ZÁVEREČNÁ SPRÁVA

ZÁVEREČNÁ SPRÁVA

O riesení čiastkovej úlohy výskumu a vývoja státneho podprogramu výskumu a vývoja

Názov úlohy: Stúdium vplyvu faktorov prostredia na rozvoj technologicky a zdravotne neziadúcej mikroflóry v potravinách a vo výrobných priestoroch.

Zodpovedný riesiteľ: Jana Petríková, Ing.

Spoluriesitelia: Denisa Liptáková, Ing. PhD.

Koreňová Janka, Ing.

Bertaová Gabriela, Mgr.

Jányi Ivan, Mgr.

Lopasovská Janka

Stolářová Katarína

Anotácia:

Trvanlivosť potravín sa v mnohých prípadoch priblizuje k hranici, ktorú ich vnútorné a vonkajsie faktory ako mikrobiálne prekázky, este môzu, ale aj nemusia zabezpečiť. Prostredníctvom matematického modelovania je mozné popísať správanie sa mikroorganizmov v potravinách. Tento nový smer potravinárskej mikrobiológie sa nazýva prediktívna mikrobiológia. Proces regulácie, resp. ovládania rozmnozovania sa mikroorganizmov (MO) v potravinách je zalozený na spoločnom inhibičnom účinku viacerých faktorov vnútorného a vonkajsieho prostredia. Dôkladné pochopenie interakcií medzi mikrobiálnymi prekázkami umozňuje inhibovať rast neziadúcich MO, redukovať produkciu toxínov a predpovedať trvanlivosť a zdravotnú bezpečnosť potravín. V posledných rokoch sa čoraz viac do popredia dostávajú čerstvé potraviny bez chemického alebo tepelného osetrenia, potraviny s biologicky aktívnymi zlozkami, 929k1013j ktoré pozitívne ovplyvňujúce zdravotný stav konzumenta, potraviny zalozené na biokonzervácii a i. Jedným z hlavných vonkajsích faktorov, ktorým sa dá významne ovplyvňovať trvanlivosť, zdravotná a hygienická bezpečnosť pozívatín je aj teplota skladovania.

Cieľom úlohy bolo studovať vplyv faktorov prostredia (teplota skladovania a mozné antifungálne a antibakteriálne účinky kmeňa mliečnych baktérií Lactobacillus rhamnosus VT1, ako potenciálnej ochrannej kultúry s mozným vyuzitím v mliekárenskej technológii) na patogénne (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes) a technologicky neziadúce (Candida maltosa) mikroorganizmy. Niektoré kmene Lactobacillus rhamnosus okrem inhibičných účinkov majú aj probiotické účinky. Jedným z cieľov bolo stanoviť prezívanie a rast kmeňa L. rhamnosus VT1 pri chladiarenských teplotách s cieľom ďalsieho vyuzitia pri sledovaní jeho antimikrobiálneho účinku. Na základe získaných výsledkov definovať hygienickú a zdravotnú bezpečnosť mliečnych pozívatín z hľadiska prítomnosti sledovaných mikrooragnizmov.

Zistilo sa, ze kmeň L. rhamnosus VT1 je schopný rásť aj pri chladiarenských teplotách (8°C, 10°C a 15°C), pričom jeho rastová rýchlosť pri teplote 8°C bola 0,0106 h^-1 a doba trvania lag-fázy 202,1 h.

Ďalsím významným zistením bolo, ze kmeň L. rhamnosus VT1 má okrem oveerných antifungálnych účinkov aj antibakteriálne vlastnosti voči testovaným mikroorganizmom, hoci spôsob účinku bol odlisný. V prípade kvasinky Candida maltosa YP1 zvysovaním koncentrácie L. rhamnosus VT1 a znizovaním teploty skadovania prislo k predĺzeniu lag-fázy kvasinky v modelovom mliečnom prostredí. Následne sa kvsinka, ako technologicky neziadúci kontaminant, zámerne inokulovala do jogurtu s  komerčnou ochrannou kultúrou a zistilo sa, ze trvanlivosť jogurtu s pouzitím ochrannej kultúry sa dá predĺziť pri teplote skladovania 6°C zo 17 dní (bez ochrannej kultúry) az na 25 dní (jogurt s aplikovanou ochrannou kultúrou). Spôsob účinok L. rhamnosus VT1 na patogénne baktérie B. cereus a L. monocytogenes sa prejavil v znízení rastovej rýchlosti a v znízení maximálneho počtu baktérii na konci doby skladovania. Zvysujúci sa prídavok laktobacila a zvysujúca sa teplota skladovania výrazne znízili rastovú rýchlosť baktérií v mliečnom zivnom prostredí.

Výskyt B. cereus v reálnom prostredí pozívatín bol potvrdený v pasterizovanom mlieku a v mliečnych výrobkoch ako aj výrobkoch na mliečnom základe. Z hľadiska výskytu psychrotrofných kmeňov B. cereus v pasterizovanom mlieku bolo mozné na základe skladovacích testov pri chladiarenských teplotách vysloviť predpovede o hygienickej a zdravotnej bezpečnosti pasterizovaného mlieka s predĺzenou dobou trvanlivosti ako aj overenie správneho nastavenia teploty skladovania. Z nich vyplynulo, ze teplota skladovania 6°C pre pasterizované mlieko je dostatočná na to, aby obsah B. cereus ako aj celkový počet mikroorganizmov bol pod limitom udaným v Potravinovom kódexe SR.

Mikrobiologické analýzy pozívatín na mliečnom základe potvrdili výskyt B. cereus. Potvrdený inhibičný účinok L. rhamnosus VT1 voči B. cereus v modelovom mliečnom prostredí sa overil v zámerne kontaminovanej mliečnej pozívatine. Z predpovedí vyplynulo, ze 1% prídavok L. rhamnosus VT1, ako potenciálna ochranná kultúra, je schopná predĺziť trvanlivosť testovaných pozívatín v priemere o 2 dni pri teplote 10°C. Veľmi podobné výsledky sa zistili aj pri inhibícii rastu L. monocytogenes v mliečnom prostredí. Inhibičný účinok L. rhamnosus VT1 bol oveľa významnejsí pri nizsích, t.j. chladiarenských teplotách a vyssích koncentráciách laktobacila. Významné bolo najmä zistenie, ze uz 1% prídavok L. rhamnosus VT1 do mäkkých nezrejúcich syrov pri chladiarenských teplotách znízi rastovú rýchlosť listérií o 20% pri 8°C a pri teplote 10°C az o 45,6% a počet buniek sa znízil na konci skladovania o 0,7 log poriadkov pri 8°C a o 1,75 log poriadkov pri 10°C voči kontrolnej vzorke bez prídavku laktobacilov. Hoci vo vsetkých prípadoch islo o parciálnu inhibíciu rastu testovaných mikroorganizmov, pouzitie ochranných kultúr nesmie podceniť správnu hygienu a sanitáciu v potravinárskom priemysle.

Stanovené celkové ciele úlohy:

Ciele státneho programu

(9) Zvýsenie zdravotnej neskodnosti postupov výroby potravín a rozvoj technologických postupov eliminujúcich prítomnosť skodlivých kontaminantov a alergénov v potravinárskych produktoch.

Ciele státneho podprogramu:

Ciele v roku 2002:

Vypracovanie prediktívnych metód pre definovanie podmienok správania sa patogénnych mikroorganizmov v potravinách, vo výrobných a skladovacích priestoroch

Ciele v roku 2003:

Overovanie a aplikácia prediktívnych metód pre definovanie podmienok správania sa patogénnych mikroorganizmov v potravinách, vo výrobných a skladovacích priestoroch pri hodnotení miery zdravotného rizika vyplývajúceho z prítomnosti týchto mikroorganizmov a účinku rôznych technologických operácií na elimináciu tohoto rizika

Ciele v roku 2004:

(4) Verifikácia prediktívnych metód a optimalizácia vybraných technologických procesov z hľadiska pozadovanej bezpečnosti a dosiahnutia nutričnej kvality;

Ciele v roku 2005:

Vývoj fyzikálno-chemických a molekulárno-biologických metód na sledovanie vzniku, prítomnosti, dynamiky zmien a eliminácie chemických kontaminujúcich látok antropogénneho a prírodného pôvodu počas výroby a skladovania potravín.

(4) Zvýsenie zdravotnej neskodnosti postupov výroby potravín aplikáciou najmodernejsích technologických postupov a vedeckých poznatkov zaručujúcich elimináciu kontaminantov a vysokú nutričnú hodnotu potravinárskych produktov

Ciele z úlohy výskumu a vývoja:

r. 2002

r. 2003

r. 2004

r. 2005

Popis dosiahnutých výsledkov riesenia celej úlohy vo vzťahu k stanoveným cieľom:

I. Charakteristika

Vplyv faktorov prostredia (teplota, čas, mliečne baktérie) na rozvoj technologicky a zdravotne neziadúcej mikroflóry v potravinách a vo výrobných priestoroch sa sledoval na troch rôznych mikroorganizmoch. Zástupcom technologicky neziadúcej mikroflóry bola termorezistentná, acidotolerantná, oxidatívna kvasinka Candida maltosa YP1, ktorá bola vyizolovaná z bombázovaného jogurtového krému. Medzi zdravotne neziadúce bakteriálne mikroorganizmy v potravinách patria aj sporulujúce podmienene patogénne baktérie rodu Bacillus cereus a nesporulujúce vysokopatogénne kmene rodu Listeria monocytogenes. Jedným z hlavných vonkajsích faktorov, ktorými sa dá ovplyvňovať rast a rozmnozovanie testovaných mikroorganizmov, je teplota skladovania. Nemenej významné je ovplyvňovanie trvanlivosti a zdravotnej neskodnosti potravín pomocou antagonistického účinku niektorých kmeňov baktérií mliečneho kysnutie, resp. ich metabolitov. Kmene baktérií mliečneho kysnutia, ktoré okrem konzervačného účinku a pozitívneho vplyvu na organoleptické vlastnosti, majú i probiotický účinok, sú čoraz častejsie premetom záujmu nielen výskumu, ale aj potravinárskej praxe. Z tohto dôvodu sa na stúdium antagonistického vplyvu mliečnych baktérií voči neziadúcim mikroorganizmom testoval novovyizolovaný kmeň Lactobacillus rhamnosus VT1, u ktorého sa potvrdili antifungálne účinky. Z hľadiska jeho ďalsieho mozného pouzitia ako ochrannej kultúry s probiotickými účinkami pre mliekárenskú technológiu bolo potrebné overiť i jeho antimikrobiálne účinky na kvasinky a baktérie.

II. Materiál a metódy

II.1 Testované mikroorganizmy

G+ baktéria:

Listeria monocytogenes 272 (kmeň A) - izolát z kozieho syra, Olomouc, ČR

Listeria monocytogenes Scott A (kmeň B) - referenčný kmeň

Lactobacillus rhamnosus VT1 (LR VT1) - izolát z drezingu, identifikovaný na Ústave technologie mléka a tuků VSCHT, Praha a zapozičaný z ich zbierky Doc. Ing. Plockovou, PhD.

