. Výstupná strbina monochromátora eliminuje nezvyčajné lúče.

Polarizované a monochromatické svetlo prechádza cez dvojlomný modulátor (Cr), pričom vzniká striedavo otáčavé polarizované svetlo.

Lúč potom prechádza cez skúsanú vzorku (C) a dopadá na fotonásobič (PM) so zosilňovačom, ktorý vysiela dva elektrické signály: jednosmerný prúd V_c a striedavý prúd
s modulačnou frekvenciou V_ac charakteristickou pre skúsanú látku. Fáza je korelovaná otáčavým dichroizmom. Pomer V_ac/V_c je úmerný diferenciálnej absorbancii A, ktorú spôsobil signál. Oblasť vlnových dĺzok normálne zachytená dichrografom je 170 nm az 800 nm.

Kalibrácia prístroja

Presnosť absorpčnej stupnice. 10,0 mg izoandrosterónu R sa rozpustí v dioxáne R a zriedi sa tým istým rozpúsťadlom na 10,0 ml. Zaznamená sa spektrum otáčavého dichroizmu roztoku
v rozmedzí 280 nm az 360 nm. Hodnota meraná v maxime pri 304 nm je +3,3.

Môze sa pouziť aj roztok kyseliny (1S)-(+)-gáfor-10-sulfónovej R.

Linearita modulácie. 10,0 mg kyseliny (1S)-(+)-gáfor-10-sulfónovej R sa rozpustí vo vode R
a zriedi sa tým istým rozpúsťadlom na 10,0 ml. Určí sa presná koncentrácia kyseliny gáforsulfónovej v roztoku absorpčnou spektrofotometriou v ultrafialovej oblasti (2.2.25) za predpokladu, ze specifická absorbancia pri 285 nm je 1,49.

Zaznamená sa spektrum otáčavého dichroizmu v rozmedzí 185 nm az 340 nm. Hodnota meraná v maxime pri 290,5 nm je v rozmedzí +2,2 az +2,5. Hodnota meraná v maxime pri 192,5 nm je v rozmedzí 4,3 az

Môze sa pouziť aj enantiomérna kyselina (1R)-( )-amóniumgáfor-10-sulfonát R.

Obr. 2.2.41.-1. Optická schéma dichrografu

2.2.44. CELKOVÝ ORGANICKÝ UHLÍK VO VODE

NA FARMACEUTICKÉ POUZITIE

Stanovenie celkového organického uhlíka (COU) je nepriamym meraním organických látok prítomných vo vode na farmaceutické pouzitie. Stanovením COU sa môzu sledovať aj rôzne postupy pri príprave liekov.

Na stanovenie COU sú dostupné rôzne prijateľné metódy. Táto vseobecná stať nepredpisuje konkrétnu metódu, ale opisuje skôr postupy na určenie spôsobilosti zvolenej metódy a na vyjadrenie výsledkov limitnej skúsky. Kalibračný roztok sa analyzuje v pravidelných intervaloch, závislých od frekvencie meraní; roztok sa pripravuje z ľahko oxidovateľnej látky (napr. sacharózy) a v takej koncentrácii, aby sa údaj prístroja zhodoval so stanoveným limitom obsahu COU. Vhodnosť systému sa overí analýzou roztoku pripraveného z ťazko oxidovateľnej látky (1,4-benzochinónu).

Vsetky typy prístrojov pouzívaných na meranie obsahu celkového organického uhlíka vo vode na farmaceutické pouzitie sú zalozené na rovnakom princípe: na úplnej oxidácii organických zlúčenín za vzniku oxidu uhličitého vo vzorke vody a nasledujúca kvantitatívna analýza oxidu uhličitého; zo získanej hodnoty sa vypočíta koncentrácia uhlíka vo vode.

Prístroj musí byť schopný rozlísiť organický uhlík od anorganického uhlíka prítomného vo forme uhličitanov. Rozlísenie sa môze uskutočniť buď meraním anorganického uhlíka a jeho odpočítaním od celkového uhlíka alebo odstránením anorganického uhlíka zo vzorky este pred oxidáciou. Pri tomto postupe prečisťovania sa môzu vniesť aj organické zlúčeniny, ale organický uhlík týchto zlúčenín je prítomný vo vode na farmaceutické účely len v zanedbateľných mnozstvách.

Prístroj. Pouzije sa kalibrovaný prístroj s priamym alebo nepriamym zapojením. Overí sa vhodnosť systému vo vhodných intervaloch, ako sa opisuje ďalej. Prístroj musí mať výrobcom charakterizovaný limit detekcie 0,05 mg uhlíka alebo menej na liter.

Voda COU. Pouzije sa vysoko čistená voda, ktorá vyhovuje týmto poziadavkám:

- vodivosť: najviac 1,0 µS . cm^-1 pri teplote 25 °C,

- celkový organický uhlík: najviac 0,1 mg/l.

V závislosti od pouzitého typu prístroja môze byť závazným faktorom obsah ťazkých kovov a medi. Musí sa dodrziavať návod výrobcu.

Príprava skla. Sklo musí byť dôkladne vyčistené postupom, ktorým sa odstránia organické látky. Na konečné opláchnutie skla sa pouzije voda COU.

Kalibračný roztok. Sacharóza R susená 3 h pri teplote 105 °C sa rozpustí vo vode COU v takom mnozstve, aby vznikol roztok obsahujúci 1,19 mg sacharózy na liter (0,50 mg uhlíka na liter).

Skúsaný roztok. Skúsaná voda sa odoberie do nádoby v maximálnom objeme, aby sa mohla vzduchotesne uzavrieť. Dbá sa pritom o to, aby nedoslo k jej kontaminácii. Voda sa skúsa, pokiaľ je to mozné ihneď, aby bolo riziko kontaminácie z nádoby a z uzáveru čo najmensie.

Roztok na stanovenie vhodnosti systému. 1,4-Benzochinón R sa rozpustí vo vode COU tak, aby vznikol roztok obsahujúci 0,75 mg 1,4-benzochinónu na liter (0,50 mg uhlíka na liter).

Referenčná voda COU. Pouzije sa voda COU, ktorá sa pouzila na prípravu kalibračného roztoku a roztoku na stanovenie vhodnosti systému.

Referenčné roztoky. Popri referenčnej vode COU sa pripravia vhodné slepé roztoky alebo iné roztoky potrebné na zostavenie kalibračnej krivky alebo na kalibráciu podľa návodu výrobcu; pomocou vhodných slepých roztokov sa nastaví nulová hodnota prístroja.

Vhodnosť systému. Merajú sa uvedené roztoky a zaznamenajú sa výsledky: voda COU (r_w); kalibračný roztok (r_s); roztok na stanovenie vhodnosti systému (r_ss). Účinnosť systému sa vypočíta v percentách podľa rovnice

Systém je vhodný, ak získaná hodnota nie je mensia ako 85 % a nie je väčsia ako 115 %
z teoretickej hodnoty.

Postup. Zmeria sa skúsaný roztok a zaznamená sa nameraná hodnota (r_u). Skúsaný roztok vyhovuje skúske, ak hodnota r_u nie je väčsia ako rozdiel hodnôt r_s - r_w.

Metóda sa môze pouziť aj pri priamom zapojení zariadenia, ktoré bolo primerane kalibrované a preukázalo prijateľný systém vhodnosti. Umiestnenie prístroja sa musí voliť tak, aby namerané hodnoty boli pre pouzitú vodu charakteristické.

2.3. SKÚSKY TOTOZNOSTI

2.3.2. SKÚSKA TOTOZNOSTI MASTNÝCH OLEJOV

CHROMATOGRAFIOU NA TENKEJ VRSTVE

Skúsa sa chromatografiou na tenkej vrstve (2.2.27) vhodného oktadecylsilanizovaného silikagélu pre vysokoúčinnú chromatografiu na tenkej vrstve.

Skúsaný roztok. Ak nie je predpísané inak, asi 20 mg (1 kvapka) oleja sa rozpustí v 3,0 ml dichlórmetánu R.

Referenčný roztok. Asi 20 mg (1 kvapka) oleja kukuričného R sa rozpustí v 3,0 ml dichlórmetánu R.

Na platňu sa oddelene nanesie 1 µl z kazdého roztoku. Vyvíja sa 2-krát do vzdialenosti
0,5 cm éterom R a 2-krát do vzdialenosti 8 cm zmesou dichlórmetánu R, kyseliny octovej, ľadovej R a acetónu R (20 obj.+ 40 obj.+ 50 obj.). Platňa sa vysusí na vzduchu a postrieka sa roztokom kyseliny fosfomolybdénovej R 100 g/l v liehu 96 % R. Platňa sa asi 3 min zahrieva pri teplote 120 C a pozoruje sa pri dennom svetle.

Skvrny na chromatograme sa zhodujú so skvrnami na obrázku 2.3.2.-l.

1. Podzemnicový olej 6. Sójový olej

2. Olivový olej 7. Slnečnicový olej

3. Sezamový olej 8. Repkový olej

4. Kukuričný olej 9. Repkový olej (bez kyseliny erukovej)

5. Mandľový olej 10. Olej z pseničných klíčkov

Obr. 2.3.2.-1. Typické chromatogramy na identifikáciu olejov

2.4. LIMITNÉ SKÚSKY PRE ANORGANICKÉ NEČISTOTY

2.4.27. NIKEL V HYDROGENOVANÝCH RASTLINNÝCH OLEJOCH

Skúsa sa atómovou absorpčnou spektrometriou (2.2.23., metóda A).

UPOZORNENIE: Ak sa pouzijú uzavreté vysokotlakové digerovacie nádoby a mikrovlnové laboratórne zariadenie, treba sa dobre oboznámiť s bezpečnostnými a pracovnými návodmi výrobcu.

Skúsaný roztok. 0,100 g (m) skúsanej látky sa odvázi do vhodnej digerovacej nádoby odolnej proti vysokému tlaku (z fluórpolymérového alebo kremenného skla), pridá sa 6,0 ml kyseliny dusičnej R a 2,0 ml peroxidu vodíka, koncentrovaného roztoku R. Tým istým spôsobm sa pripraví slepý roztok. Uzavreté nádoby sa vlozia do laboratórnej mikrovlnovej piecky a digeruje sa s vhodným programom, obvykle 250 W 10 min; 600 W 5 min; 400 W 5 min; 250 W 7 min. Digerovacie nádoby sa pred otvorením nechajú vychladnúť. Obsah sa kvantitatívne prenesie do baniek, zriedi sa vodou R na 25,0 ml a premiesa sa.

Kalibračné roztoky. K 10,0 ml roztoku niklu (10 ppm Ni) R sa pridá 1,0 ml kyseliny dusičnej R, 2,0 ml peroxidu vodíka, koncentrovaného roztoku R a zriedi sa vodou R na 20,0 ml. Do styroch baniek sa odmeria po 20 µl, 50 µl, 100 µl a 150 µl tohto roztoku. Do kazdej banky sa pridá 6,0 ml kyseliny dusičnej R, zriedi sa vodou R na 25,0 ml a premiesa sa. Týmto spôsobom sa získajú kalibračné roztoky obsahujúce 4 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml a 30 ng/ml (ppb) niklu.

Nulový roztok. 6,0 ml kyseliny dusičnej R sa zriedi vodou R a doplní sa vodou R do 25,0 ml.

Postup. Pripravia sa zmesi 1 objemu roztoku dusičnanu horečnatého R 5,0 g/l a po 2 objemoch slepého roztoku, skúsaného roztoku, kalibračných roztokov a nulového roztoku.

Určí sa absorbancia vsetkých skúsaných roztokov pri 232,0 nm s pouzitím grafitového absorpčného spektrofotometra vybaveného Zeemanovým kompenzačným systémom pozadia, pyrolyticky potiahnutou trubicou s rovným dnom a dutou niklovou katódou. Teplota susenia sa udrzuje 10 s na 100 °C po 10-sekundovej odozve, teplota spopolnenia 10 s na 1 400 °C po 20-sekundovej odozve a teplota atomizácie 5 s na 2 500 °C. Nulový roztok sa pouzije na nastavenie nulovej hodnoty prístroja. Z kalibračných roztokov sa odčítaním zostrojí kalibračná krivka. S pouzitím vonkajsej kalibrácie sa z jednotlivých absorbancií určia zodpovedajúce koncentrácie skúsaného roztoku a slepého roztoku. Ak treba, zriedi sa nulovým roztokom, aby sa dosiahlo odčítanie v rozsahu kalibrovaných absorbancií (zrieďovací faktor f).

Obsah niklu vo vzorke v µg/g (ppm) sa vypočíta podľa vzorca

kde c = zmeraná koncentrácia (ng/ml),

f = zrieďovací faktor,

m = hmotnosť skúsanej látky (g).

2.4.28 KYSELINA 2-ETYLHEXÁNOVÁ

Skúsa sa plynovou chromatografiou (2.2.28) za pouzitia kyseliny 3-cyklohexylpropánovej R ako vnútorného standardu.

Roztok vnútorného standardu. 100 mg kyseliny 3-cyklohexylpropánovej R sa rozpustí
v cyklohexáne R a zriedi sa tým istým rozpúsťadlom na 100 ml.

Skúsaný roztok. K 0,300 g skúsanej látky sa pridajú 4,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkovej
33 % (V/V). Intenzívne sa 1 min 2-krát pretrepáva, vzdy s 1,0 ml roztoku vnútorného standardu. Ak treba, centrifuguje sa a pouzije sa vrchná vrstva.

Referenčný roztok. 75,0 mg kyseliny 2-etylhexánovej R sa rozpustí v roztoku vnútorného standardu a zriedi sa tým istým roztokom na 50,0 ml. K 1,0 ml tohto roztoku sa pridajú 4,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkovej 33 % (V/V). Intenzívne sa 1 min pretrepáva. Nechajú sa oddeliť fázy (ak treba, pre lepsie oddelenie sa centrifuguje). K spodnej vrstve sa pridá 1,0 ml roztoku vnútorného standardu a 1 min sa intenzívne pretrepáva. Nechajú sa oddeliť fázy (ak treba, centrifuguje sa) a pouzijú sa spojené diely vrchnej vrstvy.