Bacillus cereus (BC) - izolát zo 7-dňového pasterizovaného mlieka s obsahom tuku 15g/l skladovaného pri 6°C

oxidatívna kvasinka:

Candida maltosa YP1 - izolát z bombázovaného jogurtu, Zbierka kvasinkových kultúr Chemického ústavu SAV v Bratislave (identifikácia dr. Sláviková a kol.)

II.2 Kultivačné podmienky:

Lactobacillus rhamnosus VT1: 37°C, 72 h

Listeria monocytogenes: 37°C, 48 h

Candida maltosa YP1: 25°C, 24 - 48 h

Bacillus cereus: 30°C, 24 h

Na stanovenie sa pouzili čisté kultúry revitalizované z lyofilizovanej formy skladované pri -18°C.

II.3 Materiál

MRS agar na kultiváciu Lactobacillus rhamnosus VT1 a MRS bujón na pomnozovanie L. rhamnosus VT1

peptónová voda - riediace médium

Oxford - selektívna kultivačná pôda na stanovenie počtu L. monocytogenes

GKCH (glukóza kvasničný chloramfenilkol) agar na stanovenie Candida maltosa YP1

MYP - (manitol - egg yolk - polymyxin) agar podľa Mossela

GTK (glukóza tryptón kvasničný) agar s prídavkom mlieka na stanovenie celkového počtu mikroorganizmov v mlieku a v mliečnych výrobkoch

0,25 M NaOH na stanovenie titračnej kyslosti podľa Soxhlet-Henkela (Palo, 1983)

II. 4 Testované modelové a reálne zivné prostredie

UHT mlieko s obsahom tuku 15g/l (Rajo, Slovensko)

Čerstvé mlieko s predĺzenou 7-dňovou trvanlivosťou (obsah tuku 15g/l, Rajo, Slovensko)

Parený mäkký nezrejúci syr typu Mozzarella - Zottarella (obsah tuku 45% t.v.s., Zott, Nemecko)

Jogurt nízkotučný a jogurt Klasik (Rajo, Slovensko)

Potraviny s mliečnou bázou - viď ďalej

II.5 Pouzité metódy

Stanovenie baktérií rodu Lactobacillus (Řstlie a kol., 2003)

Príprava desiatkového riedenia podľa STN EN ISO 6887-1

Stanovenie počtu Listeria monocytogenes podľa STN EN ISO 11290-1

Stanovenie počtu kvasiniek a plesní podľa STN EN ISO 7954

Stanovenie celkového počtu mikroorganizmov v mlieku a mliečnych výrobkoch podľa STN EN ISO 4833:2003

Stanovenie počtu baktérií Bacillus cereus podľa STN EN ISO 7932

Stanovenie titračnej kyslosti mlieka podľa Soxhlet-Henkela (Palo, 1983)

Sledovanie účinku teploty skladovania a koncentrácie L. rhamnosus VT1 na dynamiku rastu patogénnych baktérií (L. monocytogenes, B. cereus) a technologicky neziadúcej kvasinky (C. maltosa YP1) v modelovom mliečnom prostredí:

Testované mikroorganizmy sa zámerne inokulovali do mliečneho substrátu (UHT polotoučné mlieko) o koncentrácii < 10³ KTJ.ml^-1 za súčasnej inokulácie 18 hodinovou kultúrou L. rhamnosus VT1 o koncetrácii buniek 10⁷ az 10⁸ KTJ.ml^-1. Koncentrácia prídavku MRS bujónu s L. rhamnosus VT1 bol v rozmedzí 0 % do 15% (v/v) podľa typu testovaného mikrooragnizmu. Takto pripravený mliečny substrát sa skladoval pri chladiarenských teplotách. Rastové krivky pre jednotlivé prídavky L. rhamnosus VT1 pri daných teplotách sa vyhodnotili D-modelom a získané rastové parametre sa stali vstupnými údajmi pre sekundárne modelovanie. (viď ďalej)

Sledovanie účinku teploty skladovania a koncentrácie L. rhamnosus VT1 na dynamiku rastu patogénnych baktérií (L. monocytogenes, B. cereus) a technologicky neziadúcej kvasinky (C. maltosa YP1) v reálnom prostredí mliečneho výrobku.

Testované mikroorganizmy sa zámerne inokulovala do mliečneho výrobku o koncentrácii < 10³ KTJ.ml^-1 za súčasnej inokulácie 18 hodinovou kultúrou L. rhamnosus VT1 o koncetrácii buniek 10⁷ az 10⁸ KTJ.ml^-1. Koncentrácia prídavku MRS bujónu s L. rhamnosus VT1 bola 1% (v/v), čo by zodpovedalo reálnemu a skutočne v mliekárenskej praxi pouzívanému mnozstvu ochrannej kultúry. Takto pripravený mliečny substrát sa skladoval pri chladiarenských teplotách. Súčasne sa sledovala kontrolná vzorka bez prídavku L. rhamnosus VT1. Nakoľko pre testovanie inhibičného účinku L. rhamnosus VT1 na kvasinku Candida maltosa YP1 v jogurtoch nebol k dispozícii čistý jogurt bez prídavku ochranných kultúr, kvasinka bola zámerne inokulovaná do jogurtu s prídavkom komerčných ochranných kultúr a ich účinok bol porovnaný s účinkom L. rhamnosus VT1 na C. maltosa YP1 pri daných teplotách a koncentráciách.

Sledovanie vplyvu teploty skladovania a celkového počtu mikroorganizmov na dynamiku rastu spórotvorého psychrotrofného kmeňa B. cereus v pasterizovanom mlieku:

7- dňové pasterizované mlieko sa odobralo priamo z výrobnej linky v dvoch ročných obdobiach, jeseň a jar. Pri preprave teplota neprekročila 2°C. 5 vzoriek mlieka (5 x 1 liter) sa skladovalo pri teplotách 6°C, 8°C, 10°C, 12°C a 14°C 0,5°C v termostatickom boxe s chladením. 3 vzorky mlieka sa vysetrili na prítomnosť B. cereus tak, ze sa v stanovenom časovom intervale vyočkovalo 0,4 ml mlieka na povrch MYP agaru a aby celkové vyočkované mnozstvo bolo 1,2 ml. Súčasne sa paralelne vyočkoval 1 ml príslusného riedenia na stanovenie celkového počtu mikroorganizmov v skladovanom mlieku. Paralelne sa stanovili jeho hodnoty pH a SH hodnoty. Sledovala sa rýchlosť rastu B. cereus prítomného v pasterizovanom mlieku od teploty skladovanie, od inhibičného účinku sprievodnej mikroflóry ako aj zmena aktívnej a titračnej kyslosti mlieka počas skladovacieho pokusu. Na základe matematickej analýzy rastu sa definovali predpovede trvanlivosti a porovnali sa navzájom.

Matematická analýza rastu:

Matematické hodnotenie dynamiky rastu testovaných mikroorganizmov bolo v závislosti od času inkubácie matematicky spracované podľa D-modelu (Baranyi a kol., 1993) (Doc. Ing. Ľubomír Valík, PhD. v rámci kooperácie s FCHPT STU Bratislava).

Výsledky získané z matematického D- modelu (Baranyi a kol.,1993), primárna fáza modelovania rastu boli podrobené matematickému vyhodnoteniu za pouzitia software viacparametrovej lineárnej regresie (Steppan D., Werner J. and Yeater B, 1998). Pre sekundárne modelovanie sa pouzil Ratkowského model a Arrheniov model. Rovnice získané sekundárnym modelovaním sa vyuzili pri predikcii doby trvanlivosti.

Popis dosiahnutých výsledkov riesenia ČÚ vo vzťahu k stanoveným cieľom v r. 2002

V posledných rokoch sa v spojitosti so zvysujúcou sa bezpečnosťou potravín začínajú čoraz častejsie vyuzívať princípy prediktívnej mikrobiológie. Prediktívna mikrobiológia umozňuje vedecky upozorniť na moznosti znízenia hygienického a zdravotného rizika spôsobeného mikroorganizmami u rýchlo sa kaziacich potravín ako aj vysokotepelne opracovaných potravín pomocou určenia vnútorných a vonkajsích faktorov rastu a metabolizmu zúčastnených mikroorganizmov. Oveľa väčsí záujem hygienikov a potravinárskych mikrobiológov je o vyuzitie prediktívnej mikrobiológie v oblasti patogénnych, indikátorových a technologicky neziadúcich mikroorganizmov nez pozitívne vyuzívaných. Preto sa v súčasnosti ďalej rozvíjajú metódy prediktívnej mikrobiológie zalozené na princípe matematického modelovanie rastu, prezívania a inhibície. Dôvody prečo sa zaoberať matematickým modelovaním mikrobiálnych vzťahov v potravinách sú:

• zmenené stravovacie poziadavky konzumentov smerujúce k maximálnej čerstvosti a minimálnemu technologickému opracovaniu potravín
• systém HACCP (analýza rizík kritických kontrolných bodov) ako prostriedok zabezpečujúci potravinovú bezpečnosť si vyzaduje stanovenie kritických limitov pre kľúčové kroky vo výrobe pozívatín. Na základe čoho vyvstala potreba matematických modelov a rovníc, bez ktorých by bolo takmer nemozné zaoberať sa kvantitatívnymi interakciami medzi rôznymi faktormi.
• na trhu existujú stovky rôznych potravín a potravinárskych aditív. Z vedeckého a ani z ekonomického hľadiska nie je mozné získavať informácie o mikrobiologickom stave jednotlivých výrobkov. Systematickou kvantifikáciou a objasňovaním účinkov v modelových systémoch a na prototypových výrobkoch je mozné vytvoriť modely, ktoré odhadujú správanie sa mikroflóry pre daný okruh potravinárskych produktov.
• nepriaznivá epidemiologická situácia na celom svete a s ňou súvisiaci tlak odbornej i laickej verejnosti na znízenie počtu ochorení mikrobiálneho pôvodu z potravín.
• veľkým problémom je predovsetkým schopnosť niektorých patogénnych mikroorganizmov rásť aj pri teplotách nizsích ako 8 °C. Prediktívna mikrobiológia umozňuje vedecky upozorniť na moznosti znízenia hygienického a zdravotného rizika spôsobeného mikroorganizmami pomocou určenia vnútorných a vonkajsích faktorov rastu a metabolizmu zúčastnených mikroorganizmov.

Na základe poziadaviek mliekárenskej praxe z pohľadu predlzovania trvanlivosti pasterizovaného mlieka na jednej strane a mozného zvýsenia rizika alimentárnej intoxikácie prostredníctvom Bacillus cereus na strane druhej sa vykonal skríning jeho výskytu v pasterizovanom mlieku a porovnal sa s údajmi v literatúre. Keďze jeho výskyt sa potvrdil a obchodné reťazce tlačia na výrobcov, aby predlzovali trvanlivosť svojich výrobkov, bolo opodstatnené hľadať spôsoby hodnotenia rizika pomocou matematických modelov a predikcií.

Vysokou adaptačnou schopnosťou mikroorganizmov v potravinárskom prostredí vyvstal problém bombázovania jogurtov kvasinkovou kontamináciou. Vyizolovaný kmeň kvasinky vykazoval termorezistentné, acidotolerantné a oxidatívne vlastnosti a ako kontaminant mliekárenskej prevádzky bol príkladom nedostatočnej hygieny a sanitácie a pre modelové podmienky sa zvolil ako indikátorový mikroorganizmus technologicky neziadúceho kontaminanta.