Na chromatografiu sa pouzije

- kolóna z kremenného skla dlhá 10 m so sirokým otvorom s vnútorným priemerom 0,53 mm, pokrytá vrstvou makrogolu 20 000-2-nitrotereftalátu R (hrúbka filmu 1,0 mm),

- ako nosný plyn hélium pre chromatografiu R s prietokovou rýchlosťou 10 ml/min,

- plameňovo-ionizačný detektor.

Tabuľka teplotného programu

Dávkuje sa 1 l skúsaného roztoku a 1 l referenčného roztoku.

Skúska je platná len vtedy, ak je rozlísenie medzi píkmi kyseliny 2-etylhexánovej (prvý pík) a roztokom vnútorného standardu najmenej 2,0.

Obsah kyseliny 2-etylhexánovej v percentách sa vypočíta podľa vzorca

kde A_T = plocha píku kyseliny 2-etylhexánovej na chromatograme skúsaného roztoku,

A_R = plocha píku kyseliny 2-etylhexánovej na chromatograme referenčného roztoku,

I_T = plocha píku vnútorného standardu na chromatograme skúsaného roztoku,

I_R = plocha píku vnútorného standardu na chromatograme referenčného roztoku,

m_T = hmotnosť skúsanej látky v skúsanom roztoku v gramoch,

m_R = hmotnosť kyseliny 2-etylhexánovej v referenčnom roztoku v gramoch.

2.5. METÓDY STANOVENIA OBSAHU

2.5.5. PEROXIDOVÉ ČÍSLO

Peroxidové číslo (PČ) udáva mnozstvo peroxidu aktívneho kyslíka v miliekvivalentoch obsiahnuté v 1 000 g skúsanej látky, stanovené v ďalej opísanej metóde.

Ak nie je v článku predpísaná pouzitá metóda, musí sa pouziť metóda A. V prípade pouzitia metódy B namiesto metódy A sa musí vykonať validácia.

Metóda A

Do 250-ml kónickej banky so zabrúsenou zátkou sa odvázi 5,00 g (m v g) skúsanej látky. Pridá sa 30 ml zmesi 2 objemov chloroformu R a 3 objemov kyseliny octovej, ľadovej R. Pretrepáva sa do rozpustenia skúsanej látky a pridá sa 0,5 ml jodidu draselného, nasýteného roztoku R. Pretrepáva sa 1 min a pridá sa 30 ml vody R. Pomaly a za stáleho miesania sa titruje tiosíranom sodným 0,01 mol/l VS zo zltého zafarbenia takmer do odfarbenia. Po pridaní 5 ml skrobového roztoku R sa za silného pretrepávania pokračuje v titrácii az do odfarbenia roztoku (n ml tiosíranu sodného 0,01 mol/l VS). Za tých istých podmienok sa pripraví slepý pokus
(n₂ ml tiosíranu sodného 0,01 mol/l VS). Spotreba tiosíranu sodného 0,01 mol/l VS pri slepom pokuse nesmie byť väčsia ako 0,1 ml.

kde m = návazok látky v gramoch.

Metóda B

Skúska sa vykonáva bez prístupu priameho svetla.

Do kónickej banky so zabrúsenou zátkou sa prenesie 50 ml zmesi 2 objemov trimetylpentánu R a 3 objemov kyseliny octovej, ľadovej R. Banka sa zazátkuje a pretrepáva sa do rozpustenia skúsanej látky (m v g; pozri tabuľku 2.5.5.-1). Za pouzitia vhodnej odmernej pipety sa pridá 0,5 ml jodidu draseného, nasýteného roztoku R a banka sa znova zazátkuje. Roztok sa nechá 1 min 1 s stáť a dôkladne sa najmenej 3-krát pretrepáva. Potom sa pridá
30 ml vody R.

Tabuľka 2.5.5.-1

Titruje sa tiosíranom sodným 0,1 mol/l VS (V v ml), ktorý sa postupne pridáva za stáleho
a silného pretrepávania, kým zltá jódová farba takmer nevymizne. Pridá sa asi 0,5 ml skrobového roztoku R1 a pokračuje sa v titrácii za stáleho pretrepávania, obzvlásť v blízkosti ekvivalenčného bodu, aby sa uvoľnil jód z rozpúsťadla. Po kvapkách sa pridáva roztok tiosíranu sodného dovtedy, kým nezmizne modré zafarbenie.

Ak sa pri titrácii spotrebuje menej ako 0,5 ml tiosíranu sodného 0,1 mol/l VS, stanovenie sa zopakuje za pouzitia tiosíranu sodného 0,01 mol/l VS (V v ml) a za silného a stáleho pretre-
pávania.

POZNÁMKA: Pri peroxidových číslach 70 alebo vyssích hodnotách nastáva časové oneskorenie odfarbenia skrobového indikátora o 15 s az 30 s. Je to spôsobené vlastnosťou trimetylpentánu, ktorý sa vyplaví na povrch vodnej vrstvy a časom potrebným na dôkladné premiesanie rozpúsťadla s odmerným roztokom, aby sa uvoľnili posledné stopy jódu. Na peroxidové čísla nizsie ako 150 sa odporúča pouziť tiosíran sodný 0,01 mol/l VS. Na spomalenie oddelenia fáz a skrátenie časového oneskorenia pri uvoľňovaní jódu sa môze pridať do reakčnej zmesi malé mnozstvo 0,5 % az 1,0 % (m/m) emulgátora s vysokým HLR.

Pripraví sa slepý roztok (V v ml). Ak prekročí spotreba odmerného roztoku pri slepom roztoku 0,1 ml, znečistené roztoky sa nahradia čistými a stanovenie sa zopakuje.

kde c = koncentrácia roztoku tiosíranu sodného v mol/l.

2.5.6. ČÍSLO ZMYDELNENIA

Číslo zmydelnenia (ČZ) udáva mnozstvo hydroxidu draselného vyjadené v miligramoch potrebné na neutralizáciu voľných kyselín a na zmydelnenie esterov prítomných v 1 g látky.

Ak nie je predpísané inak, na stanovenie sa pouzije mnozstvo uvedené v tabuľke 2.5.6.-1.

Tabuľka 2.5.6.-1

Do 250-ml banky z bórokremičitého skla sa prenesie predpísané mnozstvo skúsanej látky (m v g). Pridá sa 25,0 ml hydroxidu draselného, liehového roztoku 0,5 mol/l VS a niekoľko sklených guľôčok. Pripojí sa chladič, a ak nie je predpísané inak, zahrieva sa 30 min pod spätným chladičom. Po pridaní 1 ml fenolftaleínu, roztoku R1 sa ihneď titruje (este za horúca) kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l VS (n₁ v ml kyseliny chlorovodíkovej 0,5 mol/l VS).

Za tých istých podmienok sa vykoná slepý pokus (n₂ v ml kyseliny chlorovodíkovej 0,5 mol/l VS).

2.5.7. NEZMYDELNITEĽNÉ LÁTKY

Pod pojmom "nezmydelniteľné látky" sa rozumejú látky, ktoré neprchajú pri teplote 100 °C az 105 °C a ktoré sa extrahujú z roztoku skúsanej látky organickým rozpúsťadlom po jej zmydelnení. Výsledok sa vyjadruje v percentách (m/m).

Pri skúske sa pouzije odmastené laboratórne sklo so zábrusom.

Predpísané mnozstvo skúsanej látky (m v g) sa prenesie do 250-ml banky so spätným chladičom. Pridá sa 50 ml hydroxidu draselného, liehového roztoku 2 mol/l R a 1 h sa za častého miesania zahrieva na vodnom kúpeli. Ochladí sa na teplotu pod 25 °C a obsah banky sa kvantitatívne preleje do deliaceho lievika so 100 ml vody R. Kvapalina sa opatrne pretrepáva
3-krát, vzdy so 100 ml éteru bez peroxidických látok R. Zmiesané éterové vrstvy sa v ďalsom deliacom lieviku niekoľko minút mierne pretrepávajú so 40 ml vody R. Po oddelení vrstiev sa vodná vrstva dekantuje. Éterová vrstva sa 2-krát premyje, vzdy 40 ml vody R a potom sa striedavo premýva 3-krát, vzdy 40 ml roztoku hydroxidu draselného R 30 g/l a 40 ml vody R. Éterová vrstva sa premýva so 40 ml vody R dovtedy, kým vodná vrstva uz viac nereaguje zásadito na fenolftaleín. Éterová vrstva sa prenesie do vopred odvázenej banky a deliaci lievik sa premyje éterom bez peroxidických látok R.

Éter sa opatrne oddestiluje a k zvysku sa pridá 6 ml acetónu R. Rozpúsťadlo sa nechá dôkladne vyprchať prúdom vzduchu a zvysok sa vysusí pri teplote 100 °C az 105 °C do konstantnej hmotnosti. Ochladí sa v exsikátore a odvázi sa (a v g).

Zvysok sa rozpustí v 20 ml liehu 96 % R ktorý sa vopred zneutralizoval fenolftaleínom, roztokom R a titruje sa hydroxidom sodným, liehovým roztokom 0,1 mol/l VS. Ak je spotreba hydroxidu sodného, liehového roztoku 0,1 mol/l VS väčsia ako 0,2 ml, oddelenie vrstiev nie je úplné a odvázený zvysok sa nemôze povazovať za nezmydelniteľnú látku. V prípade pochybnosti sa skúska musí zopakovať.

2.5.31 RIBÓZA V POLYSACHARIDOVÝCH OČKOVACÍCH LÁTKACH

Skúsaný roztok. V odmernej banke vhodného objemu sa pripraví roztok, ktorý obsahuje asi 5 mg na mililiter suchého polysacharidu. Obsah fľasky sa kvantitatívne prenesie do odmernej banky a zriedi sa vodou R po značku. Roztok sa zriedi tak, aby objem, ktorý sa na skúsku pouzije, obsahoval 2,5 mg az 25 mg ribózy. Po 0,20 ml a 0,40 ml zriedeného roztoku sa odmeria zakazdým do troch reagenčných skúmaviek.

Referenčné roztoky. 25 mg ribózy R sa rozpustí vo vode R a doplní sa vodou R do 100,0 ml (zásobný roztok: 0,25 g ribózy na liter). V čase potreby sa 1 ml zásobného roztoku zriedi vodou R na 10,0 ml (pracovné riedenie: 25 mg ribózy na liter). Do siestich reagenčných skúmaviek sa pipetou prenesie 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml, 0,60 ml, 0,80 ml a 1,0 ml pracovného riedenia.

Na slepý pokus sa pouzijú 2 ml vody R.

Obsah kazdej skúmavky sa doplní vodou R do 2 ml a pretrepe sa. Do kazdej skúmavky sa pridajú 2 ml roztoku chloridu zelezitého R 0,5 g/l v kyseline chlorovodíkovej R a pretrepú sa. Po pridaní 0,2 ml roztoku orcinolu R 100 g/l v etanole R skúmavky sa na 20 min vlozia do vodného kúpeľa. Po ochladení v ľadovej vode sa meria absorbancia (2.2.25) kazdého roztoku pri 670 nm oproti slepému roztoku. Obsah ribózy v skúsaných roztokoch sa odčíta z kalibračnej krivky, ktorá sa zostrojí z absorbancií siestich referenčných roztokov a zodpovedajúceho obsahu ribózy. Vypočíta sa priemer z troch meraní.

2.5.32 MIKROMETÓDA KULOMETRICKÁ TITRÁCIA

PRINCÍP

Kulometrická titrácia vody je kvantitatívna metóda zalozená na reakcii vody s oxidom siričitým a jódom v nevodnom prostredí za prítomnosti zásady s dostatočne tlmivou kapacitou. Na rozdiel od opísanej odmernej metódy (2.5.12) sa jód produkuje elektrochemicky oxidáciou jodidu v reakčnej kyvete. Vyprodukovaný jód na anóde ihneď reaguje s vodou a oxidom siričitým v reakčnej kyvete. Mnozstvo vody v látke je priamo úmerné mnozstvu elektrického náboja az do ekvivalenčného bodu titrácie. Ak sa celé mnozstvo vody v reakčnej kyvete spotrebuje, dosiahne sa ekvivalenčný bod, a prejaví sa nadbytok jódu. 1 mól jódu zodpovedá
1 mólu vody a mnozstvo elektrického náboja 10,71 C zodpovedá 1 mg vody.

Vlhkosť sa zo systému odstráni vopred vykonanou elektrolýzou. Jednotlivé stanovenia sa môzu vykonať postupne v tom istom reagenčnom roztoku za týchto podmienok:

- kazdá zlozka skúsanej zmesi je kompatibilná s ostatnými zlozkami,

- ziadna iná reakcia neprebieha,

- dostatočný objem a reakčná kapacita elektrolytu s vodou.

Kulometrická titrácia je obmedzená na stanovenie malého mnozstva vody. Odporúča sa rozmedzie 10 g az 10 mg vody. Precíznosť a presnosť metódy sú prevazne určené mierou vylúčenia vlhkosti vzduchu zo systému. Kontrola systému sa musí sledovať meraním rozsahu výchylky od základnej línie.

PRÍSTROJ

Prístroj pozostáva z reakčnej kyvety, elektród a magnetického miesadla. Reakčnú kyvetu tvorí veľká anódová komora a mensia katódová komora. V závislosti od tvaru elektródy môzu byť obidve komory od seba oddelené membránou. Kazdá komora obsahuje platinovú elektródu. Kvapalné alebo rozpustené vzorky sa aplikujú cez membránu injekčnou striekačkou. Druhou moznosťou je postup odparovania, pri ktorom sa vzorka v trubici zahreje v piecke; odparená voda sa vháňa prúdom suchého inertného plynu do kyvety. Vháňanie tuhých vzoriek do kyvety sa vseobecne neodporúča. Ak sa to predsa vyzaduje, vháňanie sa vykonáva cez uzatvárateľný otvor. Pritom sa musí zabrániť vniknutiu vlhkosti zo vzduchu, napr. prácou v rukavicovom boxe v atmosfére suchého inertného plynu. Analytický postup sa kontroluje vhodným elektronickým prístrojom, ktorý zobrazuje výsledky.

POSTUP

Podľa návodu výrobcu sa komory reakčnej kyvety naplnia elektrolytom na mikrostanovenie vody R a vykoná sa kulometrická titrácia az po dosiahnutie ustáleného ekvivalenčného bodu. Predpísané mnozstvo skúsanej látky sa prenesie do reakčnej kyvety a 30 s sa miesa, ak nie je v článku uvedené inak a znova sa titruje do ekvivalenčného bodu. Ak sa pouzije pec, predpísané mnozstvo vzorky sa vlozí do trubice a zahrieva sa. Obsiahnutá voda vo vzorke sa po odparení dostáva do titračnej kyvety a začne prebiehať titrácia. Po dosiahnutí ekvivalenčného bodu sa na prístroji odčíta hodnota, z ktorej sa vypočíta mnozstvo vody obsiahnuté vo vzorke alebo sa vyjadrí percentuálne. Ak je to vhodné pre typ skúsanej látky a jej prípravu, vykoná sa slepý pokus.

OVERENIE PRESNOSTI

Medzi dvoma po sebe nasledujúcimi titráciami sa presne odvázené mnozstvo vody, aké je obsiahnuté vo vzorke, prenesie do prístroja. Na tento účel sa pouzije sa voda R alebo referenčný roztok na mikrostanovenie vody R, a vykoná sa kulometrická titrácia. Stupeň regenerácie je po pridaní 1 000 g vody v rozmedzí 97,5 % az 102,5 % a po pridaní 100 g vody v rozmedzí 90,0 % az 110,0 %.

2.6. BIOLOGICKÉ SKÚSKY

2.6.1. STERILITA

Skúska sa vzťahuje na látky, lieky alebo predmety, ktoré musia byť podľa liekopisu sterilné. Vyhovujúci výsledok znamená len to, ze sa v podmienkach skúsky nedokáze ziadny kontaminujúci mikroorganizmus v skúsanej vzorke. Ďalsie poziadavky na dôkaz sterility sarze sú uvedené v smernici na konci tohto textu.

OPATRENIA PROTI MIKROBIÁLNEJ KONTAMINÁCII

Skúska na sterilitu sa vykonáva v aseptických podmienkach s pouzitím napr. sterilného boxu s laminárnym prúdením vzduchu triedy A umiestneného v čistom priestore triedy B alebo izolátora. Prijaté opatrenia proti náhodnej kontaminácii nesmú inaktivovať mikroorganizmy, ktoré sa majú skúskou dokázať. Pracovné podmienky, v ktorých sa skúsky vykonávajú, sa pravidelne monitorujú vhodným odberom vzoriek z pracovných plôch a kontrolou podľa príslusných smerníc Európskej únie a odporúčaní SVP.

ZIVNÉ P DY

Zivné pôdy na skúsku sa môzu pripraviť podľa ďalej uvedeného postupu alebo sa môzu pouziť susené pôdy za predpokladu, ze po rozpustení budú vyhovovať skúske na rastové vlastnosti.

Nasledujúce zivné pôdy boli overené ako vhodné na skúsku sterility. Tioglykolátová pôda je určená predovsetkým na kultiváciu anaeróbnych baktérií, ale je schopná detegovať aj aeróbne baktérie. Enzymatický hydrolyzát kazeínu a sóje je určený predovsetkým na kultiváciu aeróbnych baktérií, ale je vhodný aj na kultiváciu húb. Môzu sa pouziť aj iné zivné pôdy za predpokladu, ze preukázali schopnosť podporovať rast väčsiny druhov mikroorganizmov.

Tioglykolátová pôda

Hodnota pH po sterilizácii: 7,1 0,2.

L-Cystín, agar, chlorid sodný, glukóza, kvasničný autolyzát a pankreatický hydrolyzát kazeínu sa zmiesajú s 1 000 ml čistenej vody a zahrievajú sa do rozpustenia. Nátriumtioglykolát alebo kyselina tioglykolová sa rozpustí v tomto roztoku a v prípade potreby sa upraví hodnota pH zivnej pôdy hydroxidom sodným 1 mol/l tak, aby po sterilizácii bola 7,1 0,2. Ak je potrebná filtrácia, roztok sa znova zahreje k varu (nevarí sa) a este za horúca sa prefiltruje cez navlhčený filtračný papier. Pridá sa čerstvo pripravený roztok nátriumresazurinátu a premiesa sa. Zivná pôda sa naplní do vhodných nádob do takej výsky, aby zóna indikujúca farebný prechod oxidačno-redukčného indikátora počas inkubácie neprekročila hornú tretinu zivnej pôdy. Sterilizuje sa v autokláve validovaným postupom. Uchováva sa v sterilných, dobre uzavretých nádobách pri teplote 2 °C az 25 °C do okamzitého pouzitia. Ak treba, zivná pôda sa regeneruje tesne pred pouzitím, napr. 20-minútovým zahrievaním na vodnom kúpeli a rýchlym ochladením; pritom treba zabrániť vniknutiu nesterilného vzduchu do nádoby.

Enzymatický hydrolyzát kazeínu a sóje

Hodnota pH po sterilizácii: 7,3 0,2.

Tuhé látky sa za mierneho zahriatia rozpustia v čistenej vode. Roztok sa ochladí na izbovú teplotu. Ak treba, upraví sa hodnota pH zivnej pôdy hydroxidom sodným 1 mol/l tak, aby po sterilizácii bola 7,3 0,2. Ak treba, roztok sa prefiltruje, aby sa vyčíril, naplní sa do vhodných nádob a validovaným postupom sa sterilizuje. Uchováva sa v sterilných, dobre uzavretých nádobách pri teplote 2 °C az 25 °C do okamzitého pouzitia.

Pouzité zivné pôdy, či opísané alebo iné, musia vyhovovať ďalej uvedeným skúskam. Vykonajú sa pred skúskou alebo súčasne so skúskou sterility skúsaného produktu.

Sterilita. Zivné pôdy sa inkubujú 14 dní pri teplotách uvedených v tabuľke 2.6.1.-1. Nesmie sa prejaviť nijaký rast mikroorganizmov.

Skúska rastových vlastností. Jednotlivé objemy tioglykolátovej pôdy sa naočkujú malým počtom mikroorganizmov (vhodných je 10 az 100 jednotiek), najmenej jeden druh aeróbnych baktérií a jeden druh anaeróbnych baktérií. Na enzymatický hydrolyzát kazeínu a sóje sa pouzije najmenej jeden druh húb a jeden druh aeróbnych baktérií. Dôlezité druhy pre zivné pôdy sa uvádzajú v tabuľke 2.6.1.-1. Mikroorganizmy sa inkubujú v podmienkach uvedených
v tabuľke 2.6.1.-1 najviac 3 dni pri dôkaze baktérií a najviac 5 dní pri dôkaze húb.

Na udrziavanie naočkovaných kultúr sa pouzije taká technika, aby sa zivé mikroorganizmy pouzité na inokuláciu najviac 5-krát pasázovali z pôvodného inokula.

Zivné pôdy sú vhodné, ak sa v nich prejaví zreteľne viditeľný rast mikroorganizmov.

Tabuľka 2.6.1.-1. Testovacie mikroorganizmy vhodné na skúsku rastových vlastností

a validáciu skúsky

VALIDÁCIA SKÚSKY

Jednotlivé objemy tioglykolátovej pôdy sa naočkujú s malým počtom mikroorganizmov (vhodných je 10 az 100 jednotiek) s aeróbnymi a anaeróbnymi baktériami, ktoré sa uvádzajú
v tabuľke 2.6.1.-1. Na enzymatický hydrolyzát kazeínu a sóje sa pouzijú huby a aeróbne baktérie uvedené v tabuľke 2.6.1.-1. Skúska sa vykoná tak, ako sa opisuje pri Skúske na sterilitu skúsaného produktu, pouzitím tej istej metódy s výnimkou týchto modifikácií:

Membránová filtrácia. Obsah z nádoby alebo z nádob sa prenesie na membránu. Do konečného objemu sterilnej kvapaliny na premytie filtra sa pridá inokulum s malým mnozstvom zivých mikroorganizmov (vhodných je 10 az 100 jednotiek).

Priame očkovanie. Obsah z nádoby alebo z nádob (pri katgute a iných chirurgických nitiach na veterinárne pouzitie: nite) sa prenesie do zivnej pôdy, do ktorej sa pridá inokulum s malým mnozstvom zivých mikroorganizmov (vhodných je 10 az 100 jednotiek).

V obidvoch prípadoch sa vykoná skúska rastových vlastností ako pozitívna kontrola. Vsetky nádoby so zivnou pôdou sa inkubujú pri teplotách uvedených v tabuľke 2.6.1.-1 najdlhsie 3 dni pri dôkaze baktérií a 5 dní pri dôkaze húb.

Ak sa po inkubácii prejaví zreteľne viditeľný rast naočkovaných mikroorganizmov vizuálne porovnateľný s rastom mikroorganizmov v kontrolných nádobách bez produktu, znamená to, ze produkt nemá antimikrobiálne vlastnosti v podmienkach skúsky alebo ze sa táto aktivita dostatočne eliminovala. Skúska na sterilitu sa môze vykonať bez ďalsích modifikácií.

Ak sa po inkubácii v prítomnosti skúsaného produktu neprejaví zreteľne viditeľný rast, vizuálne porovnateľný s rastom mikroorganizmov v kontrolných nádobách bez produktu, znamená to, ze produkt má antimikrobiálne vlastnosti, ktoré neboli dostatočne eliminované
v podmienkach skúsky. Podmienky sa musia modifikovať tak, aby sa vylúčila antimikrobiálna aktivita, a validácia skúsky sa zopakuje.

Validácia sa vykoná:

a) ak sa skúska na sterilitu musí vykonať s novým produktom,

b) kedykoľvek pri zmene experimentálnych podmienok skúsky.

Validácia sa môze vykonať súčasne so Skúskou na sterilitu skúsaného produktu, ale pred vyhodnotením výsledkov skúsky.

SKÚSKA NA STERILITU SKÚSANÉHO PRODUKTU

Skúska sa môze vykonať metódou membránovej filtrácie alebo priamym očkovaním skúsaného produktu do zivných pôd. V obidvoch prípadoch sa robí negatívna kontrola
s pouzitím produktu, ktorý je známy ako sterilný. Ak to povaha produktu dovoľuje, pouzije sa vzdy metóda membránovej filtrácie, t. j. pri vodných filtrovateľných prípravkoch, liehových alebo olejových prípravkoch a pri prípravkoch miesateľných alebo rozpustných vo vodných alebo olejových rozpúsťadlách; tieto rozpúsťadlá nesmú mať v podmienkach skúsky antimikrobiálny účinok.

Membránová filtrácia. Pouzívajú sa membránové filtre s najväčsou nominálnou veľkosťou pórov 0,45 m, ktoré preukázali schopnosť zachytávať mikroorganizmy. Celulózonitrátové filtre sa pouzívajú napríklad pri vodných, olejových a slabo liehových roztokoch a celulózoacetátové filtre sa pouzívajú pri silných liehových roztokoch. Na niektoré produkty, napr. antibiotiká, sa môzu pouziť osobitne prispôsobené filtre.

Pri ďalej opísanej metóde sa pouzívajú filtre s priemerom asi 50 mm. Ak sa pouzijú filtre
s iným priemerom, musí sa im prispôsobiť objem riediacej a premývacej kvapaliny. Filtračný prístroj a membránový filter sa sterilizujú vhodným spôsobom. Prístroj treba zostaviť tak, aby umoznil zavedenie a filtráciu skúsaného roztoku za aseptických podmienok, vybratie membránového filtra a jeho prenesenie do zivnej pôdy, ako aj pridanie zivných pôd do prístroja a následnú inkubáciu.

Vodné roztoky. Do prístroja sa na membránový filter nanesie malé mnozstvo vhodnej sterilnej riediacej kvapaliny, napr. neutrálneho roztoku mäsového alebo kazeínového peptónu 1 g/l s pH 7,1 0,2, a prefiltruje sa. Riediaca kvapalina môze obsahovať vhodné neutralizačné látky i potrebné inaktivačné látky, napr. pri antibiotikách.

Celý obsah skúsaného produktu sa prenesie z nádoby alebo z nádob na membránu alebo membrány; ak treba, obsah sa zriedi vhodnou sterilnou riediacou kvapalinou asi na 100 ml alebo sa pouzije najmenej také mnozstvo skúsaného produktu, aké je predpísané v tabuľke 2.6.1.-2. Ihneď sa prefiltruje. Ak má produkt antimikrobiálne vlastnosti, membránový filter sa premyje najmenej trojnásobným prefiltrovaním sterilnej riediacej kvapaliny, vzdy takého objemu, aký sa pouzil na validáciu skúsky. Membránový filter sa celý prenesie do zivnej pôdy alebo sa asepticky rozstrihne na dve polovice, z ktorých kazdá sa prenesie do dvoch vhodných zivných pôd. Rovnako sa môze zivná pôda preniesť na filter v prístroji. Pouzije sa ten istý objem zivnej pôdy ako pri validácii skúsky. Ak nie je predpísané inak, zivné pôdy sa inkubujú pri teplote 30 C az 35 C najmenej 14 dní pri dôkaze baktérií a pri teplote 20 C az 25 C pri dôkaze húb.

Rozpustné tuhé látky. Na kazdú zivnú pôdu sa pouzije najmenej také mnozstvo produktu, aké je predpísané v tabuľke 2.6.1.-2; produkt sa rozpustí vo vhodnom rozpúsťadle, napr. v neutrálnom roztoku mäsového alebo kazeínového peptónu 1 g/l, a postupuje sa tým istým spôsobom ako sa opisuje pri vodných roztokoch s pouzitím vhodného membránového filtra pre určené rozpúsťadlo.