Sporadický výskyt patogénnych kmeňov Listeria monocytogenes a ochorení z potravín nimi spôsobených, sa v posledných rokoch čoraz častejsie spája s konzumáciou mlieka a mliečnych výrobkov. Z hľadiska ich vysokej patogenity a schopnosti rásť pri chladiarenských teplotách sa vybral ako indikátorový mikroorganizmus pre overenie inhibičných účinkov mliečnych baktérií s cieľom znízenie rizika ich výskytu a zvýsenia zdravotnej bezpečnosti.

Na základe charakteristík jednotlivých vlastností vybraných indikátorových mikroorganizmov sa stanovili metodiky stanovenia pri sledovaní vplyvu významných faktorov prostredia na ich dynamiku rastu (viď pouzité metódy - II.5). Pre vyhodnocovanie dynamiky rastu bol na základe dostupnosti a sirokého pouzitia zvolený D-model (Baranyi a kol., 1993), s následnou moznosťou, ze získané výsledky doplnia uz existujúcu databázu ComBase (UK).

Popis dosiahnutých výsledkov riesenia ČÚ vo vzťahu k stanoveným cieľom v r. 2003

Primárne modelovanie prezívania a rastu mikroorganizmov v závislosti od teploty, ako limitujúceho faktora

Baktérie mliečneho kysnutia - Lactobacillus rhamnosus VT1

Kmeň L. rhamnosus VT1 bol charakterizovaný z hľadiska jeho antifungálnych vlastností (Plocková a kol., 2001, Plocková a kol., 2004, Stiles a kol., 2002), avsak jeho ďalsie antimikrobiálne vlastnosti neboli známe. Preto na jeho antimikrobiálnu charakterizáciu bolo potrebné overiť prezívanie a rast pri chladiarenských teplotách, nakoľko jeho mozné pouzitie, ako ochrannej kultúry, malo smerovať do chladených mliečnych produktov.

Dynamika rastu Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 8°C, 10°C a 15°C ± 0,5 °C

Výsledky dynamiky rastu Lactobacillus rhamnosus VT1 sú uvedené v tabuľke 1 a spojené rastové čiary sú na obr. 1. Z uvedeného obrázku vyplýva, ze kmeň L. rhamnosus VT1 je schopný rásť aj pri teplote 8°C, trvanie lag-fázy bolo 8,4 d a rastová rýchlosť bola 0,0106 h^-1. Z hľadiska jeho ďalsieho testovania je to významné zistenie, keďze jeho antimikrobiálna aktivita sa ďalej sledovala na patogénne a technologicky neziadúce mikroorganizmy v potravinách s predĺzenou dobou trvanlivosti uchovávaných pri chladiarenských teplotách.

Psychrotrofné kmene Bacillus cereus

Pasterizované mlieko je zdrojom sporotvorných kmeňov Bacillus cereus, ktoré mnohé majú psychrotrofné vlastnosti, sú schopné prezívať a rásť pri chladiarenských teplotách. Pri nevhodnom skladovaní môzu spóry vyklíčiť, rásť a pomnoziť sa na úroveň prekračujúcu povolený hygienický limit a tým spôsobiť alimentárne intoxikácie. Z tohto dôvodu sa vykonali skladovacie testy na prezívanie a rast psychrotrofných kmeňov B. cereus v pasterizovanom mlieku s predĺzenou 7-dňovou trvanlivosťou. Na základe matematickej analýzy sa dali definovať predpovede dotýkajúcej sa doby trvanlivosti a hygienickej a zdravotnej bezpečnosti pasterizovaného mlieka. Vyizolované psychrotrofné kmene B. cereus a potom pouzili na ďalsie testovanie inhibičného účinku L. rhamnosus VT1 a teploty v UHT mlieku a mliečnych výrobkoch.

Dynamika rastu B. cereus a celkového počtu mikroorganizmov (CPM) a zmena hodnoty pH a SH pasterizovaného mlieka počas skladovania pri teplote 6°C, 8°C, 10°C ± 0,5 °C (jesenný odber mlieka)

Pri kazdej teplote sa vysetrili vzorky pasterizovaného mlieka, u ktorých sa sledovala prítomnosť Bacillus cereus a CPM a súsasne sa sledovala hodnota pH a hodnota SH. Závislosť nárastu počtu buniek B. cereus a CPM v čase pri danej teplote skladovania ako aj zmena hodnoty pH (hodnoty SH) od doby skladovania je znázornená na obr. 2, 3 a 4. Z experimentálne získaných rastových čiar pre jednotlivé teploty skladovania sa D-modelom získali rastové parametre, ktoré sú uvedené v tabuľke 2. Z uvedených rastových parametrov ako aj rastových čiar vyplynulo, ze so znizujúcou sa teplotou skladovania sa predlzovalo trvanie lag-fázy a znizovala sa rastová rýchlosť, čím sa zvysoval generačný čas. So zvysujúcou sa teplotou skladovania výrazná zmena hodnôt pH (hodnôt SH) nastala za kratsiu dobu. Vyssia teplota skladovania umoznila sprievodnej mezofilnej mikroflóre rýchlejsie pomnozenie sa a naprodukované kyseliny výrazne ovplyvnili pH hodnotu mlieka. Na základe získaných rastových parametrov B. cereus a celkového počtu mikroorganizmov sa mohli definovať predpovede trvanlivosti pasterizovaného mlieka so 7 dňovou dobou spotreby ako aj obsah B. cereus a CPM na konci doby spotreby, t.j. po 7 dňoch skladovania pri danej teplote. Získané predpovede sú uvedené v tabuľke 3.

Dynamika rastu B. cereus a CPM pasterizovaného mlieka počas skladovania pri teplote 4°C, 6°C, 8°C, 10°C, 12°C a 14°C ± 0,5 °C (jarný odber mlieka).

Rastové parametre psychrotrofných kmeňov Bacillus cereus v 7-dňovom pasterizovanom mlieku ako aj pre CPM pre jednotlivé teploty 4°C, 6°C, 8°C, 10°C, 12°C a 14°C boli vypočítané z experimentálnych rastových čiar pouzitím D-modelu. Získané rastové parametre sú uvedené v tabuľke 4. Pri teplote 4°C sa počiatočný počet B. cereus počas doby skladovania nemenil. Sprievodná mikroflóra bola psychrotrofná, bola schopná rásť pri danej teplote a jej rastová rýchlosť bola 0,0129 h^-1 a lag-fáza trvala 342,1 h. Pri teplote 6°C bola rastová rýchlosť B. cereus 0,0255 h^-1 a lag-fáza trvala 142,9 h a pre CPM bola rastová rýchlosť nizsia 0,0187 h^-1, lag-fáz trvala 157,1 h. So zvysujúcou sa teplotou skladovania (od 4°C do 14°C) sa rastová rýchlosť zvysovala a trvanie lag-fázy sa skracovalo. Rastové krivky pre B. cereus sú uvedené na obr. 5. Zo získaných rastových parametrov spojených rastových čiar sa definovali predpovede trvanlivosti pasterizovaného mlieka so 7-dňovou dobou trvanlivosti ako aj obsah B. cereus a CPM na konci doby spotreby, t.j. po 7 dňoch skladovania pri danej teplote. Získané predpovede sú uvedené v tabuľke 5.

Vyuzitie výsledkov primárneho modelovania pri sekundárnom modelovaní rastovej rýchlosti B. cereus ako funkcie teploty a počiatočného CPM v pasterizovanom mlieku so 7-dňovou dobou trvanlivosti z jarného a jesenného odbru vidieť na obr. 6 a danú závislosť bolo mozné popísať nasledovnou rovnicou:

m=0,0432 + 0,0117*T - 0,0218*CPM₀.

Popis dosiahnutých výsledkov riesenia ČÚ vo vzťahu k stanoveným cieľom v r. 2004.

Primárne modelovanie prezívania a rastu Listeria monocytogenes 272 (A) a referenčného kmeňa Listeria monocytogenes Scott A (B) v modelových podmienkach

Pre stanovenie počtu L. monocytogenes a L. rhamnosus VT1 pri súbeznej kultivácii kmeňov v modelovom zivnom prostredí sa otestovala selektivita kultivačných médií. Zvolená chladiarenská teplota skladovania (8°C, 10°C, 12 °C a 14°C) odrázala bezného výskytu v chladničkách, psychrotrofnosť kmeňov L. monocytogenes a schopnosti prezívať a rásť antagonisticky pôsobiaceho kmeňa L. rhamnosus VT1.

Dynamika rastu čistej kultúry L. monocytogenes (A , B) v mliečnom zivnom prostredí pri teplote 6°C, 8°C, 10°C, 12°C a 14°C ± 0,5°C.

Dynamika rastu čistých kultúr L. monocytogenes, je zobrazená na obr. 7 a 8. So zvysujúcou sa teplotou skladovania sa rastová rýchlosť zvysovala a trvanie lag-fázy sa skracovalo. Získané rastové parametre sú uvedené v tabuľke 6. Generačný čas poukazuje na psychrotrofné vlastnosti kmeňov L. monocytogenes. Získané rastové parametre pre oba testované kmene sú veľmi podobné ako aj ich správanie sa v mliečnom zivnom prostredí pri testovaných teplotách, hoci kmeň A je silne b-hemolytický na rozdiel od referenčného kmeňa B, ktorý má potlačenú b-hemolýzu.

Dynamika rastu L. monocytogenes v mliečnom zivnom prostredí inokulovanom čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 8°C, 10°C, 12°C a 14°C ± 0,5°C.

Dynamika rastu Listeria monocytogenes kmeň A v závislosti od koncentrácie L. rhamnosus VT1 a teploty je znázornená na obr. 9, 10, 11 a 12. Obdobné závislosti sa získali aj pre kmeň B. Súbezne sa sledovala aj dynamika rastu L. rhamnosus VT1 a zmena hodnôt pH. Rastové parametre pre L. monocytogenes (A, B) a L. rhamnosus VT1 pre jednotlivé skladovacie teploty sú uvedené v tabuľke 7 a 8.

Počty laktobacilov sa počas doby skladovania pri teplote 8°C nemenili, ich počty sa pohybovali v rámci 10⁸ KTJ^.ml^-1 a rastová rýchlosť L. rhamnosus VT1 sa pohybovala od 0,0006 h^-1 do 0,0084 h^-1. Z tabuľky 7 vyplýva, ze zvysujúci sa prídavok L. rhamnosus VT1 znizoval rastovú rýchlosť oboch kmeňov L. monocytogenes. Významnejsí pokles rastovej rýchlosti L. monocytogenes pri 8°C bol az pri 10% prídavku laktobacilov. Pre kmeň A rastová rýchlosť klesla o 40% a zároveň sa trvanie lag-fázy predĺzilo o 15 h, pre kmeň B sa rastová rýchlosť znízila o 52%, avsak trvanie lag-fázy nebolo významne predĺzené. Zo získaných výsledkov vyplýva, ze pri teplote 8°C rastovú rýchlosť kmeňov L. monocytogenes významne ovplyvňuje len vysoký prídavok laktobacila, ktorý vsak výrazne neovplyvňujú trvanie lag-fázy, čo môze byť spôsobené nízkou teplotou pre rast L. rhamnosus VT1. V predchádzajúcej práci sa zistilo, ze 8°C je zatiaľ najnizsia teplote, kedy tento kmeň je schopný rásť s pomerne dlhou lag-fázou (viac ako 8 d). Inhibičný účinok pri teplote 8°C bol spôsobený metabolitami naprodukovanými počas prípravy inokula.