Oleje a olejové roztoky. Na kazdú zivnú pôdu sa pouzije najmenej také mnozstvo skúsaného produktu, aké je predpísané v tabuľke 2.6.1.-2. Oleje a olejové roztoky s dostatočne nízkou viskozitou sa môzu bez riedenia filtrovať cez suchý membránový filter. Viskózne oleje sa môzu riediť vhodnou sterilnou riediacou kvapalinou, napr. izopropylmyristátom, ktorý
v podmienkach skúsky nepreukázal antimikrobiálny účinok. Olej sa nechá penetrovať cez membránový filter vlastnou váhou a prefiltruje sa s pouzitím zvysovania tlaku alebo odsávania. Membránový filter sa najmenej 3-krát premyje prefiltrovaním, vzdy 100 ml vhodnej sterilnej kvapaliny, napr. neutrálneho roztoku mäsového alebo kazeínového peptónu 1 g/l obsahujúceho polysorbát 80 10 g/l alebo iný emulgátor vo vhodnej koncentrácii, ktorý v podmienkach skúsky nepreukázal nijaký antimikrobiálny účinok. Membránový filter alebo filtre sa prenesú do zivnej pôdy alebo do zivných pôd, alebo naopak, ako sa opisuje pri vodných roztokoch, a inkubujú sa rovnako dlho pri takej istej teplote.

Masti a krémy. Na kazdú zivnú pôdu sa pouzije najmenej také mnozstvo skúsaného produktu, aké je predpísané v tabuľke 2.6.1.-2. Masti s hydrofóbnym základom a emulzie typu v/o sa môzu zriediť izopropylmyristátom v pomere 1:100, ako sa uz opísalo, ak treba, zahriatím na teplotu najviac 40 C. Vo výnimočných prípadoch sa môzu zahriať najviac na teplotu 44 C. Čo najrýchlejsie sa prefiltrujú a postupuje sa takým istým spôsobom, aký sa opisuje pri olejoch a olejových roztokoch.

Priame očkovanie do zivných pôd. Do zivnej pôdy sa priamo naočkuje mnozstvo skúsaného produktu predpísané v tabuľke 2.6.1.-2, pričom objem produktu nemá byť väčsí ako 10 %
z celého objemu zivnej pôdy, ak nie je predpísané inak.

Ak má skúsaný produkt antimikrobiálny účinok, skúsa sa po neutralizácii vhodnou neutralizačnou látkou alebo po zriedení dostatočným mnozstvom zivnej pôdy. Ak treba skúsať veľké objemy produktu, môze sa pouziť koncentrovaná zivná pôda pripravená takým spôsobom, ze sa berie do úvahy nasledujúce zriedenie. V niektorých prípadoch sa môze koncentrovaná zivná pôda pridať do skúsaného produktu priamo v jeho obale.

Olejové kvapaliny. Do zivnej pôdy sa pridá polysorbát 10 g/l alebo iný emulgátor vo vhodnej koncentrácii, ktorý v podmienkach skúsky nepreukázal antimikrobiálny účinok.

Masti a krémy. Pripraví sa riedenie skúsaného produktu v pomere 1:10 emulgáciou vhodným emulgátorom vo vhodnej sterilnej riediacej kvapaline, napr. v neutrálnom roztoku mäsového alebo kazeínového peptónu 1 g/l. Zriedený produkt sa prenesie do zivnej pôdy, ktorá neobsahuje emulgátor.

Ak nie je predpísané inak, naočkované zivné pôdy sa inkubujú najmenej 14 dní pri teplotách uvedených v tabuľke 2.6.1.-1. Zivné pôdy sa počas inkubácie niekoľkokrát odčítajú. Zivné pôdy s olejovými produktmi sa kazdý deň opatrne pretrepú. Ak sa na dôkaz anaeróbnych mikroorganizmov pouzije tioglykolátová alebo iná podobná zivná pôda, musí sa trepanie alebo miesanie obmedziť na minimum, aby sa zachovali anaeróbne podmienky.

Katgut a iné chirurgické nite na veterinárne pouzitie. Na kazdú zivnú pôdu sa pouzije najmenej také mnozstvo produktu, aké je predpísané v tabuľke 2.6.1.-2. Uzavretý obal sa v aseptických podmienkach otvorí a na kazdú zivnú pôdu sa pouzijú tri úseky nite. Skúsajú sa 30 cm dlhé časti odstrihnuté na začiatku, v strede a na konci celého zvitku. Pouzije sa celý zvitok z čerstvo otvoreného obalu. Kazdý úsek nite sa prenesie do vybranej zivnej pôdy. Na ponorenie skúsaného materiálu sa pouzije dostatočné mnozstvo zivnej pôdy (20 ml az 150 ml).

ODČÍTANIE A VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV

V určených intervaloch počas inkubácie a na jej konci sa v zivných pôdach hodnotia makroskopické známky mikrobiálneho rastu. Ak skúsaný produkt spôsobuje zákal zivnej pôdy tak, ze prítomnosť alebo neprítomnosť mikrobiálnej kontaminácie sa 14 dní po inkubácii nedá ľahko vizuálne určiť, prenesie sa potrebná časť zivnej pôdy do ďalsích nádob s tou istou čerstvo pripravenou zivnou pôdou. Pokračuje sa v inkubácii pôvodných aj preočkovaných zivných pôd celkovo najmenej 14 + 7 dní od pôvodnej inokulácie.

Ak sa neprejaví mikrobiálny rast, skúsaný produkt vyhovuje skúske na sterilitu. Ak sa prejaví mikrobiálny rast, skúsaný produkt nevyhovuje skúske na sterilitu, kým sa zreteľne nedokáze, ze skúska nebola platná z dôvodov nesúvisiacich so skúsaným produktom. Skúska sa môze povazovať za neplatnú, ak sa splní niektorá z týchto podmienok:

a) údaje o mikrobiologickej kontrole skúsky na sterilitu ľahko preukázu chybu;

b) revízia metódy skúsania odhalí chybu v jej priebehu;

c) pri negatívnej kontrole sa zistí mikrobiálny rast;

d) po zistení totoznosti mikroorganizmov izolovaných zo skúsky sa rast tohto druhu alebo týchto druhov jednoznačne pripisuje chybám materiálu alebo technickej chybe v metodickom riadení skúsky sterility.

Ak sa skúska deklaruje ako neplatná, opakuje sa s rovnakým počtom jednotiek ako v prvej skúske.

Ak sa v opakovanej skúske neprejaví mikrobiálny rast, skúsaný produkt vyhovuje skúske na sterilitu. Ak sa v opakovanej skúske prejaví rast, skúsaný produkt nevyhovuje skúske na sterilitu.

SKÚSKA STERILITY PARENTERÁLNYCH PRÍPRAVKOV, OČNÝCH A INÝCH NEPARENTERÁLNYCH PRÍPRAVKOV, KTORÉ MUSIA VYHOVOVAŤ SKÚSKE NA STERILITU

Pri metóde membránovej filtrácie sa vzdy, ak je to mozné, skúsa celý obsah obalu, ale
v kazdom prípade najmensie mnozstvo, aké je uvedené v tabuľke 2.6.1.-2, ak treba, zriedením vhodným sterilným roztokom, napr. neutrálnym roztokom mäsového alebo kazeínového peptónu 1 g/l na asi 100 ml. Celkový objem premývacej kvapaliny cez jeden membránový filter nemá prekročiť 1 000 ml, ak nie je určené inak.

Pri metóde priameho očkovania do zivných pôd sa skúsajú mnozstvá uvedené v tabuľke 2.6.1.-2. Skúsky na baktérie a huby sa vykonávajú s tou istou vzorkou skúsaného produktu. Ak objem alebo mnozstvo jednotlivého obalu nestačí na vykonanie týchto skúsok, pouzije sa obsah dvoch alebo viacerých obalov na inokuláciu zivných pôd.

Ak je objem kvapaliny v jednom obale väčsí ako 100 ml, pouzije sa metóda membránovej filtrácie, ak nie je určené inak.

Tabuľka 2.6.1.-2. Mnozstvá skúsaného produktu na skúsku sterility

SMERNICA NA SKÚSKY STERILITY

Cieľom skúsky na sterilitu, tak ako vsetkých liekopisných skúsok, je poskytnúť nezávis- lému analytikovi prostriedky na overenie, či daný produkt zodpovedá poziadavkám Európskeho liekopisu. Výrobca nie je povinný vykonať tieto skúsky, ani pouziť zmeny alebo alternatívy
v danej metóde, ak sa ubezpečí, ze daný materiál skúsaný oficiálnou metódou bude vyhovovať poziadavkám Európskeho liekopisu.

Pokyny pre výrobcov. Miera záruky, ze výsledok skúsky na sterilitu bude vyhovujúci (neprítomnosť kontaminovaných jednotiek vo vzorke), keďze sa vzťahuje na kvalitu sarze, závisí od homogenity sarze, výrobných podmienok a efektívnosti prijatého plánu vzorkovania. Preto sa na účely tohto textu sarza definuje ako homogénny súbor uzavretých nádob pripravených takým spôsobom, aby bolo riziko kontaminácie rovnaké pre kazdú jednotku
v tomto súbore.

Ak biologicky podlozené a automaticky zaznamenávané fyzikálne skúsky dokázu, ze priebeh sterilizácie finálne sterilizovaných produktov mal správny účinok na celú sarzu, dáva to väčsiu záruku ako skúska na sterilitu. Okolnosti, za akých sa parametrické prepustenie môze povazovať za vhodné, sa opisujú v článku Metódy prípravy sterilných produktov (5.1.1). Na validáciu procesu aseptickej výroby sa môze pouziť sériové plnenie zivných pôd. Okrem toho, ze skúska sterility je jedinou analytickou metódou, dostupnou pre produkty pripravené v aseptických podmienkach, je v kazdom prípade aj jedinou analytickou metódou, dostupnou pre kompetentné autority, ktoré musia posudzovať vzorku produktu na sterilitu.

Pravdepodobnosť dôkazu mikroorganizmov pri skúske na sterilitu vzrastá s ich mnozstvom v skúsanej vzorke a kolíse podľa schopnosti rastu prítomných mikroorganizmov. Pritom pravdepodobnosť dôkazu veľmi nízkej hladiny kontaminácie, aj keď homogénne rozptýlenej
v celej sarzi, je veľmi nízka. Posúdenie výsledkov skúsky na sterilitu sa zakladá na predpoklade, ze obsah vsetkých nádob skúsaných v jednej sarzi bude dávať rovnaký výsledok. Keďze vsak nie je mozné kontrolovať kazdú nádobu, treba prijať vhodný plán vzorkovania.
V prípade aseptickej výroby sa odporúča zahrnúť vzorky plnené na začiatku a na konci sarze a po významnom zásahu.

Pokyn pre najmensí odporúčaný počet skúsaných vzoriek vo vzťahu k veľkosti sarze je uvedený v tabuľke 2.6.1.-3. Uvedené odporúčania musia brať do úvahy objem jednotlivých nádob, validáciu sterilizačnej metódy, ako aj iné okolnosti súvisiace so zamýsľanou sterilitou produktov.

Tabuľka 2.6.1.-3. Najmensí odporúčaný počet skúsaných jednotiek

Ak obsah jednej nádoby stačí na inokuláciu obidvoch zivných pôd, tento stĺpec udáva počet nádob potrebných na obidve zivné pôdy spolu.

2.6.7. DÔKAZ MYKOPLAZIEM

Na dôkaz prítomnosti mykoplaziem v primárnych tkanivových kultúrach, pracovných tkanivových kultúrach, vo vírusovom inokule alebo v kontrolných bunkách sa pouzíva metóda na zivných pôdach alebo fluorescenčná metóda na tkanivových kultúrach. Na dôkaz prítomnosti mykoplaziem-DNA sa pouzije fluorescenčná metóda na tkanivových kultúrach. Na skúsku pomnozeného vírusu, pripravenej očkovacej látky v zásobnej nádobe alebo vo forme finálneho produktu sa pouzije metóda na zivných pôdach. Ak treba, fluorescenčná metóda na tkanivových kultúrach sa môze pouziť v prípade potreby aj na kontrolu zivných pôd.

METÓDA NA ZIVNÝCH PÔDACH

Výber zivných pôd

Na skúsku sa pouzívajú kvapalné a tuhé zivné pôdy; zivné pôdy musia byť v dostatočnom objeme, aby sa zabezpečil rast mykoplaziem potenciálne prítomných v skúsanom produkte aj v malom mnozstve. Kvapalné zivné pôdy musia obsahovať fenolovú červeň. Nutričné vlastnosti kazdej novej sarze zivnej pôdy sa overujú aspoň s týmito mikroorganizmami:

Acholeplasma laidlawii (očkovacie látky na humánne a veterinárne pouzitie, ak sa na produkciu pouzilo antibiotikum),

Mycoplasma gallisepticum (ak sa na produkciu pouzili vtáčie tkanivové kultúry, alebo ak je očkovacia látka určená pre hydinu),

Mycoplasma hyorhinis (očkovacie látky na veterinárne pouzitie okrem vtáčích),

Mycoplasma orale (očkovacie látky na humánne a veterinárne pouzitie),

Mycoplasma pneumoniae (očkovacie látky na humánne pouzitie) alebo iný vhodný druh fermentujúci D-glukózu,

Mycoplasma synoviae (ak sa na produkciu pouzili vtáčie tkanivové kultúry, alebo ak je očkovacia látka určená pre hydinu).

Pouzité testovacie kmene sú izolované z divokých kmeňov, ktoré presli najviac 15-mi pasázami a sú uchovávané v zmrazenom alebo lyofilizovanom stave. Po klonovaní sa kmene identifikujú vhodnou metódou porovnaním s typovými kultúrami, napríklad

A. laidlawii NCTC 10116 CIP 75.27 ATCC 23206

M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610

M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981

M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714

M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531

M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204

Kultivačné podmienky

Naočkované zivné pôdy sa rozdelia na dve rovnaké skupiny, z ktorých jedna sa inkubuje
v aeróbnych podmienkach a druhá v mikroaerofilných podmienkach. Tuhé zivné pôdy sa udrzujú pri dostatočnej vlhkosti ovzdusia, aby sa ich povrch nevysusil. V aeróbnych podmienkach sa tuhé pôdy inkubujú v atmosfére vzduchu, ktorý obsahuje 5 % az 10 % oxidu uhličitého. V mikroaerofilných podmienkach sa tuhé pôdy inkubujú v atmosfére dusíka, ktorý obsahuje 5 % az 10 % oxidu uhličitého.

Rastové vlastnosti

Skúska na rastové vlastnosti sa vykoná s kazdou novou sarzou zivnej pôdy. Vybrané zivné pôdy sa naočkujú vhodnými testovacími mikroorganizmami v mnozstve najviac 100 kolónie-tvorných jednotiek na platňu s priemerom 60 mm, ktorá obsahuje 9 ml tuhej zivnej pôdy
a najviac 40 kolónietvorných jednotiek na 100 ml zodpovedajúcej kvapalnej zivnej pôdy. Na kazdý druh mikroorganizmu sa pouzije iná platňa a nádoba. Zivné pôdy sa inkubujú v takých istých podmienkach, aké sa pouzijú pri skúske skúsaného produktu (aeróbne i mikroaerofilné, v závislosti od druhu testovacieho mikroorganizmu). Zivné pôdy vyhovujú skúske, ak v nich naočkované mikroorganizmy vykazujú primeraný rast, ktorý je sprevádzaný zreteľnou zmenou zafarbenia v kvapalnej zivnej pôde.

Inhibičné látky

Urobí sa skúska na Rastové vlastnosti za prítomnosti skúsaného produktu. V prípade, ze je rast testovacích mikroorganizmov v porovnaní s rastom za neprítomnosti skúsaného produktu zreteľne slabsí, skúsaný produkt obsahuje inhibičné látky. Tie sa musia neutralizovať alebo ich účinok nejakým spôsobom eliminovať (napr. riedením skúsaného produktu) pred skúskou na mykoplazmy. Účinnosť neutralizačného postupu sa overí zopakovaním skúsky na Inhibičné látky po neutralizácii.

Postup

Na tuhé zivné pôdy sa pouzijú Petriho misky s priemerom 60 mm, ktoré obsahujú 9 ml zivnej pôdy. Najmenej na dve misky s agarovou zivnou pôdou sa naočkuje po 0,2 ml skúsaného produktu a na 100 ml kvapalnej zivnej pôdy po 10 ml skúsaného produktu. Pôdy sa inkubujú 21 dní pri teplote 35 °C az 38 °C v aeróbnych a mikroaerofilných podmienkach a súčasne sa inkubuje nenaočkovaný podiel 100 ml z kazdej kvapalnej pôdy ako kontrola. V prípade, ze skúsaný produkt spôsobí významnú zmenu hodnoty pH zivnej pôdy, upraví sa na pôvodnú hodnotu pridaním roztoku hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej. Prvý, druhý
a tretí inkubačný deň sa z kazdej kvapalnej zivnej pôdy preočkuje po 0,2 ml na dve Petriho misky s tuhou zivnou pôdou. Zivné pôdy sa inkubujú najmenej 21 dní pri teplote 35 °C az
38 °C v aeróbnych a mikroaerofilných podmienkach. Tento postup sa zopakuje na siesty, siedmy a ôsmy deň a znova na trinásty a strnásty deň skúsky. Kvapalné zivné pôdy sa hodnotia kazdý druhý az tretí deň. V prípade, ze sa zmení zafarbenie, ihneď sa preočkuje. Agarové zivné pôdy sa hodnotia jedenkrát za týzdeň.

Ak sa v kvapalnej zivnej pôde prejaví bakteriálna alebo fungálna kontaminácia, skúska sa zopakuje. V prípade, ze sa po 7 dňoch od inokulácie najviac jedna platňa v niektorom stupni skúsky náhodne kontaminuje baktériami alebo hubami, alebo sa rozbije, nemusí sa táto platňa zahrnúť do hodnotenia za predpokladu, ze pri okamzitom vysetrení nevykazuje ziadne známky rastu mykoplaziem. Ak sa v ktoromkoľvek stupni skúsky viac ako jedna platňa náhodne kontaminuje baktériami alebo hubami, alebo sa rozbije, skúska nie je platná a musí sa opakovať.

Pripraví sa pozitívna kontrola inokuláciou najviac 100 kolónietvorných jednotiek vhodného kmeňa, napr. M. orale a M. pneumoniae.

Po uplynutí inkubačnej doby sa vsetky naočkované agarové pôdy mikroskopicky vysetrujú na dôkaz prítomnosti mykoplaziem. Skúsaný produkt vyhovuje skúske, ak ziadna vzorka nevykazuje rast mykoplaziem. V prípade, ze sa pri skúske dokáze rast mykoplaziem, skúska sa môze zopakovať s dvojnásobným mnozstvom inokula, zivných pôd a platní. Produkt vyhovuje poziadavkám skúsky, ak sa pri opakovanej skúske nedokáze ziadny rast mykoplaziem. Skúska je platná len vtedy, ak pozitívna kontrola vykazuje rast mykoplaziem.

DÔKAZ MYKOPLAZIEM DNA NA TKANIVOVÝCH KULTÚRACH FLUORESCENČNOU METÓDOU

Tkanivové kultúry sa zafarbia fluorescenčným farbivom, ktoré sa viaze na DNA. Mykoplazmy sú rozoznateľné charakteristickým zrnitým alebo vláknitým vzhľadom vo fluorescenčnom obraze. Nachádzajú sa na povrchu buniek, alebo v prípade masívnej kontaminácie aj v medzibunkovom priestore tkaniva.

Kontrola substrátu

Na predskúsku sa najskôr naočkuje tkanivová kultúra Vero inokulom najviac 100 kolónie-tvorných jednotiek kmeňa mykoplaziem, ktorý sa dobre rozmnozuje v kvapalnej alebo tuhej zivnej pôde (napr. M. hyorhinis alebo M. orale). Touto skúskou sa dokáze, či je metóda vhodná na dôkaz mykoplaziem. Môzu sa pouziť aj iné bunkové substráty, napr. produkčné tkanivové kultúry, za predpokladu, ze vykazujú aspoň rovnakú citlivosť na detekciu potenciálnych kontaminantov mykoplaziem.

Metóda

Podľa ďalej opísaného textu v odseku Postup sa tkanivová kultúra s indikátorom dvojmo naočkuje mnozstvom najmenej po 1 ml skúsaného produktu. Kontinuálny povrch kultúry musí byť najmenej 25 cm².

Do skúsky sa zaradí nenaočkovaná negatívna kontrola a dve pozitívne kontroly, v ktorých sa pouzijú kmene mykoplaziem, ako sú napr. M. hyorhinis alebo M. orale. Na pozitívnu kontrolu sa pouzije inokulum, ktoré obsahuje najviac 100 kolónietvorných jednotiek.

Ak pri skúske suspenzií vírusov rusivo pôsobia výrazné cytopatogénne účinky, môze sa vírus neutralizovať specifickým antisérom, ktoré nemá ziadny inhibičný účinok na rast mykoplaziem, alebo sa pouzije tkanivová kultúra, v ktorej vírus nevykazuje ziadne pomnozenie. Aby sa dokázal prípadný inhibičný účinok na rast mykoplaziem, vykoná sa pozitívna kontrola za prítomnosti a neprítomnosti antiséra.

Postup

Tkanivové kultúry s rovnorodou hustotou (2 x 10⁴ az 2 x 10⁵ buniek na mililiter alebo
4 x 10³ az 2,5 x 10⁴ buniek/cm²) sa inkubujú sa pri teplote 36 °C ± 1 °C najmenej 2 dni. Kultúry sa naočkujú skúsaným produktom a inkubujú sa najmenej 2 dni. Vykoná sa najmenej jedno preočkovanie; posledné preočkovanie sa robí na podlozných sklíčkach vo vhodnej nádobke alebo iných podlozkách vhodných na skúsku. Posledné preočkovanie sa musí vysetriť pred dosiahnutím konfluentného stádia, pretoze inak sa zabraňuje farbeniu
a prípadné mykoplazmy nemusia byť rozoznateľné.

Zivná pôda sa odstráni.

Kultúra sa opláchne najprv tlmivým fosforečnanovým roztokom s chloridom sodným s pH 7,4 R a potom zmesou rovnakých objemov tlmivého fosforečnanového roztoku s chloridom sodným s pH 7,4 R a vhodného fixačného roztoku. Nakoniec sa opláchne fixačným roztokom. Ak sa na farbenie pouzije bisbenzimid R, na fixáciu je vhodná čerstvo pripravená zmes 1 objemu kyseliny octovej, ľadovej R a 3 objemov metanolu R.

Pridá sa fixačný roztok a nechá sa 10 min stáť.

Fixačný roztok sa odstráni.

V prípade, ze sa má kultúra farbiť neskôr, musí sa dôkladne vysusiť. (Pri neúplnom vysusení podlozného sklíčka sa pri ďalsom farbení môzu tvoriť artefakty).

V prípade, ze sa má kultúra farbiť ihneď, fixačný roztok sa odstráni dvojnásobným premytím sterilnou vodou a výplach sa odstráni.

Na zafarbenie sa pridá bisbenzimid, pracovný roztok R alebo iné vhodné farbivo na DNA
a kultúra sa nechá 10 min stáť.

Farbivo sa odstráni a bunková vrstva sa opláchne vodou.

Ak je to mozné, kazdé podlozné sklíčko sa fixuje kvapkou zmesi rovnakých objemov glycerolu R a tlmivého fosforečnano-citrátového roztoku s pH 5,5 R; prebytok sa zotrie
z okrajov podlozného sklíčka.

Preparáty sa vysetrujú fluorescenčným mikroskopom pri stonásobnom az styristonásobnom alebo väčsom zväčsení. (Filter na budivé ziarenie: 330 nm/380 nm, ochranný filter LP 440 nm).

Porovnáva sa mikroskopický obraz skúsaných kultúr s pozitívnymi a negatívnymi kontrolami z hľadiska extranukleárnej fluorescencie. Mykoplazmy sa nachádzajú
v cytoplazme a niekedy v medzibunkovom priestore vo forme zrniek alebo vlákien.

Skúsaný produkt vyhovuje skúske, ak tkanivové kultúry, ktoré boli týmto produktom naočkované, nevykazujú ziadne známky prítomnosti mykoplaziem. Skúska je platná len vtedy, ak pozitívne kontroly vykazujú prítomnosť mykoplaziem.

Táto stať má povahu informácie a odporúčania a netvorí záväznú časť vseobecnej metódy.

ODPORÚČANÉ ZIVNÉ PÔDY PRE METÓDU NA ZIVNÝCH PÔDACH

Odporúčajú sa ďalej uvedené zivné pôdy. Môzu sa pouziť aj iné zivné pôdy za predpokladu, ze preukázali schopnosť podporovať rast mykoplaziem v kazdej sarzi zivnej pôdy za prítomnosti a neprítomnosti skúsaného produktu.

I. Zivné pôdy na dôkaz Mycoplasma gallisepticum

a) Kvapalná zivná pôda

Hodnota pH sa upraví na 7,8.

b) Tuhá zivná pôda

Pripraví sa uz opísaným spôsobom tak, ze bujón s infúziou z hovädzieho srdca sa nahradí zivným agarom s infúziou z hovädzieho srdca, ktorý obsahuje agar v koncentrácii 15 g/l.

II. Zivné pôdy na dôkaz Mycoplasma synoviae

a) Kvapalná zivná pôda

Roztok ß-nikotínamidadeníndinukleotidu a roztok cysteíniumchloridu sa zmiesa. Zmes sa nechá 10 min stáť a pridajú sa ostatné zlozky. Hodnota pH sa upraví na 7,8.

b) Tuhá zivná pôda

Hodnota pH zmesi sa upraví na 7,8 a sterilizuje sa v autokláve. Pridajú sa tieto zlozky:

III. Zivné pôdy na dôkaz mykoplaziem, ktoré nie sú vtáčieho pôvodu

a) Kvapalná zivná pôda

Hodnota pH sa upraví na 7,4 az 7,45.

b) Tuhá zivná pôda

Zlozky sa dôkladne premiesajú a sterilizujú sa v autokláve. Roztok sa ochladí na 100 °C
a pridá sa do objemu 1 740 ml uz opísanej kvapalnej zivnej pôdy.

(1) Bujón s infúziou z hovädzieho srdca

Zivný bujón sa sterilizuje v autokláve.

(2) Zmes esenciálnych vitamínov

(3) Iónový agar

Vysokočistený agar na pouzitie v mikrobiológii a v imunológii, pripravený metódou výmeny iónov, ktorou sa získa veľmi čistý a číry produkt, so schopnosťou tvorby koherentného gélu.

Obsahuje nasledujúce zlozky v priblizných mnozstvách

(4) Roztok elektrolytov podľa Hanksa (modifikovaný)

(5) Infúzia zo srdca a mozgu

(6) Bujón PPLO

2.6.12. MIKROBIOLOGICKÉ HODNOTENIE NESTERILNÝCH PRODUKTOV (CELKOVÝ POČET ZIVÝCH AERÓBNYCH MIKROORGANIZMOV)

Ďalej opísané skúsky umozňujú kvantitatívne spočítanie mezofilných baktérií, plesní
a kvasiniek, ktoré rastú v aeróbnych podmienkach.

Skúsky sú zamerané predovsetkým na zistenie, či produkt vyhovuje mikrobiologickým poziadavkám predpísaným v príslusnom liekopisnom článku. Pri skúskach sa postupuje tak, ako sa opisuje ďalej, vrátane počtu pouzitých vzoriek a vyhodnotenia výsledkov. Skúsky sa môzu pouziť aj pri stanovení Účinnosti antimikrobiálnej konzervácie (5.1.3) opísanom v liekopise. Ďalej tieto skúsky slúzia na monitorovanie kvality východiskového materiálu, ktorej hodnotenie sa odporúča vykonať podľa článku Mikrobiologická kvalita liekov (5.1.4). Ak výrobca pouzije tieto skúsky napr. na monitorovanie východiskových materiálov a konečných produktov alebo
v procese validácie, riadenie skúsok vrátane počtu odobratých vzoriek a vyhodnotenia výsledkov je vecou dohody medzi výrobcom a kompetentnou autoritou.