Počty laktobacilov sa počas doby skladovania pri teplote 10°C mierne zvýsili, čo sa prejavilo výraznejsím poklesom hodnoty pH (zvýsením hodnoty SH) ako aj zvýsenou rastovou rýchlosťou. Získané rastové čiary sú uvedené na obr. 13. Dynamiku rastu kmeňov L. monocytogenes pri teplote 10°C charakterizujú rastové parametre (tabuľka 7), z ktorých vyplýva, ze zvysujúci sa prídavok L. rhamnosus VT1 znizoval rastovú rýchlosť oboch kmeňov L. monocytogenes. Zatiaľ čo pri teplote 10°C významnejsí pokles rastovej rýchlosti o 38% bol pozorovaný pri 5% prídavku laktobacilov, pri teplote skladovania 12°C znízenie rastovej rýchlosti o 30% bolo uz pri 2,5% prídavku laktobacilov. Z uvedeného je zrejmé, ze zvýsenie teploty priaznivo ovplyvnilo rast laktobacilov a uz pri ich nizsej inokulácii produkcia antimikrobiálne pôsobiacich látok bola výraznejsia, čo sa prejavilo v potlačení rastu testovaných kmeňov L. monocytogenes. Počty laktobacilov počas skladovania pri 12°C sa zvýsili o 1 log poriadok a prislo k výraznej zmene hodnoty pH a SH, pre 2,5% prídavok laktobacilov sa hodnota pH znízila z 6,32 na 5,28, pre 5% prídavok z 6,11 na 4,82. Hodnota pH čistej kultúry L. monocytogenes v mliečnom prostredí sa pohybovala od 6,54 po 6,59 počas skladovania pri 12°C. Este výraznejsí účinok L. rhamnosus VT1 na kmeň A L. monocytogenes pri teplote 14°C mal 2,5% prídavok laktobacilov, kedy rastová rýchlosť sa znízila o 35%. Pri teplote 14°C uz 1% prídavok znízil rastovú rýchlosť o 24%.

Primárne a sekundárne modelovanie prezívania a rastu Bacillus cereus v modelových podmienkach

Primárne modelovanie prezívania a rastu psychrotrofného kmeňa Bacillus cereus sa sledovalo v mliečnom zivnom prostredí v závislosti od teploty skladovania a rôzneho prídavku L. rhamnosus VT1. Získané rastové parametre z primárneho modelovania boli vstupnými údajmi pri sekundárnom modelovaní.

Dynamika rastu Bacillus cereus v mliečnom zivnom prostredí inokulovanom čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 8°C, 10°C a 12°C ± 0,5 °C

Rastové parametre B. cereus v UHT mlieku, pre jednotlivé počiatočné koncentrácie L. rhamnosus VT1 (0 az 10 % v/v) a pre skladovacie teploty 8°C, 10°C a 12°C boli vypočítané z experimentálnych rastových čiar pouzitím primárneho matematického modelu, D-modelu (Baranyi a kol., 1993). Získané parametre sú uvedené v tabuľke 9, 10 a 11. So zvysujúcou sa koncentráciou inokula L. rhamnosus VT1 v mlieku pri teplote 8 °C sa rastové rýchlosti B. cereus postupne znizovali. Po 4 % inokulácii UHT mliek L. rhamnosus VT1 rastová rýchlosť B. cereus poklesla viac ako o 50 %. Este k výraznejsiemu spomaleniu az zastaveniu rastu B. cereus prislo po inokulácii UHT mlieka 5 a 10% L. rhamnosus VT1. Dynamika rastu B. cereus v závislosti od zvysujúcej sa koncentrácie L. rhamnosus VT1 pri teplote 8°C, 10°C a 12°C je na obr.14, 15, 16. Rastová rýchlosť B. cereus v zámerne inokulovanom UHT mlieku sa znizuje vplyvom znizovania skladovacej teploty a vplyvom zvysovania prídavku laktobacilov. Pri teplote 10°C s prídavkom laktobacilov (7% v/v), resp. 12°C (4% v/v) bola rastová rýchlosť B. cereus v mlieku 3,3-krát resp. 2,9-krát nizsia a generačný čas 4,2-krát resp. 2,9-krát dlhsí v porovnaní s rastovými parametrami B. cereus zistenými pri týchto teplotách v mlieku bez prídavku laktobacilov. V prípade 5% a 7% (v/v) prídavku kultúry L. rhamnosus VT 1 pri teplote 12°C dochádzalo hneď od počiatku k odumieraniu buniek B. cereus, rastová rýchlosť dosahovala záporné hodnoty. Zároveň nebol pozorovaný významný vplyv týchto rastových podmienok na lag-fázu B. cereus.

Vyuzitie výsledkov primárneho modelovania pri sekundárnom modelovaní rastu B. cereus ako funkcie teploty a počiatočnej koncentrácie L. rhamnosus VT1

Získané rastové parametre Bacillus cereus v UHT mlieku, pre jednotlivé počiatočné koncentrácie L. rhamnosus VT1 (1 az 10 % v/v) a teploty uchovávania 8, 10, 12°C, boli vypočítané z experimentálnych rastových čiar pouzitím D-modelu. Následne sa rastové parametre analyzovali vo vzťahu k denzite čistej kultúry L. rhamnosus VT1 a teplote pouzitím viacparametrovej lineárnej regresie, sekundárne modelovanie. Na základe získaných parametrov sa mohla závislosť rastovej rýchlosti B. cereus ako funkcie koncentrácie L. rhamnosus VT1 a teploty vyjadriť graficky (obr. 17) a popísať nasledovnou rovnicou:

µ = -0,0826 + 0,01409c + 0,01399T - 0,0022Tc

R² = 0,852

Primárne a sekundárne modelovanie prezívania a rastu Candida maltosa YP1 v modelovom zivnom prostredí

Dynamika rastu Candida maltosa YP1 v mliečnom zivnom prostredí inokulovanom čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 8°C, 10°C ± 0,5 °C

Rastové parametre kvasinky Candida maltosa YP1 v UHT mlieku, pre jednotlivé počiatočné koncentrácie L. rhamnosus VT1 (1 az 15 % v/v) a obe chladiace teploty 8 a 10 °C, boli vypočítané z experimentálnych rastových čiar pouzitím D-modelu. So zvysujúcou sa koncentráciou inokula L. rhamnosus VT1 v UHT mlieku sa trvanie lag-fázy predlzovalo a rastové rýchlosti kvasinky sa postupne znizovali. Prídavok 1 % kultúry L. rhamnosus VT1 do UHT mlieka nespôsobil významnejsiu zmenu dynamiky rastu C. maltosa YP1. V mlieku obsahujúcom 2,5 % L. rhamnosus VT1 rastová rýchlosť kvasinky poklesla o 9,7 % a dĺzka lag-fázy kvasinky sa takmer nezmenila v porovnaní s 1 % inokuláciou. Po 5 % inokulácii UHT mliek sa dĺzka fázy prispôsobovania kvasinky predĺzila takmer 6,5 násobne v porovnaní s mliečnym zivným prostredím zaočkovaným 1 % L. rhamnosus VT1 a rastová rýchlosť poklesla o 50 %. Este k výraznejsiemu spomaleniu dynamiky rastu C. maltosa YP1 doslo v priebehu inkubácie kvasinky v mliečnom zivnom prostredí s 10 % prídavkom L. rhamnosus VT1, kedy sa dĺzka lag-fázy C. maltosa YP1 zvýsila 7,1-krát (221,4 h) v porovnaní s lag-fázou zaznamenanou pri 1 % inokulácii (31 h) mlieka kultúrou L. rhamnosus VT1 a rastová rýchlosť klesla na hodnotu 0,0137 h^-1, t.j. o 57 %.

Podobne ako pri teplote 8 °C, aj pri teplote 10 °C zvysujúca sa koncentrácia kultúry L. rhamnosus VT1 v mliečnom zivnom prostredí spôsobovala parciálnu inhibíciu dynamiky rastu kvasinky C. maltosa YP1. Ako mozno z tabuľky 12 a 13 a obr. 18 a 19 vidieť, so zvysujúcou sa koncentráciou inokula L. rhamnosus VT1 v UHT mlieku sa trvanie lag-fázy sa predlzovalo a rastové rýchlosti kvasinky sa postupne znizovali. Najvyssia rastová rýchlosť (0,044 h^-1) a najkratsie trvanie lag-fázy kvasinky (17 h) bolo pozorované v kontrolnej vzorke bez zámernej inokulácie L. rhamnosus VT1. Prídavok 1% kultúry laktobacilov do UHT mlieka spôsobil predĺzenie lag-fázy kvasinky na 25 h. V prípade 2,5 % prídavku L. rhamnosus VT1 do mlieka sa rastová rýchlosť a dĺzka lag-fázy kvasinky takmer nezmenili v porovnaní s 1 % inokuláciou, po 5 % inokulácii UHT mliek sa dĺzka fázy prispôsobovania kvasinky predĺzila takmer dvojnásobne v porovnaní s mliečnym zivným prostredím zaočkovaným 1 % L. rhamnosus VT1. Este k výraznejsiemu predĺzeniu lag-fázy Candida maltosa YP1 doslo v priebehu inkubácie kvasinky v mliečnom zivnom prostredí s 10 a 15 % prídavkom L. rhamnosus VT1, kedy sa dĺzka lag-fázy v prípade 10 % inokulácie zvýsila 5,5-krát (136,7 h) a v prípade 15 % prídavku az 8,8-krát (218,1 h) v porovnaní s lag-fázou zaznamenanou pri 1 % inokulácii (24,7 h) mlieka kultúrou L. rhamnosus VT1.

Zvysujúci sa stupeň inokulácie ultrapasterizovaných mliek kultúrou L. rhamnosus VT1 spôsobil aj znizovanie rastových rýchlostí kvasinky C. maltosa YP1. Vplyv koncentrácie L. rhamnosus VT1 na rastovú rýchlosť C. maltosa YP1 bol vsak menej výrazný ako v prípade lag-fázy. Maximálna rastová rýchlosť kvasinky C. maltosa YP1 bola pozorovaná v pokusoch bez prídavku čistej kultúry L. rhamnosus VT1, a to v priemere 0,044 h^-1. Prídavok 1 % L. rhamnosus VT1 spôsobil znízenie dynamiky rastu kvasinky 1,5 násobne (μ= 0,028 h^-1). Zvýsením koncentrácie buniek L. rhamnosus VT1 na 10 a 15 % viedlo k poklesu rastovej rýchlosti kvasinky o 65,5 % a o 51 % v porovnaní s 1 % inokuláciou.

Inhibičný účinok L. rhamnosus VT1 voči technologicky neziadúcej kvasinke bol overený pri teplotách 8, 10, 17 a 21°C. V ďalsej práci sa potom inhibíciu rastu kontaminanta C. maltosa YP1 18 hodinovou kultúrou L. rhamnosus VT1 matematicky analyzovala.