Skúska sa vykonáva v podmienkach zabraňujúcich náhodnej kontaminácii skúsaného produktu. Opatrenia na zabránenie kontaminácie musia byť také, aby neposkodili ziadne mikroorganizmy, ktoré sa majú skúskou dokázať. V prípade, ze má skúsaný produkt antimikrobiálnu aktivitu, musí sa jej vplyv nálezite neutralizovať. Ak sa na tento účel pouzijú inaktivátory, treba dokázať ich účinnosť a netoxicitu voči mikroorganizmom.

Celkový počet zivých aeróbnych zárodkov sa stanovuje membránovou filtráciou alebo platňovou metódou, ako sa predpisuje v príslusnom článku.

Najpravdepodobnejsí počet baktérií sa určuje vtedy, keď nie je vhodná iná metóda. Výber metódy sa zakladá na faktoroch, ako je napr. povaha produktu a očakávaný počet mikroorganizmov. Kazdá zvolená metóda musí byť vhodne validovaná.

Skúsky sa môzu robiť v nadväznosti na vseobecné state 5.1.3. alebo 5.1.4 pouzitím metódy zalievania, povrchového rozotierania a membránovej filtrácie.

Príprava vzorky

Plán vzorkovania. Vzorkovanie produktu sa musí riadiť podľa dobre zostaveného plánu. Plán vzorkovania závisí od viacerých faktorov, ako je napr. veľkosť sarze, zdravotné riziko spojené s neprijateľne vysoko kontaminovanými produktmi, vlastnosti produktu a očakávaná hladina kontaminácie. Ak nie je predpísané niečo iné, pouzije sa vzorka(vzorky) 10 g alebo 10 ml skúsanej látky alebo skúsaného produktu odobratého s uz uvedenými opatreniami. Náhodným výberom sa odoberie vzorka(vzorky) produktu z veľkoobjemového obalu alebo z dostupných nádob. Ak treba, zmiesa sa obsah takého mnozstva nádob, aby sa dosiahlo pozadované mnozstvo kazdej vzorky v závislosti od povahy skúsanej látky alebo produktu.

Príkladom plánu vzorkovania je plán vzorkovania troch tried. Tento plán sa môze pouziť na produkty, pri ktorých homogenita distribúcie mikroorganizmov býva problémom. V takom prípade sa z kazdej sarze odoberie päť vzoriek a vysetrujú sa oddelene. Známe sú tri triedy: (i) prijateľné vzorky, t. j. vzorky obsahujúce menej ako m kolónietvorných jednotiek na gram alebo mililiter, kde m je limit určený v príslusnom článku; (ii) marginálne vzorky, t. j. vzorky obsahujúce viac ako m kolónietvorných jednotiek, ale menej ako 10 m na gram alebo mililiter; (iii) nevhodné vzorky, t. j. obsahujúce viac ako 10 m kolónietvorných jednotiek na gram alebo mililiter.

Hydrofilné produkty. 10 g alebo 10 ml skúsaného produktu sa rozpustí alebo zriedi tlmivým roztokom chloridu sodného s peptónom s pH 7,0 alebo s inou vhodnou riediacou kvapalinou. Zvyčajne sa pripravuje riedenie 1 v 10, ale vlastnosti produktu alebo pozadovaná citlivosť si môze vyzadovať pouzitie iných pomerov riedenia. Ak produkt preukazuje antimikrobiálny účinok, môze sa do riediacej kvapaliny pridať inaktivátor. Ak treba, upraví sa hodnota pH asi na 7 a pripraví sa ďalsia séria 10-násobných riedení s pouzitím tej istej riediacej kvapaliny.

Lipofóbne produkty nerozpustné vo vode. 10 g alebo 10 ml skúsaného produktu sa suspenduje
v tlmivom roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0 alebo v inej vhodnej kvapaline. Zvyčajne sa pripravuje riedenie 1 v 10, ale vlastnosti niektorých produktov si môzu vyzadovať pouzitie väčsích objemov. Môze sa pridať vhodná povrchovo aktívna látka, ako napr. polysorbát 80 1 g/l, ktorý napomáha tvorbe suspenzie z polomastných látok. Ak produkt preukazuje antimikrobiálny účinok, môze sa do riediacej kvapaliny pridať inaktivátor. Ak treba, upraví sa hodnota pH asi na 7 a pripraví sa ďalsia séria desaťnásobných riedení s pouzitím tej istej riediacej kvapaliny.

Lipofilné produkty. 10 g alebo 10 ml skúsaného produktu sa homogenizuje sterilným polysorbátom 80 alebo inou vhodnou sterilnou povrchovo aktívnou látkou v mnozstve, ktoré nie je väčsie ako polovica hmotnosti produktu, ak treba, zohriateho na teplotu najviac 40 °C, výnimočne najviac na 45 °C. Opatrne sa miesa, a ak treba, nastavená teplota vodného kúpeľa alebo termostatu sa udrzuje. Pridá sa také mnozstvo tlmivého roztoku chloridu sodného
s peptónom s pH 7,0, aby sa dosiahlo riedenie originálneho produktu 1 v 10. Opatrne sa miesa, pričom teplota sa udrzuje čo najkratsí čas potrebný na zachovanie emulzie a v nijakom prípade nie dlhsie ako 30 min. Pripraví sa ďalsia séria 10-násobných riedení s pouzitím tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0, ktorý obsahuje potrebnú koncentráciu sterilného polysorbátu 80 alebo inej sterilnej povrchovo aktívnej látky.

Transdermálne náplasti. Sterilnou pinzetou sa odstráni ochranná fólia z 10 náplastí a vlozia sa do sterilných sklenených alebo plastových misiek adhezívnou stranou nahor. Ak treba, adhezívny povrch sa prikryje sterilnou gázou (alebo filtrom z monovláknitej polymérovej mriezky) a desať náplastí sa prenesie do najmenej 500 ml tlmivého roztoku chloridu sodného
s peptónom s pH 7,0 obsahujúceho vhodné inaktivátory, napr. polysorbát 80 a/alebo lecitín. Produkt sa dôkladne pretrepáva najmenej 30 min (prípravok A). Ďalsích 10 naplastí sa pripraví takým istým spôsobom, prenesú sa do najmenej 500 ml zivného bujónu D a dôkladne sa pretrepávajú najmenej 30 min (prípravok B).

Skúska

Membránová filtrácia. Pouzijú sa membránové filtre s nominálnou veľkosťou pórov najviac
45 m, ktoré preukázali schopnosť zachytávať baktérie. Druh filtračného materiálu sa volí tak, aby schopnosť zachytávať baktérie nebola ovplyvnená zlozkami skúsanej vzorky. Celulózo-nitrátové filtre sa môzu pouziť na vodné, olejové a slabé liehové roztoky a celulózoacetátové filtre na silné liehové roztoky. Filtračný prístroj je konstruovaný tak, aby umoznil prenesenie filtra do zivnej pôdy.

Potrebné mnozstvo vzorky pripravenej podľa opisu v odseku Príprava vzorky (podľa moznosti 1 g produktu alebo menej, ak sa očakáva veľký počet kolónietvorných jednotiek) sa prenesie na dva membránové filtre a ihneď sa prefiltruje. Kazdý filter sa 3-krát premyje, vzdy
asi so 100 ml vhodnej kvapaliny, napr. tlmivým roztokom chloridu sodného s peptónom s pH 7,0. K tomuto roztoku sa môzu pridať povrchovoaktívne látky, napr. polysorbát 80, alebo inaktivátory antimikrobiálnych látok. Ak sa premývanie opakuje menej ako 3-krát, postup sa musí validovať. Jeden z membránových filtrov určený na výpočet baktérií sa prenesie na povrch vhodného zivného agaru, napr. B, a druhý, určený na výpočet húb, na povrch vhodného zivného agaru, napr. C. Platňa so zivným agarom B sa inkubuje pri teplote 30 °C az 35 °C a platňa so zivným agarom C pri teplote 20 °C az 25 °C 5 dní, ak sa nedosiahne spoľahlivejsí počet
v kratsom čase. Vyberú sa platne s najvyssím počtom 100 kolónií a vypočíta sa mnozstvo kolónietvorných jednotiek na gram alebo mililiter produktu.

Pri skúsaní transdermálnych náplastí sa 50 ml prípravku A oddelene prefiltruje cez kazdý
z dvoch sterilných membránových filtrov. Jeden filter sa polozí na zivný agar B na celkový počet aeróbnych mikróbov a druhý filter na zivný agar C na počet húb.

Platňové metódy

a) Metóda zalievania

Do kazdej Petriho misky s priemerom 9 cm sa nanesie 1 ml vzorky pripravenej podľa opisu v odseku Príprava vzorky a 15 ml az 20 ml skvapalneného zivného agaru vhodného na kultiváciu baktérií (napr. zivný agar B) alebo 15 ml az 20 ml skvapalneného zivného agaru vhodného na kultiváciu húb (napr. zivný agar C), ktorého teplota neprevysuje 45 °C. Ak sa pouzijú väčsie Petriho misky, mnozstvo agaru musí byť väčsie. Na kazdý zivný agar a kazdé riedenie sa pouzijú najmenej dve Petriho misky. Platne sa inkubujú pri teplote 30 °C az 35 °C (20 °C az 25 °C pre huby) 5 dní, pokiaľ sa nedosiahne spoľahlivejsí počet v kratsom čase. Vyberú sa platne zodpovedajúce jednému riedeniu a s najvyssím počtom 300 kolónií (100 kolónií pri hubách). Z aritmetického priemeru súčtov kolónií sa vypočíta mnozstvo kolónietvorných jednotiek na gram alebo mililiter.

b) Metóda povrchového rozotierania

Do kazdej Petriho misky s priemerom 9 cm sa nanesie 15 ml az 20 ml skvapalneného zivného agaru vhodného na kultiváciu baktérií (napr. zivný agar B) alebo skvapalneného zivného agaru na kultiváciu húb (napr. zivný agar C), ktorého teplota neprevysuje 45 °C,
a nechá sa stuhnúť. Ak sa pouzijú väčsie Petriho misky, mnozstvo agaru musí byť väčsie. Platne sa vysusia napr. v boxe s laminárnym prúdením vzduchu alebo v termostate. Zmeraný objem najmenej 0,1 ml vzorky pripravenej podľa opisu v odseku Príprava vzorky sa rozotrie na povrchu zivnej pôdy. Na kazdý zivný agar a kazdé riedenie sa pouzijú najmenej dve Petriho misky.

Spôsob inkubácie a výpočet mnozstva kolónietvorných jednotiek je taký istý ako pri Metóde zalievania.

Metóda najpravdepodobnejsieho počtu

Presnosť metódy najpravdepodobnejsieho počtu je mensia ako presnosť membránovej filtrácie alebo platňových metód. Nespoľahlivé výsledky sa dosahujú najmä pri počítaní plesní. Z týchto dôvodov je metóda najpravdepodobnejsieho počtu určená na výpočet baktérií
v takých prípadoch, keď nie je dostupná iná metóda. Ak je pouzitie tejto metódy odôvodnené, postupuje sa takto:

Pripravia sa série najmenej troch postupných desaťnásobných riedení produktu, ako sa opisuje v odseku Príprava vzorky. Z kazdého riedenia sa odoberú tri vzorky po 1 g alebo 1 ml, ktorými sa inokulujú tri skúmavky s obsahom 9 ml az 10 ml vhodnej kvapalnej pôdy (napr. zivný bujón A). Ak treba, môze sa do zivnej pôdy pridať povrchovo aktívna látka, napr. polysorbát 80 alebo inaktivátor antimikrobiálnej látky. To znamená, ze ak sa pripravia tri riedenia, inokuluje sa deväť skúmaviek. Vsetky skúmavky sa inkubujú 5 dní pri teplote 30 °C az 35 °C. Zaznamená sa počet skúmaviek z kazdého riedenia, ktoré prejavili mikrobiálny rast. Ak je odčítanie výsledkov v dôsledku povahy skúsaného produktu náročné alebo neurčité, preočkuje sa do rovnakého bujónu alebo na vhodný zivný agar (napr. zivný agar B). Inkubuje sa 18 h az 24 h pri takej istej teplote a pouzijú sa tieto výsledky: Určí sa najpravdepodobnejsí počet baktérií na gram alebo mililiter skúsaného produktu z tabuľky 2.6.12.-1.

Tabuľka 2.6.12.-1. Hodnoty najpravdepodobnejsieho počtu mikroorganizmov

* Kategória 1: normálne výsledky získané v 95 % prípadov.

Kategória 2: menej pravdepodobné výsledky získané len v 4 % prípadov. Tieto výsledky sa nepouzijú v dôlezitých prípadoch. Výsledky, ktoré sú dokonca menej pravdepodobné ako výsledky v kategórii 2, nie sú uvedené a vzdy sú neprijateľné.

Účinnosť zivných pôd a validácia metódy stanovenia celkového počtu

Bakteriálne testovacie kmene rastú oddelene vo vhodnej kvapalnej pôde (napr. zivný bujón A) pri teplote 30 °C az 35 °C 18 h az 24 h. Testovacie kmene plesní a kvasiniek rastú oddelene na vhodnej agarovej pôde (napr. na zivnom agare C bez antibiotík) pri teplote 20 °C az 25 °C 48 h v prípade Candida albicans a pri teplote 20 °C az 25 °C 7 dní v prípade Aspergillus niger.

Staphylococcus aureus  napr. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83),

Escherichia coli  napr. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126),

Bacillus subtilis  napr. ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62),

Candida albicans  napr. ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72),

Aspergillus niger  napr. ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83).

Pripravia sa referenčné suspenzie obsahujúce asi 100 kolónietvorných jednotiek na mililiter s pouzitím tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0. Ako kontrola metódy stanovenia celkového počtu sa pouzije suspenzia z kazdého mikroorganizmu oddelene za prítomnosti a za neprítomnosti skúsaného produktu. Či sa pouzije metóda membránovej filtrácie alebo platňová metóda, získaný počet ktoréhokoľvek testovacieho mikroorganizmu sa od vypočítanej hodnoty z inokula neodlisuje viac ako o faktor 5. Ak sa pouzije metóda najpravdepodobnejsieho počtu, hodnota vypočítaná z inokula má byť v rozsahu 95 % limitu spoľahlivosti získaných výsledkov. Na kontrolu sterility zivných pôd, riediacej kvapaliny, ako aj aseptických postupov pri skúske sa pouzije sterilný roztok chloridu sodného s peptónom s pH 7,0 ako skúsaný prípravok. Nesmie sa prejaviť nijaký rast mikroorganizmov.

Vyhodnotenie výsledkov

Počet baktérií sa rovná priemernému počtu kolónietvorných jednotiek, ktorý sa zistil na zivnom agare B. Počet húb sa rovná priemernému počtu kolónietvorných jednotiek na zivnom agare C. Za celkový počet zivých aeróbnych baktérií sa povazuje súčet počtu baktérií a húb, ako sa uz opísalo. Ak sa zistí, ze tie isté druhy mikroorganizmov rastú na obidvoch zivných pôdach, môze sa urobiť oprava. Ak sa výpočet robí metódou najpravdepodobnejsieho počtu, vypočítanou hodnotou je počet baktérií.

Ak je v článku predpísaný limit, hodnotí sa takto:

mikroorganizmov: maximálne prípustný limit: 5 x 10

mikroorganizmov: maximálne prípustný limit: 5 x 10 atď.

Ak sa pouzije plán vzorkovania, napr. plán vzorkovania troch tried, postupuje sa takto:

Vypočíta sa celkový počet zivých aeróbnych mikroorganizmov v kazdej z piatich vzoriek oddelene. Látka alebo produkt vyhovuje skúske, ak sa splnia tieto podmienky:

- (i) ziadny z jednotlivých počtov aeróbnych baktérií neprekročí predpísaný limit
o desaťnásobok alebo o viac (t. j. neprijateľné vzorky),

- (ii) najviac dva jednotlivé počty aeróbnych baktérií sa nachádzajú v rozmedzí predpísaného
limitu a desaťnásobku tohto limitu (t. j. najviac dve marginálne vzorky).

Odporúčané roztoky a zivné pôdy sa opisujú vo vseobecnom článku 2.6.13.

2.6.13. MIKROBIOLOGICKÉ HODNOTENIE NESTERILNÝCH PRODUKTOV

(DÔKAZ SPECIFICKÝCH MIKROORGANIZMOV)

V tomto vseobecnom článku sa navrhujú niektoré selektívne zivné pôdy. Vseobecným znakom vsetkých selektívnych zivných pôd je, ze sa nimi ziadne subletálne poskodené mikroorganizmy nemôzu dokázať. Keďze takéto poskodené mikroorganizmy sú pre kvalitu produktu rozhodujúce, musí sa do kontrolných postupov zahrnúť resuscitácia, ktorá je zalozená na pouzití selektívnych zivných pôd.

Ak má skúsaný produkt antimikrobiálnu aktivitu, musí sa vhodným spôsobom neutra-lizovať.

Enterobaktérie a určité iné gramnegatívne baktérie

I keď je skúska určená na dôkaz baktérií patriacich do čeľade Enterobacteriaceae, je známe, ze sa môzu dokázať aj iné druhy mikroorganizmov (napr. Aeromonas, Pseudomonas).

Dôkaz baktérií. Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným v článku 2.6.12 s tým rozdielom, ze namiesto tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0 sa pouzije zivný bujón D. Vzorka sa homogenizuje a inkubuje pri teplote 35 °C az 37 °C do ozivenia baktérií, ale nie do ich pomnozenia (zvyčajne 2 h, ale najdlhsie 5 h). Obsah nádoby sa pretrepe a mnozstvo zodpovedajúce 1 g alebo 1 ml produktu (homogenát A) sa prenesie do 100 ml obohateného zivného bujónu E. Inkubuje sa 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Preočkuje sa na platne so zivným agarom F a inkubuje sa 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Produkt vyhovuje skúske, ak sa na ziadnej platni neprejaví rast kolónií gramnegatívnych baktérií.

Kvantitatívne hodnotenie. Potrebné mnozstvo obohateného zivného bujónu E sa inokuluje homogenátom A alebo jeho riedeniami s obsahom skúsaného produktu v tomto poradí: 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g (alebo 0,1 ml, 0,01 ml, a 0,001 ml). Inkubuje sa 24 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Preočkuje sa z kazdej kultúry na platňu so zivným agarom F na selektívnu izoláciu. Inkubuje sa 18 h az 24 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Rast dobre vyvinutých, zvyčajne červených alebo červenkastých kolónií gramnegatívnych baktérií indikuje pozitívny výsledok. Zaznamená sa najmensie mnozstvo produktu s pozitívnym výsledkom a najväčsie mnozstvo s negatívnym výsledkom. Určí sa pravdepodobný počet baktérií z tabuľky 2.6.13. -1.

Tabuľka 2.6.13.-1

Pri skúsaní transdermálnych náplastí sa prefiltruje 50 ml prípravku B, ako sa opisuje
v článku 2.6.12, cez sterilný membránový filter, ktorý sa vlozí do 100 ml obohateného zivného bujónu E. Inkubuje sa 18 h az 24 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Po inkubácii sa rozočkuje na zivnom agare F na detekciu Enterobaktérií a iných gramnegatívnych mikroorganizmov.

Escherichia coli

Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným v článku 2.6.12 a pouzije sa 10 ml alebo mnozstvo zodpovedajúce 1 g alebo 1 ml produktu na inokuláciu 100 ml zivného bujónu A. Vzorka sa homogenizuje a inkubuje 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Obsah nádoby sa pretrepe a 1 ml sa prenesie do 100 ml zivného bujónu G. Inkubuje sa 18 h az 24 h pri teplote
43 °C az 45 °C. Preočkuje sa na platne so zivným agarom H a inkubuje sa 18 h az 72 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Rast červených, nemukóznych kolónií gramnegatívnych tyčiniek indikuje moznú prítomnosť E. coli, ktorá sa potvrdí vhodnými biochemickými skúskami, napr. tvorbou indolu. Produkt vyhovuje skúske, ak sa takéto kolónie neobjavia alebo ak sú biochemické skúsky negatívne.

Salmonella

Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným v článku 2.6.12 s tým rozdielom, ze namiesto tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0 sa pouzije zivný bujón A. Vzorka sa homogenizuje a inkubuje 18 h az 24 h pri teplote 35 °C az 37 °C. 1 ml obohatenej kultúry sa prenesie do 10 ml zivného bujónu I a inkubuje sa 18 h az 24 h pri teplote 41 °C az
43 °C. Preočkuje sa najmenej na dve rôzne agarové pôdy, napr. zivný agar J, zivný agar K alebo zivný agar L. Inkubuje sa 18 h az 72 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Pravdepodobná prítomnosť salmonel sa vyznačuje rastom kultúr s týmto vzhľadom:

zivný agar J: dobre vyvinuté bezfarebné kolónie,

zivný agar K: dobre vyvinuté červené kolónie s čiernym stredom alebo bez neho,

zivný agar L: malé priehľadné, bezfarebné alebo ruzové, príp. nepriehľadné biele kolónie, často ohraničené ruzovou alebo červenou zónou.

Niekoľko podozrivých kolónií sa oddelene naočkuje na povrch a hlbokým vpichom do zivného agaru M v skúmavkách. Prítomnosť salmonel sa dočasne potvrdí v prípade, ze sa po inokulácii vpichom, ale nie na povrchu kultúry, zmení farba z červenej na zltú, zvyčajne súčasne s tvorbou plynu v agare; sírovodík sa môze tvoriť alebo nemusí. Presné potvrdenie prítomnosti sa môze urobiť vhodnými biochemickými a sérologickými skúskami. Produkt vyhovuje skúske, ak sa kolónie opísaného druhu neobjavia alebo ak sú potvrdzujúce biochemické a sérologické skúsky negatívne.

Pseudomonas aeruginosa

Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným v článku 2.6.12 a pouzije sa 10 ml alebo mnozstvo zodpovedajúce 1 g alebo 1 ml produktu na inokuláciu 100 ml zivného bujónu A. Vzorka sa homogenizuje a inkubuje 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Preočkuje sa na platňu so zivným agarom N a inkubuje sa 18 h az 72 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Produkt vyhovuje skúske, ak sa neprejaví nijaký rast mikroorganizmov. Ak sa prejaví rast gramnegatívnych tyčiniek, prenesie sa časť morfologicky odlisných izolovaných kolónií do zivného bujónu A a inkubuje sa 18 h az 24 h pri teplote 41 °C az 43 °C. Produkt vyhovuje skúske, ak sa pri teplote 41 °C az 43 °C neobjaví nijaký rast mikroorganizmov.

Pri skúsaní transdermálnych náplastí sa prefiltruje 50 ml prípravku A, ako sa opisuje
v článku 2.6.12., cez sterilný membránový filter, ktorý sa vlozí do 100 ml zivného bujónu A. Inkubuje sa 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Po inkubácii sa rozočkuje na zivný agar N.

Staphylococcus aureus

Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným v článku 2.6.12 a pouzije sa 10 ml alebo mnozstvo zodpovedajúce 1 g alebo 1 ml produktu na inokuláciu 100 ml zivného bujónu A. Vzorka sa homogenizuje a inkubuje 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Preočkuje sa na platňu so zivným agarom O a inkubuje sa 18 h az 72 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Rast čiernych kolónií grampozitívnych kokov ohraničených jasnou zónou indikuje prítomnosť S. aureus. Potvrdenie prítomnosti sa môze urobiť vhodnými biochemickými skúskami, napr. koagulázovým a deoxyribonukleázovým testom. Produkt vyhovuje skúske, ak sa kolónie opísaného druhu na zivnom agare O neobjavia alebo ak sú potvrdzujúce biochemické skúsky negatívne.

Pri skúsaní transdermálnych náplastí sa prefiltruje 50 ml prípravku A, ako sa opisuje v článku 2.6.12., cez membránový filter, ktorý sa vlozí do 100 ml zivného bujónu A. Inkubuje sa 18 h az 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Po inkubácii sa rozočkuje na zivný agar O.

Nutritívne a selektívne vlastnosti zivných pôd a validácia skúsky na dôkaz specifických mikroorganizmov

Skúsky opísané ďalej sa musia vykonávať aspoň na kazdej sarzi susenej zivnej pôdy.

Postup: Ďalej uvedené testovacie kmene sa naočkujú oddelene do skúmaviek obsahujúcich vhodné zivné pôdy, napr. tie, ktoré sú uvedené ďalej, a pomnozujú sa 18 h az 24 h pri teplote
30 °C az 35 °C:

Staphylococcus aureus  napr. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83): zivný bujón A,

Pseudomonas aeruginosa  napr. ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118): zivný bujón A,

Escherichia coli  napr. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126): zivný bujón A,

Salmonella typhimurium bez odporúčania kmeňa (môze sa pouziť salmonela nepatogén- na pre človeka, napr. Salmonella abony [NCTC 6017, CIP 80.39] ): zivný bujón A.

Z kazdej kultúry sa pripravia riedenia s pouzitím tlmivého roztoku chloridu sodného
s peptónom s pH 7,0 tak, aby vznikli suspenzie s obsahom 1 000 zivých mikroorganizmov na mililiter. Z kazdej suspenzie sa zmiesajú rovnaké objemy a pouzije sa 0,4 ml (priblizne 100 mikroorganizmov z kazdého kmeňa) ako inokulum na dôkaz S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli a Salmonella, za prítomnosti a neprítomnosti skúsaného produktu. S jednotlivými mikro-organizmami sa musí dosiahnuť pozitívny výsledok.

Clostridia

Skúsky opísané ďalej sú určené na rozdielne účely. Prvá metóda je určená na skúsku produktov, ktoré nesmú obsahovať ziadne patogénne klostrídie, ktorých neprítomnosť je nevyhnutné skúsať. Tieto produkty majú zvyčajne celkový počet zárodkov nízky. Druhá metóda je semikvantitatívna skúska na Clostridium perfringens a je určená pre produkty, v ktorých počet týchto zárodkov je kritériom kvality.

1. Dôkaz klostrídií

Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným v článku 2.6.12. Odoberú sa dve rovnaké vzorky zodpovedajúce 1 g alebo 1 ml skúsaného produktu. Jedna časť vzorky sa 10 min zahrieva na teplote 80 °C a rýchlo sa ochladí. Druhá časť vzorky sa nezahrieva. 10 ml
z kazdého homogenizovaného podielu sa prenesie do dvoch skúmaviek (38 mm x 200 mm) alebo do iných vhodných nádob obsahujúcich 100 ml zivnej pôdy P. Inkubuje sa v anaeróbnych podmienkach 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Po inkubácii sa z kazdej skúmavky preočkuje na zivný agar Q s prísadou gentamicínu a inkubuje sa v anaeróbnych podmienkach 48 h pri teplote 35 °C az 37 °C. Produkt vyhovuje skúske, ak sa neprejaví nijaký rast mikroorganizmov.

Ak sa prejaví rast, preočkuje sa kazdá odlisná kolónia na zivný agar Q bez prísady gentamicínu a inkubuje sa za aeróbnych aj anaeróbnych podmienok. V prípade rastu jedine anaeróbnych grampozitívnych baktérií (s endospórami alebo bez nich), ktoré dávajú negatívnu katalázovú reakciu, ide o prítomnosť Clostridium spp. Ak treba, porovná sa morfológia kolónií na dvoch platniach a pouzije sa katalázový test na vylúčenie aeróbnych a fakultatívne anaeróbnych Bacillus spp., ktoré dávajú pozitívnu katalázovú reakciu. Katalázová reakcia sa môze aplikovať priamo na jednotlivé kolónie na agare alebo nepriamo po ich prenesení na krycie sklíčko kvapnutím jednej kvapky peroxidu vodíka, zriedeného roztoku R. Tvorba plynových bublín indikuje pozitívnu katalázovú reakciu.