Vplyv koncentrácie L. rhamnosus VT1 a teploty na trvanie lag-fázy a rastovú rýchlosť Candida maltosa YP1 v mliečnom zivnom prostredí a vyuzitie výsledkov primárneho modelovania pri sekundárnom modelovaní rastu C. maltosa YP1 ako funkcie teploty a počiatočnej koncentrácie L. rhamnosus VT1

Rastové parametre kvasinky C. maltosa YP1 v UHT mlieku, pre jednotlivé počiatočné koncentrácie L. rhamnosus VT1 (1 az 15 % v/v) a styri teploty uchovávania, 8, 10, 17 a 21 °C, boli vypočítané z experimentálnych rastových čiar pouzitím D-modelu. Následne boli rastové parametre analyzované vo vzťahu ku denzite čistej kultúry L. rhamnosus VT1 a teplote pouzitím viacparametrovej lineárnej regresie, tzv. sekundárna fáza matematického modelovania.

Zvysujúca sa koncentrácia kultúry L. rhamnosus VT1 z 1,0 na 15,0 % a znizujúca sa teplota uchovávania (z 21 °C na 8 °C) spôsobila parciálnu inhibíciu rastu a rozmnozovania oxidatívnej kvasinky C. maltosa YP1, čo sa prejavilo predlzovaním dĺzky lag-fázy a znizovaním hodnôt rastových rýchlostí. Trvanie lag-fázy a hodnoty rastových rýchlostí kontaminanta C. maltosa YP1 v závislosti od rôznej koncentrácie laktobacilov a teplôt uchovávania v mliečnom substráte boli statisticky významné (obr. 20 a 21). Závislosť lag-fázy a rastovej rýchlosti C. maltosa YP1 ako funkcie L. rhamnosus VT1 koncentrácií a teploty bolo mozné popísať nasledovnými viacparametrovými rovnicami (tabuľka 14

Pokles teploty uchovávania z 10 °C na 8 °C významne ovplyvnil predlzovanie lag-fázy C. maltosa YP1 pre jednotlivé koncentrácie laktobacilov (obr. 22). Napríklad pri 10 °C a 1 % prídavku L. rhamnosus VT1 bola lag-fáza kvasinky 1,3 krát kratsia ako pri 8 °C, no zvýsením počiatočnej denzity laktobacilov na 5 % sa lag-fáza kvasinky pri 8 °C predĺzila 5-krát v porovnaní s teplotou 10 °C. Rastové rýchlosti kvasinky vsak neboli významnejsie ovplyvnené nízkou teplotou 8 °C, ale len prídavkami kultúry L. rhamnosus VT1, čo je mozné vidieť zo smerníc lineárnych čiar uvedených v obr. 23

Ak by počas výroby jogurtov doslo k ich kontaminácii bunkami C. maltosa YP1 v počiatočnej denzite 1 KTJ.ml^-1 a následne by boli uchovávané pri 8°C 0.5 °C (GT = 14,6 h), ich znehodnotenie by s najväčsou pravdepodobnosťou nastalo po 13 dňoch. Prídavok 18 h kultúry L. rhamnosus VT1 v koncentrácii 15 % (konc. kyseliny mliečnej 0.3 %) by viedol k predĺzeniu času potrebnému pre dosiahnutie density 10⁶ KTJ.ml^-1 kvasinkami v počiatočnej koncentrácii N₀ = 1 KTJ.ml^-1 a teplote 10 °C na 30 dní. Pri teplote 8 °C a koncentrácii laktobacilov 10 % by sa uvedený limit dosiahol az po 33 dňoch (tabuľka 15 Lauková a Valík, 2004).

Popis dosiahnutých výsledkov riesenia ČÚ vo vzťahu k stanoveným cieľom v r. 2005

Dynamika rastu Bacillus cereus v mliečnom zivnom prostredí inokulovanom čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 14°C, 16°C a 20°C ± 0,5 °C

Dynamika rastu B. cereus bola sledovaná ako závislosť počtu buniek od času a od koncentrácie pridaného inokula L. rhamnosus VT1. Rastové parametre B. cereus v UHT mlieku, pre jednotlivé počiatočné koncentrácie L. rhamnosus VT1 (0, 1, 3, 5, 7 a 10 % v/v) a pre skladovaciu teplotu 14°C, 16°C a 20°C boli vypočítané z experimentálnych rastových kriviek (obr. 24, 25, 26) pouzitím D-modelu. Získané rastové parametre sú uvedené v tabuľke 16. Rastová rýchlosť B. cereus (m) so zvysujúcou sa počiatočnou koncentráciou prítomného L. rhamnosus VT 1 v systéme klesá pre vsetky skladovacie teploty. So stúpajúcou teplotou sa rastová rýchlosť B. cereus zvysovala pre kazdý prídavok L. rhamnosus VT 1. Opačnú závislosť môzeme pozorovať u generačného času (GT), ktorý sa odvíja od rastovej rýchlosti a je k nej nepriamoúmerný. Ďalej sa zistilo, ze koncentrácia pridaného laktobacila nemala významný vplyv na dĺzku lag-fázy (l) rastovej krivky B. cereus. Antibakteriálny účinok Lactobacillus rhamnosus VT1 mal významný vplyv len na rastovú rýchlosť B. cereus pri sledovaných skladovacích teplotách.

Vyuzitie výsledkov primárneho modelovania pri sekundárnom modelovaní rastu B. cereus ako funkcie teploty a počiatočnej koncentrácie L. rhamnosus VT1

V sekundárnej časti modelovania sme získali matematické vyjadrenie závislosti rastovej rýchlosti B. cereus od pridanej koncentrácie L. rhamnosus VT 1, pre jednotlivé skladovacie teploty zvlásť. Ako z obr. 27 vyplýva, závislosti bolo mozné popísať lineárnou matematickou rovnicou s vysokým korelačným koeficientom. Rastové údaje z primárneho modelovania pre sesť skladovacích teplôt (8°C, 10°C, 12°C, 14°C, 16°C a 20°C) a sesť rôznych koncentrácií prídavku L. rhamnosus VT 1 (0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%) sa matematicky vyhodnotili. Matematické vyjadrenie závislosti rastovej rýchlosti ako funkcie času, teploty a pridaného objemu L. rhamnosus VT1 vyjadruje nasledovná rovnica:

m_BC = -0,0294+0,0005*t + 0,0045*V₀ + 0,0008*T²-0,0015*T*V₀+0,0005*V₀²

Primárne a sekundárne modelovanie v reálnych podmienkach pozívatín

Prehľad výskytu Bacillus cereus v potravinárskych výrobkoch a surovinách

V predoslých etapách riesenia ČÚ sa získali rastové charakteristiky Bacillus cereus v modelových podmienkach, t.j. mliečnom zivnom prostredí, v závislosti od teploty a prídavku L. rhamnosus VT1. V poslednej etape riesenia sa testovalo správanie sa B. cereus v reálnych podmienkach potravín v závislosti od vyssie spomínaných faktorov prostredia. B. cereus je bezným kontaminantom vsetkých primárnych poľnohospodárskych produktov (mlieko, rastliny, ryza) a následne je schopný preziť aj osetrenie pasterizáciou vo forme spór. Psychrotrófne kmene B. cereus limitujú dobu údrznosti čerstvých chladených mliečnych a lahôdkárskych výrobkov, a tiez hotových jedál skladovaných pri chladiarenských teplotách. Reálne podmienky pre rast B. cereus teda môzu tvoriť okrem samotného mlieka, aj nátierky s mliečnym alebo zeleninovým základom. Zdrojom kontaminanta vo výrobku môze byť samotná surovina ako aj pridané pochutiny a koreniny.

Výsledky skríningu výrobkov, surovín a korenín, v ktorých sa predpokladal výskyt B. cereus, sú uvedené v tabuľke 17 a znázornené na obr. 28 a 29.

Hygienický limit pre prítomnosť B. cereus vo výrobkoch osetrených pasterizáciou je 10⁴KTJ.g^-1. Mikrobiologicky bolo vysetrených 1 - 4ks z uvedených potravinárskych komodít. V sledovaných výrobkoch sa zistila prítomnosť B. cereus v mnozstve poriadkovo 10 KTJ.g^-1 (majonézový salát - MS2, smotanová nátierka - SN, cícerová nátierka - CN, cottage cheese s pazítkou - CCHP), čo je 33% zo vsetkých vysetrených druhov výrobkov. Vo vysetrovaných surovinách a koreninách bol zistený počet B. cereus poriadkovo 10 - 100 KTJ.g^-1 a to v 57% vysetrených vzorkách. Obsah CPM vo výrobkoch bol výrazne ovplyvnený tepelnou úpravou finálneho výrobku (1 -100 KTJ.g^-1), alebo tepelnou úpravou základnej suroviny (100 - 1000 KTJ.g^-1), v prípade nepasterizovaných výrobkov, v surovinách a koreninách je bezný výskyt CPM 10³ - 10⁵ KTJ.g^-1.

Dynamika prezívania a rastu Bacillus cereus v prirodzene kontaminovaných potravinárskych výrobkoch pri chladiarenskej teplote 10°C ± 0,5 °C

Skladovaciemu testu sa podrobili výrobky, u ktorých je praktický alebo teoretický predpoklad výskytu B. cereus. V dvoch vzorkách výrobkov bol B. cereus prirodzene prítomný. Smotanová nátierka termizovaná SN1, 15 KTJ/g, pH 4,61 a cícerová nátierka CN 50 KTJ/g, pH 6,07.Počas doby skladovania týchto výrobkov dochádzalo k odumieraniu buniek B. cereus (obr. 30), rastová rýchlosť dosahovala záporné hodnoty (tabuľka 18), čo spôsobila nízka hodnota pH v prípade vzorky SN1, ktorá inhibovala jeho rast. U vzorky CN bol pozorovaný nárast sprievodnej mikroflóry (CPM, obr. 31), ktorá prednostne spotrebovala dostupné ziviny, čím rast B. cereus bol obmedzený. Keďze zrejme islo medzofilné kmene B. cereus, prostredie s nízkou hodnotou pH a vysokou sprievodnou mikroflórou, nebolo mozné vykonať primárne modelovanie v reálne kontaminovaných potravinách. Z tohto dôvodu sa pre primárne modelovanie a získanie rastových charakteristík B. cereus vybrané potraviny zámerne inokulovali bunkami B. cereus v mnozstve 100 - 1000 KTJ.g^-1. Ako reprezentatívne potraviny boli vybraté: mliečna ryza (vzorky R1, R2), sampiňónová nátierka (SN), bryndzová nátierka (BN1, BN2) a smotanová nátierka (SN2).

Na základe získaných rastových parametrov (tabuľka 18) z primárneho modelovania, rastové krivky (obr. 28), bolo mozné predpovedať dobu trvanlivosti týchto výrobkov v dňoch pri 10°C, za ktorú B. cereus dosiahne hygienický limit 10⁴ KTJ/g. Hoci teplota skladovania daných výrobkov je do 8°C, častokrát podmienky skladovania, najmä v domácnostiach prekračujú stanovenú hranicu. Z tohto dôvodu bola zvolená nadlimitná teplota 10°C.

Rastové krivky a rastové charakteristiky výrobkov, ktorých limitujúcim faktorom údrznosti bol CPM sú uvedené na obr. 31 a v tabuľke 19, tiez predikcia doby skladovania výrobkov v dňoch, za ktorú dosiahne hodnota CPM hygienický limit 10⁵ KTJ.g^-1.

Za rizikové potraviny z hľadiska prítomnosti a rozmnozovania B. cereus mozno označiť mliečne výrobky, zeleninové a strukovinové nátierky s hodnotou pH 6,0, ktoré majú pri 10°C dobu údrznosti limitovanú obsahom B. cereus v trvaní 3 - 6 dní (ak neberieme do úvahy vysoký obsah sprievodnej mikroflóry v prípade SN, ktorá potom preberá úlohu limitujúceho faktora). Obmedzenie doby trvanlivosti pri 10°C na 1 -4 dni, z hľadiska obsahu CPM, majú čerstvé lahôdkárske výrobky, ktoré sa pripravujú dochucovaním základnej suroviny, hoci aj tepelne osetrenej.

Dynamika rastu Bacillus cereus v mliečnych výrobkoch inokulovaných čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri prekročených chladiarenských teplotách 10°C a 12°C ± 0,5°C

Následne sa sledovalo primárne a sekundárne modelovanie rastu B. cereus v závislosti od koncentrácie L. rhamnosus VT1 a teploty skladovania v potravinárskych výrobkoch, ktoré odrázali priemyselne vyrábané potraviny, ale boli pripravené za aseptických podmienok laboratória. Nakoľko priemyselne vyrábané potraviny boli v rôznom časovom úseku skladovania a prítomnosť pomnozenej sprievodnej mikroflóry mohlo skresliť výsledky, pristúpilo sa k tomu, ze v laboratórnych podmienkach sa pripravili matrice výrobkov (mozná domáca výroba u konzumentov), ako zivné prostredie pre B. cereus, nasledovného zlozenia:

mliečna ryza (pH 6,0): 200g ryze, 1000ml mlieka, 40g cukru, úprava varením

fazuľová nátierka (pH 6,0): 170g uvarenej prepasírovanej fazule, 30g oleja, úprava miesaním

majonéza I. (pH 6,0) zlozenie: 1 zĺtok, 120g oleja, 64g mlieka, úprava sľahaním

majonéza II. (pH 5,5) zlozenie: 1zĺtok, 10g horčice, 120g oleja, 54g mlieka, úprava sľahaním

Takto pripravené potravinové matrice sa zámerne inokulovali B. cereus v mnozstve <10³ KTJ/g a 1% prídavkom L. rhamnosus VT1 a skladovali pri teplotách 10°C a 12°C. Získané rastové krivky B. cereus v jednotlivých výrobkoch sú znázornené na obr. 32 a obr. 33. Z rastových kriviek sa následne matematickým modelovaním získali rastové charakteristiky, ktoré sú uvedené v tabuľke 20. Z rastových rýchlostí vidno, ze uz aj 1% prídavok L. rhamnosus VT1 významne znízil rastovú rýchlosť B. cereus v sledovaných potravinách.

Inokulácia ochrannej kultúry v priemyselne pouzívanom mnozstve 1% do mliečnych výrobkov sa ukázala ako účinná na znizovanie rastovej rýchlosti kontaminanta B. cereus. Z hodnotenia sa môzu vynechať výrobky s hodnotou pH <5,5, kde prídavok ochrannej kultúry nie je potrebný a nemá výrazný vplyv na urýchlenie odumierania B. cereus. Pri sledovaných teplotách 10°C a 12°C sa zvýsil generačný čas buniek B. cereus od 43% (majonéza 1, 12°C) az po 81% (mliečna ryza, 10°C).

Z údajov v tabuľke 21 je zrejmé, ze prídavok ochrannej kultúry L. rhamnosus VT1, by predĺzil dobu trvanlivosti lahôdkárskych výrobkov, ohrozených výskytom a moznosťou rozmnozovania kontaminanta B. cereus počas skladovania pri teplotách 10°C a 12°C o 28 - 86%. Predikcie času trvanlivosti [d] z hľadiska prítomnosti B. cereus v sledovaných výrobkoch bez a s prídavkom L. rhamnosus VT 1 ako aj porovnanie s predikciou času [d] dosiahnutia hygienického limitu pre B. cereus v modelovom zivnom prostredí sú uvedené v tabuľke 22. Z výsledkov vyplynulo, ze L. rhamnosus VT1 bol schopný predĺziť trvanlivosť ako modelovej tak aj reálnej potravinovej matrice.

Primárne modelovanie - vplyv komerčnej ochrannej kultúry na dynamiku rastu kvasinky Candida maltosa v jogurte

Čerstvé jogurty s ochrannou kultúrou boli na začiatku experimentov zámerne inokulované základnou suspenziou kvasinky C. maltosa YP1 a uchovávané v termostate pri teplote 6 az 21 °C. Rastové krivky vyhodnotené pomocou D-modelu sú znázornené na obr. 34 a rastové parametre sú zosumarizované v tabuľke 23. Grafické znázornenie rastových kriviek C. maltosa YP1 ako aj rastové parametre prezentujú fakt, ze so zvysujúcou sa teplotou uchovávania sa skracovala lag-fáza i generačný čas a zvysovala sa rastová rýchlosť kvasinky. Obdobne sa skracoval aj čas potrebný na ukončenie exponenciálnej fázy a začiatok stacionárnej fázy rastu C. maltosa YP1.

Ako mozno vidieť na grafickom znázornení priebehu dynamiky rastu C. maltosa YP1, najnizsie rastové rýchlosti sa prirodzene zistili pri teplote 6 °C (μ_K,6°C = 0,0096 h^-1; μ_N,6°C = 0,0161 h^-1). Týmto údajom zodpovedali aj najdlhsie generačné časy (GT_K,6°C = 18,5 h; GT _N,6°C = 31,5 h) a najväčsie dĺzky lag-fázy (λ _K,6°C = 48,8 h; λ _N,6°C = 98,4 h). Dôlezitým ukazovateľom publikovaným uz v práci Laukovej a Valíka (2003) je, ze C. maltosa YP1 bola schopná pri teplote 6 ± 1 °C rásť a mozno ju teda povazovať za psychrotrofnú kvasinku.

Priebeh rastu C. maltosa YP1 v jogurte N pri 8 °C znázornený rastovou čiarou (obr. 34), má klasický sigmoidálny charakter. Kvasinka rástla s 11 hodinovou lag-fázou, čo predstavuje jej 9- násobné skrátenie v porovnaní s dĺzkou lag-fázy zaznamenanou v jogurte N pri 6 °C. Rastová rýchlosť je vsak v oboch prípadoch takmer rovnaká (μ_N,8°C = 0,0096 h^-1). Stacionárna fáza rastu sa začala priblizne po 360 hodinách uchovávania, t.j. po 15 dňoch a denzita C. maltosa YP1 vzrástla z 5,8.10² KTJ. ml^-1 takmer na hodnotu 10⁶ KTJ. ml^-1.

Postupným zvysovaním teploty sa rast kvasinky urýchlil. Pri teplote 12 °C sa rastová rýchlosť v jogurte N zvýsila na 0,0252 h^-1 a v jogurte K na hodnotu 0,0319 h^-1. Analogicky sa skrátili dĺzky lag-fázy a generačné časy. Zvýsením inkubačnej teploty o 4 °C (t. j. z 8 °C na 12 °C), tak doslo v jogurte K priblizne k stvornásobnému skráteniu lag-fázy tohto mikroorganizmu. Pre získanie úplnej rastovej krivky C. maltosa YP1 vo vzorke jogurtu K trval pokus 166 h (7 d) a C. maltosa YP1 dosiahla v stacionárnej fáze rastu maximálny počet 2,6.10⁶ KTJ. ml^-1. Vo vzorke N dosiahla kvasinka v stacionárnej fáze rastu koncentráciu 1,2.10⁷ KTJ. ml^-1, pričom jej generačný čas bol takmer 12 h. Najvyssia dynamika rastu kontaminanta C. maltosa YP1 v jogurtových krémoch bola pozorovaná pri teplotách 18 a 21 °C. Napríklad pri teplote 18 °C bol nárast kultúry v priemere 4,3 - krát vyssí ako pri teplote 6 °C. Rastová rýchlosť v jogurte K dosiahla hodnotu μ _K,18°C = 0,0540 h^-1, čomu zodpovedal generačný čas GT_K,18°C = 4,3 h. Lag-fáza sa skrátila na dobu 8,5 hodiny. Podobné údaje sa pri tejto teplote získali aj v jogurte N. Priemerná rastová rýchlosť kvasinky C. maltosa YP1 sa pri teplote 21 °C zvýsila takmer 6-krát v porovnaní s rastom pri 6 ± 1°C. V jogurte K vzrástla rastová rýchlosť kvasinky na hodnotu μ_K,21°C = 0,0746 h^-1 a generačný čas bol 4 hodiny. Kvasinka rástla len s takmer 9 hodinovou lag-fázou, počiatočným podmienkam sa teda prispôsobovala o takmer 40 hodín kratsie ako pri teplote 6 °C. Ako vidieť aj na grafickom znázornení priebehu rastu C. maltosa YP1, rástla kvasinka v jogurte N podobne ako v jogurte K. Rastová rýchlosť bola v oboch prípadoch takmer totozná, čomu zodpovedal aj rovnaký generačný čas (μ _N,21°C = 0,0767 h^-1; GT_N,21°C = 3,9 h ). Dĺzka lag-fázy sa skrátila na 6,3 h.

V inokulovanných jogurtoch sa pri vsetkých teplotách sledoval vývoj hodnôt pH a SH. Pri teplotách 6 a 8 °C sa tieto hodnoty takmer nemenili a počas celej doby kultivácie zostávali viac-menej na rovnakej úrovni (∆pH bolo maximálne 0,2 a ∆SH bolo maximálne 3). Pri vyssích teplotách sa pozorovalo mierne okysľovanie prostredia (tabuľka 23). Tento vývoj bol spôsobený dokysávaním jogurtov zapríčineným jogurtovou mliekárenskou kultúrou.

Sekundárne modelovanie - závislosť rastových parametrov kvasinky Candida maltosa YP1 od teploty uchovávania v jogurte s komerčnou ochrannou kultúrou

Pre analýzu závislosti rastovej rýchlosti vysetrovaného kmeňa kvasinky C. maltosa YP1 od teploty inkubácie v jogurtoch s ochrannou kultúrou sa vyuzil osvedčený Ratkowského model a Arrheniov model (McDonald a Sun, 1999). Vplyv teploty na rastovú rýchlosť kvasinky v jogurte určený pomocou Ratkowského modelu (obr. 35) opisuje rovnica s nízkou pravdepodobnosťou omylu reprezentovanou vysokým korelačným koeficientom :

μ^1/2 = 0,0112.T + 0,0373  R² (μ) = 0,9659

kde μ je rastová rýchlosť [h^-1], T je teplota uchovávania [°C], R je korelačný koeficient.