2. Kvantitatívne stanovenie Clostridium perfringens

Skúsaný produkt sa pripraví postupom opísaným vo vseobecnej metóde 2.6.12 a pripravia sa riedenia 1:100 a 1:1 000 s pouzitím tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0. Určí sa najpravdepodobnejsí počet baktérií postupom opísaným pri skúske Celkový počet zivých aeróbnych mikroorganizmov (2.6.12) s pouzitím zivnej pôdy R. Skúska sa robí v skúmavkách alebo v iných vhodných nádobách s malou Durhamovou skúmavkou. Premiesa sa iba minimálnym pretrepaním a inkubuje sa 24 h az 48 h pri teplote 45,5 °C az 46,5 °C.

Skúmavky, ktoré vykazujú sčernenie pre prítomnosť sulfidu zeleznatého a mohutné vyvíjanie plynu v Durhamovej skúmavke (najmenej 1/10 objemu), indikujú prítomnosť Cl. perfringens. Určí sa najpravdepodobnejsí počet zárodkov Cl. perfringens podľa tabuľky
2.6.12-1.

Na kontrolu sa pouzijú tieto kmene:

Metóda 1: Clostridium sporogenes, napr. ATCC 19404 (NCTC 532) alebo CIP 79.3,

Metóda 2: Clostridium perfringens, napr. ATCC 13124 (NCIMB 6125, NCTC 8237, CIP 103 409).

Ak treba, na overenie selektivity a anaeróbnych podmienok sa v prípade potreby môze pouziť Cl. sporogenes.

Táto stať má povahu informácie a odporúčania a netvorí záväznú časť liekopisu.

ODPORÚČANÉ ROZTOKY A ZIVNÉ PÔDY

Nasledujúce kvapalné a tuhé zivné pôdy sa povazujú za vhodné pri predpísaných skúskach na mikrobiologickú čistotu. Môzu sa pouziť aj iné zivné pôdy, ak sú ich nutritívne a selektívne vlastnosti na testovacie mikroorganizmy podobné.

Tlmivý roztok chloridu sodného s peptónom s pH 7,0

Dihydrogenfosforečnan draselný 3,6 g, zodpovedá 0,067 mol/l

Hydrogenfosforečnan sodný, dihydrát 7,2 g, zodpovedá 0,067 mol/l

Chlorid sodný 4,3 g

Peptón (z mäsa alebo kazeínu) 1,0 g

Čistená voda 1 000 ml

K tomuto roztoku sa môzu pridať povrchovo aktívne látky alebo inaktivátory antimikro-biálnych látok, napr. polysorbát 80 (1 g/l az 10 g/l). Roztok sa sterilizuje zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivný bujón A (Pôda s hydrolyzátom kazeínu a sóje)

Pankreatický hydrolyzát kazeínu 17,0 g

Papaický hydrolyzát sóje 3,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

Hydrogenfosforečnan draselný 2,5 g

D-Glukóza, monohydrát 2,5 g

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,3 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivný agar B (Agar s hydrolyzátom kazeínu a sóje)

Pankreatický hydrolyzát kazeínu 15,0 g

Papaický hydrolyzát sóje 5,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

Agar 15,0 g

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,3 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivný agar C (Sabouraudov agar s glukózou a antibiotikami)

Peptón (mäsový a kazeínový) 10,0 g

D-Glukóza, monohydrát 40,0 g

Agar 15,0 g

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 5,6 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C. Tesne pred pouzitím sa pridá 0,10 g sodnej soli benzylpenicilínu a 0,10 g tetracyklínu na liter zivnej pôdy vo forme sterilného roztoku. Tieto antibiotiká mozno nahradiť 50 mg chloramfenikolu na liter zivnej pôdy, ktorý sa musí pridať pred sterilizáciou.

Zivný bujón D (Laktózový bujón)

Hovädzí odvar koncentrovaný 3,0 g

Pankreatický hydrolyzát zelatíny 5,0 g

Laktóza, monohydrát 5,0 g

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 6,9 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C a ihneď sa ochladí.

Obohatený zivný bujón E (Mosselov obohatený bujón pre enterobaktérie)

Pankreatický hydrolyzát zelatíny 10,0 g

D-Glukóza, monohydrát 5,0 g

Susená hovädzia zlč 20,0 g

Dihydrogenfosforečnan draselný 3,0 g

Hydrogenfosforečnan sodný, dihydrát 8,0 g

Zeleň briliantová 15 mg

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po zahriatí 7,2 0,2. Zahrieva sa 30 min pri teplote
100 °C a ihneď sa ochladí.

Zivný agar F (Agar s violeťou krystálovou, červeňou neutrálnou, zlčovými soľami a glukózou)

Kvasničný autolyzát 3,0 g

Pankreatický hydrolyzát zelatíny 7,0 g

Zlčové soli 1,5 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

D-Glukóza, monohydrát 10,0 g

Agar 15,0 g

Červeň neutrálna 30 mg

Violeť krystálová 2 mg

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po zahriatí 7,4 0,2. Zahrieva sa do varu. Nesmie sa zahrievať v autokláve.

Zivný bujón G (MacConkeyov bujón)

Pankreatický hydrolyzát zelatíny 20,0 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Susená hovädzia zlč 5,0 g

Purpur brómkrezolový 10 mg

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,3 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivný agar H (MacConkeyov agar)

Pankreatický hydrolyzát zelatíny 17,0 g

Peptóny (z mäsa a kazeínu) 3,0 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

Zlčové soli 1,5 g

Agar 13,5 g

Červeň neutrálna 30,0 mg

Violeť krystálová 1 mg

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,1 0,2. Varí sa 1 min za stáleho miesania a potom sa sterilizuje zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivný bujón I (Tetrationátová pôda so zlčou a zeleňou briliantovou)

Peptón 8,6 g

Susená hovädzia zlč 8,0 g

Chlorid sodný 6,4 g

Uhličitan vápenatý 20,0 g

Tetratiónan draselný 20,0 g

Zeleň briliantová 70 mg

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,0 0,2. Zahrieva sa iba do varu. Nesmie sa znova zahrievať.

Zivný agar J (Deoxycholáto-citrátový agar)

Hovädzí odvar koncentrovaný 10,0 g

Mäsový peptón 10,0 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Citrónan sodný 20,0 g

Citrónan zelezitý 1,0 g

Nátriumdeoxycholát 5,0 g

Agar 13,5 g

Červeň neutrálna 20 mg

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po zahrievaní 7,3 0,2. Zahrieva sa mierne do varu
a 1 min sa varí. Ochladí sa na teplotu 50 °C a vyleje sa do Petriho misiek. Nesmie sa zahrievať v autokláve.

Zivný agar K (Deoxycholátový agar so xylózou a lyzínom)

Xylóza 3,5 g

L-Lyzín 5,0 g

Laktóza, monohydrát 7,5 g

Sacharóza 7,5 g

Chlorid sodný 5,0 g

Kvasničný autolyzát 3,0 g

Červeň fenolová 80 mg

Agar 13,5 g

Nátriumdeoxycholát 2,5 g

Tiosíran sodný 6,8 g

Citrónan amónno-zelezitý 0,8 g

Čistená voda 1 000 ml

Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po zahrievaní 7,4 0,2. Zahrieva sa iba do varu, ochladí sa na teplotu 50 °C a vyleje sa do Petriho misiek. Nesmie sa zahrievať v autokláve.

Zivný agar L (Agar so zeleňou briliantovou, červeňou fenolovou, laktózou a sacharózou)

Peptóny (z mäsa a kazeínu) 10,0 g

Kvasničný autolyzát 3,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Sacharóza 10,0 g

Agar 20,0 g

Červeň fenolová 80 mg

Zeleň briliantová 12,5 mg

Čistená voda 1 000 ml

Zahrieva sa do varu. Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 6,9 0,2. Tesne pred pouzitím sa sterilizuje zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C, ochladí sa na teplotu 50 °C a vyleje sa do Petriho misiek.

Zivný agar M (Hajnov agar)

Hovädzí odvar koncentrovaný 3,0 g

Kvasničný autolyzát 3,0 g

Peptóny (z kazeínu a mäsa) 20,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Sacharóza 10,0 g

D-Glukóza, monohydrát 1,0 g

Citrónan amónno-zelezitý 0,3 g

Tiosíran sodný 0,3 g

Červeň fenolová 25 mg

Agar 12,0 g

Čistená voda 1 000 ml

Zahrieva sa za stáleho miesania do varu. Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,4 0,2. Naplní sa do skúmaviek do výsky 1/3, sterilizuje sa zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C. Ochladí sa v sikmej polohe skúmaviek tak, aby mal agar vhodnú hĺbku
a sikmú plochu.

Zivný agar N (Cetrimidový agar)

Pankreatický hydrolyzát zelatíny 20,0 g

Chlorid horečnatý 1,4 g

Síran draselný 10,0 g

Cetrimid 0,3 g

Agar 13,6 g

Čistená voda 1 000 ml

Glycerol 10,0 ml

Zahrieva sa za stáleho miesania do varu. Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 7,2 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivný agar O (Bairdov-Parkerov agar)

Pankreatický hydrolyzát kazeínu 10,0 g

Hovädzí odvar koncentrovaný 5,0 g

Kvasničný autolyzát 1,0 g

Chlorid lítny 5,0 g

Agar 20,0 g

Glycín 12,0 g

Nátriumpyruvát 10,0 g

Čistená voda 950 ml

Zahrieva sa za stáleho miesania do varu. Hodnota pH sa upraví tak, aby bola po sterilizácii 6,8 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C, ochladí sa na teplotu 45 °C az 50 °C a pridá sa 10 ml sterilného roztoku teluričitanu draselného 10 g/l a 50 ml emulzie z vaječného zĺtka.

Zivná pôda P (Zivná pôda obohatená pre klostrídie)

Hovädzí odvar koncentrovaný 10,0 g

Peptón 10,0 g

Kvasničný autolyzát 3,0 g

Skrob rozpustný 1,0 g

D-Glukóza, monohydrát 5,0 g

Cysteíniumchlorid 0,5 g

Chlorid sodný 5,0 g

Octan sodný 3,0 g

Agar 0,5 g

Čistená voda 1 000 ml

Agar sa nechá napučať v čistenej vode a za stáleho miesania sa zahriatím rozpustí do varu. Ak treba, upraví sa hodnota pH tak, aby bola po sterilizácii asi 6,8. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Zivná pôda Q (Kolumbia agar)

Pankreatický hydrolyzát kazeínu 10,0 g

Peptický hydrolyzát mäsa 5,0 g

Pankreatický hydrolyzát srdca 3,0 g

Kvasničný autolyzát 5,0 g

Kukuričný skrob 1,0 g

Chlorid sodný 5,0 g

Agar, podľa gelifikačnej schopnosti 10,0 az 15,0 g

Čistená voda 1 000 ml

Agar sa nechá napučať v čistenej vode a za stáleho miesania sa zahriatím rozpustí do varu. Ak treba, upraví sa hodnota pH tak, aby bola po sterilizácii 7,3 0,2. Sterilizuje sa zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C. Ochladí sa na teplotu 45 °C az 50 °C; ak treba, pridá sa gentamicíniumsulfát v mnozstve zodpovedajúcom 20 mg gentamicínu a naleje sa do Petriho misiek.

Zivná pôda R (Pôda s disiričitanom a laktózou)

Pankreatický hydrolyzát kazeínu 5,0 g

Kvasničný autolyzát 2,5 g

Chlorid sodný 2,5 g

Laktóza, monohydrát 10,0 g

Cysteíniumchlorid 0,3 g

Čistená voda 1 000 ml

Zlozky sa rozpustia vo vode, hodnota pH sa upraví na 7,1 0,1 a roztok sa naplní po 8 ml do skúmaviek (16 mm x 160 mm) s malou Durhamovou skúmavkou. Sterilizuje sa zahrievaním
v autokláve 15 min pri teplote 121 °C a uchováva sa pri teplote 4 °C.

Pred pouzitím sa zivná pôda 5 min zahrieva na vodnom kúpeli a ochladí sa. Do kazdej skúmavky sa pridá 0,5 ml roztoku disiričitanu sodného R 12 g/l a 0,5 ml roztoku citrónanu amónno-zelezitého 10 g/l; obidva roztoky sa pripravujú pred pouzitím a prefiltrujú sa cez membránový filter (veľkosť pórov: 0,45 m).

NEUTRALIZAČNÉ LÁTKY

Neutralizačné látky sa môzu pouziť na neutralizáciu aktivity antimikrobiálnych látok. Pridávajú sa do tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0 zvyčajne pred sterilizáciou. V prípade, ze sa pouzijú, ich účinnosť a netoxicita pre mikroorganizmy sa musí dokázať.

Typická neutralizačná kvapalina má toto zlozenie

Polysorbát 80 30 g

Lecitín (vaječný) 3 g

Histidíniumchlorid 1 g

Peptón (z mäsa alebo kazeínu) 1 g

Chlorid sodný 4,3 g

Dihydrogenfosforečnan draselný 3,6 g

Hydrogenfosforečnan sodný, dihydrát 7,2 g

Čistená voda 1 000,0 ml

Sterilizuje sa zahrievaním v autokláve 15 min pri teplote 121 °C.

Ak nemá roztok dostatočnú neutralizačnú kapacitu, koncentrácia polysorbátu 80 alebo lecitínu sa môze zvýsiť. Alternatívne sa môzu pridať neutralizačné látky uvedené v tabuľke 2.6.13-2.

Tabuľka 2.6.13.-2. Inaktivátory antimikrobiálnych látok ako prísada do tlmivého roztoku chloridu sodného s peptónom s pH 7,0