Linearizovaný vplyv teploty na rastovú rýchlosť vyhodnotený pomocou Arrheniovho modelu je znázornený na obr. 36 a charakterizuje ho rovnica :

ln μ = - (15,421 / T ) - 2,0626  R² (μ) = 0,8369

V súlade s podmienkami pouzitia sekundárnych matematických modelov, bol korelačný koeficient pri Arrheniovom modele nizsí a výsledok modelovania bol teda menej presný ako v prípade Ratkowského modelu. Ako vyplýva z obr. 37 na trvanie lag-fázy zreteľne vplývala teplota uchovávania. So zvysujúcou sa teplotou inkubácie sa trvanie lag-fázy skracovalo. Tento poznatok je prirodzený, výsledkom je vsak uvedená rovnica, ktorá sa priblizne so 75 % pravdepodobnosťou dá pouziť pri predpovediach rastu C. maltosa YP1 v čerstvých jogurtoch s ochrannou kultúrou. Zvysovanie teploty skracovalo lag-fázu podľa vzťahu:

λ = 984,46.T ^-1,6331  R²(λ) = 0,7518

Rovnice získané sekundárnym modelovaním sa dali vyuziť pri predikcii doby, kedy by (pri určitej teplote) dosiahla C. maltosa YP1 v jogurte s ochrannou kultúrou počty 1.10⁶ KTJ.ml^-1. Závery týchto predpovedí sú v závislosti od počiatočnej koncentrácie kvasinky zhrnuté v tabuľke 24.

Z výsledkov vyplynulo, ze uz pri najnizsej počiatočnej koncentrácii kvasinky N₀ = 1 KTJ. ml^-1 v jogurte a pri teplote 6 °C, by sa koncentrácia 1.10⁶ KTJ. ml^-1 dosiahla po 25 dňoch. Pri teplote 8 °C, ktorá je výrobcom odporúčaná ako maximálna teplota pri výrobe a manipulácii s produktom, by sa táto doba este skrátila o 8 dní (t. j. 17 dní). To znamená, ze pri dobe trvanlivosti jogurtov 30 dní, by ani jedna teplota neuchránila kontaminovaný jogurt dostatočne dlhú dobu pred nárastom kvasinky nad limit určený Potravinovým kódexom SR (10² KTJ. ml^-1) a ani pred nepríjemnými zmenami senzorickej a hygienickej kvality. Uvedené predikcie sú porovnateľné s prognózami publikovanými v práci (Lauková a Valík, 2004).

V tabuľke 25 sú sumarizované predpovede časov, kedy by C. maltosa YP1 dosiahla počet 1.10⁶ KTJ. ml^-1 v produktoch s prídavkom ochrannej kultúry aj bez tohto prídavku pri jej počiatočnej koncentrácii N₀ = 1 KTJ. ml^-1 a pri teplotách uchovávania 6, 8, 12, 18 a 21 1°C. Napríklad pri teplote 6 °C sa čas, kedy by C. maltosa YP1 spôsobila zreteľné kazenie jogurtu predĺzil o 8 dní, zo 17 az na 25 dní v jogurte s aplikovanou ochrannou kultúrou v porovnaní bez ochrannej kultúry. Ako vsak uz bolo spomínané vyssie, ani táto doba nie je postačujúca. Pri teplote 8 °C sa čas kazenia v "chránenom" jogurte predĺzil z 13 dní na 17 dní, teda uz len o 4 dni a pri ďalsích teplotách uz nedoslo k výraznejsím zmenám oproti predoslému pokusu s jogurtom bez ochrannej kultúry.

So zreteľom na uvedené predikcie a rastové parametre mozno konstatovať, ze ochranná kultúra bola účinnejsia skôr pri nizsích teplotách. Tento fakt poukazuje na dôlezitosť dodrziavania zásad správnej výrobnej praxe, podľa ktorých by teplota pri výrobe a skladovaní jogurtov nemala prekročiť 8 °C. Predĺzenie lag-fázy pri tejto teplote z potravinárskeho hľadiska znamená súčasne predĺzenie trvanlivosti a mikrobiálnej stability potraviny.

Predikcie času potrebného pre dosiahnutie limitu 1.10⁶ KTJ.ml^-1 a závislosti rastovej rýchlosti C. maltosa YP1 od teploty uchovávania jogurtov boli podrobené validácii s vyuzitím validačného indexu-diskrepancie vyjadrenej v percentách. Výsledky validácie sú uvedené v tabuľke 26.

So zreteľom na uvedené predikcie a rastové parametre mozno konstatovať, ze komerčná ochranná kultúra bola účinnejsia skôr pri nízkych teplotách. Nakoľko sú jogurtové krémy vhodným substrátom pre rast a rozmnozovanie oxidatívnych kvasiniek, prídavky kmeňa L. rhamnosus VT1 nedokázali v koncentráciách v súčasnosti aplikovateľných v mliekarenskej praxi spomaliť resp. zamedziť rozmnozovaniu C. maltosa YP1. Účinnosť kmeňa L. rhamnosus VT1 voči kontaminantu C. maltosa bola zaznamenaná az pri vyssom prídavku (10 %). Tento fakt poukazuje na dôlezitosť dodrziavania zásad správnej výrobnej praxe a zároveň je zrejmé, ze ochranná kultúra nevyvázi nedokonalú hygienu a sanitáciu. Candida maltosa YP1 je prílis odolným a silným kontaminantom a jej vniknutiu do výroby jogurtov by bolo lepsie zabrániť.

Dynamika rastu Listeria monocytogenes v mliečnom zivnom prostredí inokulovanom čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 16°C, 20°C, 25°C, 30°C ± 0,5 °C

Na blizsiu charakteristiku kmeňa L. monocytogenes sa vykonali skladovacie testy aj pri vyssích teplotách. Dynamika rastu čistej kultúry L. monocytogenes sa sledovala v modelovom mliečnom zivnom prostredí pri teplotách zrenia mäkkých syrov (16°C, 20°C, 25°C ± 0,5 °C) ako aj pri teplote optimálnej pre jej rast (30°C, 35°C a 40°C ± 0,5 °C) ako aj pre rast L. rhamnosus VT1. Získané rastové krivky sú zobrazené na obr. 38, 39, 40, 41 a 42. So zvysujúcou sa teplotou skladovania sa rastová rýchlosť zvysovala a trvanie lag fázy sa skracovalo. Získané rastové parametre pre súbeznú kultiváciu L. monocytogenes a L. rhamnosus VT1 sú uvedené v tabuľke 27, 28, 29 a 30 a rastové parametre čistej kultúry L. monocytogenes v UHT mlieku pri uvedených teplotách sú v tabuľke 31. Z rastových parametrov čistej kultúry L. monocytogenes v UHT mlieku vyplýva, ze so zvysujúcou sa teplotou skladovania sa rastová rýchlosť zvysovala a trvanie lag-fázy sa skracovalo. Získané parametre (generačný čas) boli porovnateľné s údajmi publikovanými v literatúre (B. M. Lund, 2000). Rastové parametre L. monocytogenes zo súbeznej kultivácie s L. rhamnosus VT1 pri daných teplotách poukazujú na parciálny inhibičný účinok laktobacilov na listérie a to tak, ze so stúpajúcou koncentráciou laktobacilov, klesala rastová rýchlosť listérií v rámci skladovacej teploty avsak nepozoroval sa ziadny vplyv na trvanie lag-fázy. Na rozdiel od chladiarenských teplôt, pri ktorých zvysujúci sa prídavok L. rhamnosus VT1 významne ovplyvnil rastovú rýchlosť L. monocytogenes, pri teplotách blíziacich sa k optimálnej teplote pre rast oboch kmeňov baktérií bol vplyv na rastovú rýchlosť nevýznamný, najmä pri nízkych koncentráciách laktobacilov. Pri teplotách od 20°C do 30°C bol pozorovaný dvojfázový inhibičný účinok laktobacilov, t.j. primárnym modelovaním sa nedosiahli klasické sigmoidné rastové krivky, ale dvojité sigmoidné krivky, charakterizované dvoma lag-fázami (l1 a l2) a dvoma exponenciálnymi časťami, charakterizované svojou rastovou rýchlosťou (m1 a m2). Získané údaje sú uvedené v tabuľke 28, 29 a 30. Z rastových kriviek vyplýva, ze rastová rýchlosť v prvej exponenciálnej časti krivky bola pri vsetkých prídavkoch laktobacilov takmer rovnaká a prvá stacionárna fáza sa dostavila po 8 hodinách inkubácie, potom prisla druhá lag-fáza, ktorá v priemere trvala 2 h a druhá exponenciálna časť krivky s druhou rastovou rýchlosťou, ktorá bola znízená v priemere od 70 % do 85%. Tieto nie typické sigmoidné krivky opisujú pozitívny vplyv teploty a antagonistický vplyv laktobacilov na rast listérií tak, ze počas prvých 8 hodín nie je významne ovplyvnené pH prostredia. Vyssia teplota a vyssie pH podporujú rast listérií v prvých hodinách kultivácie. Po 8 hodinách sa hodnota pH začala významnejsie znizovať a zvysovať sa počet laktobacilov, avsak hodnota pH prostredia bola stále vhodná pre rast listérií. Inhibičný účinok na listérie nastúpili v druhej fáze, kedy produkcia kyselín a iných antimikrobiálne pôsobiacich látok produkovaných laktobacilmi ovplyvnili významne rastovú rýchlosť listérií. Inhibičný účinok laktobacilov sa pri optimálnych teplotách prejavil v tom, ze konečná úroveň populácie listérií bola významne redukovaná za 2/3 kratsí čas, napr. pri teplote 16°C populácia listérií vzrástla o 7 log poriadkov za 77 h, avsak uz pri 2,5% prídavku laktobacilov populácia listérií sa zvýsila len o 1 log poriadok za 29 h. Uvedené zistenia sú porovnateľné s údajmi v literatúre (Issa a Ryser, 2000, Pitt a kol., 2000, Gulmez a Guven, 2003). Zo získaných výsledkov vyplynulo, ze pri teplotách, kedy prebieha primárne a sekundárne zrenie mäkkých syrov, nastupuje inhibičný účinok L. rhamnosus VT1 az v neskorsích fázach zrenia. Dôlezité je preto dodrzanie vysokej hygieny pri výrobe, aby kontaminácia surového mlieka bola čo najnizsia, ďalej je nutnosť pouziť také zákysové a startovacie mliekárenské kultúry, ktoré rýchlo znízia hodnotu pH mlieka a L. rhamnosus VT1 by v tomto prípade mohol slúziť ako ochranná kultúra s neskorsím nástupom antimikrobiálneho účinku, keďze ide o nie významne kyselinotvorný kmeň laktobacilov. Sekundárnemu modelovaniu bol z hľadiska významnosti podrobená len rastová rýchlosť L. monocytogenes. Získaná lineárna závislosť rastovej rýchlosti čistej kultúry L. monocytogenes (B) od teploty skladovania v UHT mlieku je graficky aj s príslusnou rovnicou znázornená na obr. 43. Závislosť rastovej rýchlosti L. monocytogenes (B) od objemového prídavku L. rhamnosus VT1 a teploty skladovania je uvedená na obr. 44. ako aj ich príslusné matematické vyjadrenia. Z uvedeného obrázku vyplýva, ze rastová rýchlosť bola významne ovplyvnená teplotou skladovania. Nakoľko jednoduché sigmoidné krivky boli pozorované do teploty 16°C, sekundárne modelovanie sa dalo urobiť len pre uvedené chladiarenské teploty.

Ďalsia časť práce smerovala k aplikácii L. rhamnosus VT1 do mäkkých syrov a charakteristika rastu L. monocytogenes v reálnej potravinovej matrici. Výsledky získané z reálnej potraviny sa porovnali z výsledkami získanými v modelovom prostredí, na základe ktorých bolo mozné definovať predpovede počtov patogénnej baktérie L. monocytogenes v závislosti od skladovacej teploty. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 33 a 34.

Dynamika rastu Listeria monocytogenes v syre inokulovanom čistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus VT1 pri teplote 8°C a 10°C ± 0,5 °C

Na sledovanie dynamiku rastu L. monocytogenes v potravine sa ako modelová potravina zvolil parený mäkký nezrejúci syr typu Mozarrella, ktorý sa pôvodne vyrábal z nepasterizovaného mlieka. Surové mlieko sa v mnohých prípadoch stalo práve zdrojom kontaminácie L. monocytogenes mliečnych výrobkov, najmä syrov. Keďze ide o mäkký nezrejúci syr, jeho hodnota pH je pomerne vysoká (pH=6,0), čo je jedným z priaznivých faktorov pre rozvoj patogénnej mikroflóry v syroch.

Primárne modelovanie L. monocytogenes sa sledovalo v zámerne inokulovanom syre s prídavkom 1% L. rhamnosus VT1, čo by odpovedalo priemyselne pridávanému mnozstvu ochrannej kultúry mliečnych baktérií. Teplota skladovania tohto typu syra je od 4°C do 8°C a trvanlivosť je 28 dní. Keďze najnizsia teplota pre rast L. rhamnosus VT1 bola stanovená 8°C, skladovací pokus sa vykonal pri teplotách 8°C a 10°C. Získané rastové krivky sú uvedené na obr. 45 a 46. Rastové krivky sa podrobili matematickej analýze pomocou D-modelu a získané rastové parametre sú uvedené v tabuľke 32. Z uvedených parametrov vyplynulo, ze rastová rýchlosť L. monocytogenes pri teplote 8°C a prídavku 1% L. rhamnosus VT1 sa znízila o 20% a konečný počet viabilných buniek sa znízil o 0,7 log poriadku. Pri teplote 10°C bol pokles rastovej rýchlosti este výraznejsí, rastová rýchlosť sa znízila o 46% a počet viabilných buniek listérií klesol na konci skladovania o 1,75 log poriadku. Na základe získaných rastových parametrov bolo mozné vypočítať predikcie počtov L. monocytogenes na konci doby trvanlivosti, ako aj čas potrebný na to, aby konečný počet L. monocytogenes bol 100 KTJ.g^-1, ak by vzorka bola kontaminovaná jednou bunkou. Rastová rýchlosť listérie bola priveľmi vysoká a predikcie jej počtov na konci doby trvanlivosti dosahovali poriadkovo viac ako milión buniek v jednom grame výrobku.

Hoci Potravinový kódex SR udáva limit pre prítomnosť L. monocytogenes v pre mliečnych (mliečne nápoje, koktaily, mliečne pudingy a krémy, smotanové krémy, tvrdé, polotvrdé parené syry, plesňové syry, mäkké syry) ako aj v iných výrobkoch - neprítomnosť v 25g vzorky. Niektoré státy povoľujú maximálne mnozstvo L. monocytogenes 110 KTL.g^-1 u vybraných komodít (surové mäso, mleté mäso, mäso na spracovania). [European regulations: Directive 94/65/CE du Conseil, 1994 a Italian regulations: DPR n. 309/1998, OM 7.12.1993] Nakoľko L. monocytogenes je tak závazný, hoci sporadicky sa vyskytujúci patogén, pouzitie ochranných kultúr je jedným z mozných spôsobov zvýsenia zdravotnej bezpečnosti potravín a znízenia moznosti rizika ochorenia, listeriózy.

Prehľad o pouzití a čerpaní prostriedkov státneho rozpočtu v jednotlivých rozpočtových rokoch riesenia úlohy:

Stav splnenia stanovených cieľov úlohy (cieľov uvedených v bode 2. správy):

Vyhodnotenie cieľov státneho podprogramu za rok 2002:

ČÚ 06 - stanovené ciele sú splnené a konvergujú k cieľu č. 2/2002

Vyhodnotenie cieľov státneho podprogramu za rok 2003:

ČÚ 06 - stanovené ciele sú splnené a konvergujú k cieľu č. 1/2003

Vyhodnotenie cieľov státneho podprogramu za rok 2004:

ČÚ 06 - stanovené ciele sú splnené a konvergujú k cieľu č. 4/2004

Vyhodnotenie cieľov státneho podprogramu za rok 2005:

ČÚ 06 - stanovené ciele sú naplnené a konvergujú k cieľu č. 1/2005 a čiastočne aj k 4/2005

Ciele z úlohy výskumu a vývoja:

r. 2002

r. 2003

r. 2004

r. 2005

Zdôvodnenie:

Výsledky, získané v r. 2003 boli len parciálne a neboli postačujúce na publikáciu v CC. Parciálne výsledky boli publikované priebezne v kazdom roku riesenia na rôznych konferenciách a seminároch ako aj časopisoch neabstrahovaných v CC. Preto v poslednom roku riesenia (2005) budú zaslané 2 publikácie do časopisu abstrahovanom v CC za celú dobu riesenia.

Uviesť spôsob vysporiadania vlastníckych vzťahov k výsledkom riesenia úlohy:

Vlastnícke práva k výsledkom predmetu zmluvy na dodanie a financovanie parciálneho riesenia úlohy výskumu a vývoja v rámci státnych programov výskumu a vývoja a spôsob ich ochrany je upresnený v Článku 7 Zmluvy č. 525/2005, Zmluvy č. 525/2004, Zmluvy č. 525/2003

Uviesť, kedy bola uzatvorená zmluva o vyuzití výsledkov riesenia úlohy medzi

Zmluva s realizátorom nebola uzatvorená.

Úroveň zabezpečenia realizácie výsledkov riesenia:

I.Hmotné realizačné výstupy

II.Nehmotné realizačné výstupy

publikované výsledky:

Lauková D., Valík Ľ., Görner F.: Rast Candida maltosa YP1 v kyslomliečnych produktoch jogurtového typu. In.: Zborník zo seminára Mléko a Sýry 2004. Praha, 2004, Česká republika, s. 70-75, ISBN 978-80-86238-42-5.

Petríková J., Lauková D., Koreňová J., Valík Ľ.: Dynamika rastu Bacillus cereus v pasterizovanom mlieku so 7 dňovou dobou trvanlivosti. In.: Zborník zo seminára Mléko a Sýry 2004. Praha, 2004, Česká republika, s. 163-167, ISBN 978-80-86238-42-5.

Lauková D., Valík Ľ., Görner F.: Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth of yeast Candida maltosa YP1. In.: Book of Abstracts from 4^th IDF Symposium on cheese ripening, characterization and technology. Praha, 2004, Česká republika, s. 113, ISBN 80-86257-35-5.

Lauková D., Valík Ľ., Görner F., Petríková J.: Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth dynamics of Candida maltosa YP1. Proceedings of CEFood Congress, Budapesť, 2004, Maďarsko, s. 218.

Petríková J., Lauková D., Valík Ľ., Görner F.: Content of Bacillus cereus in pasteurised milk. Proceedings of CEFood Congress, Budapesť, 2004, Maďarsko, s. 224.

Lauková D., Valík Ľ., Görner F., Petríková J.: Kvantitatívna analýza vplyvu Lactobacillus rhamnosus VT1 na dynamiku rastu Candida maltosa YP1. Abstrakty z 23. Kongresu Československej spoločnosti mikrobiologickej, Brno, 2004, Česká republika, s. 211.

Petríková J., Valík Ľ., Lauková D.: Kvantitatívna analýza vplyvu Lactobacillus rhamnosus VT1 na dynamiku rastu Listeria monocytogenes. Abstrakty z 23. Kongresu Československej spoločnosti mikrobiologickej, Brno, 2004, Česká republika, s. 89.

Lauková D., Valík Ľ.: Matematické modelovanie vplyvu teploty na dynamiku rastu Candida maltosa YP1 v jogurtových krémoch. Bulletin potravinárskeho výskumu, 43, 2004, 1-2, s. 89-99.

Lauková D., Valík Ľ., Koreňová J., Petríková J.: Dynamika rastu Bacillus cereus

v mliečnom zivnom prostredí. Zborník príspevkov z konferencie s medzinárodnou účasťou Výziva-Potraviny-Legislatíva. Detva, 2004, Slovenská republika, s. 354-358.

Valík Ľ., Petríková J., Lauková D., Koreňová J.: Growth prediction of Bacillus cereus and shelf-life of pasteurised milk. Proceedings of 3^th Croatian Congress of Microbiology with international participation. Poreč, 2004, Croatia, s. 23.

Valík Ľ., Lauková D., Polka P., Bajúsová B.: Kvantitatívna analýza potenciálneho antimikrobiálneho pôsobenia Lactobacillus rhamnosus VT1 v mlieku. Zborník zo seminára Mléko a Sýry 2005, Praha, 2005, s. 68-72.

Petríková J., Valík Ľ., Lauková D.: Vplyv Lactobacillus rhamnosus VT1 a teploty na dynamiku rastu Listeria monocytogenes 272. Zborník zo seminára Mléko a Sýry 2005, Praha 2005, s. 73 - 77.

Koreňová J., Lauková D., Valík Ľ., Petríková J.: Vplyv Lactobacillus rhamnosus VT1 a teploty na dynamiku rastu Bacillus cereus. Zborník zo seminára Mléko a Sýry 2005, Praha 2005, s. 135-139.

Lauková D., Valík Ľ., Koreňová J., Görner F.: Matematická analýza vplyvu Lactobacillus rhamnosus VT1 a teploty na rast Bacillus cereus. Bulletin potravinárskeho výskumu, 44, 2005, 1-2, s. 63-73.

Valík Ľ., Petríková J., Liptáková D., Koreňová J., Görner F.: Hodnotenie expozície Bacillus cereus pri konzumácii pasterizovaného mlieka. Mikrobiologie potravin 2005, Československá spoločnosť mikrobiologická, Třesť, 2005, v tlači

Liptáková D.: Probiotiká pre nase zdravie. Výziva a zdravie, 49 (2), 2005, s. 8-9.

Valík, Ľ., Liptáková, D., Polka, P., Koreňová, J., Bajusová, B., Görner F.: Kvantitatívna potravinárska mikrobiológia a predikcia rastu mikroorganizmov. Zborník prednások zo 7. zjazdu Slovenskej spoločnosti pre poľnohospodárske, lesnícke, potravinárske a veterinárne vedy pri SAV, Bratislava, 2005, s. 119 - 122.

Liptáková, D., Valík, Ľ., Lauková, D., Görner, F.: Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 on the growth of Candida maltosa. Czech Journal of Food Sciences. November 2005 zaslaný do časopisu

Petríková, J., Bertaová, G., Valík, Ľ., Liptáková, D.: Effect of temperature and Lactobacillus rhamnosus VT1 on Listeria monocytogenes growth in milk. Czech Journal of Food Sciences. November 2005 zaslaný do časopisu

Prílohy:  - obrázky č. 1 - 46

tabuľky 1 - 34

kópie publikácii