MATERIALI E METODI
CEPPI E MEZZI DI CRESCITA
Ceppi: il ceppo di Trichoderma atroviride usato in questo lavoro č stato il P1 (ATCC = American Type Culture Collection 74058), selezionato in Scozia per la sua attivitā di biocontrollo nei confronti di alcuni funghi patogeni e per la resistenza a fungicidi quali iprodione e vinclozolin ( Tronsmo, 1991). La temperatura ottimale per il suo sviluppo č di 24o C ( Tronsmo, 1991). 333k1010d
Sono stati usati, inoltre, ceppi di Botrytis cinerea, isolata da tabacco, provenienti dalla micoteca del Dipartimento di Arboricoltura, Botanica e Patologia vegetale della Facoltā di Agraria dell'Universitā degli studi di Napoli. In particolare, sono stati utilizzati sia ceppi wild type (B05 10, derivante dal ceppo SAS 56, a basso contenuto di DNA) del fungo sia alcuni trasformanti, privi dei trasportatori ABC:
T 40 = D Bcatr A = gene Bcatr A disattivato
T 32 = D Cut A = reca una copia interrotta del gene Cut A
BAB 051 = D Bcatr B = reca una copia interrotta del gene Bcatr B
Per quanto riguarda Fusarium proliferatum sono stati usati gli isolati 3273 e 3272, produttori di Beauvericina, e l'isolato 3869, non produttore della micotossina, forniti dall'Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari di Bari.
Substrati utilizzati: per la crescita ed il mantenimento dei funghi patogeni e dei trasformanti di T. atroviride č stato utilizzato estratto di patata agarizzato (PDA Himena). Per i saggi in vivo ed in vitro sono stati usati estratto di patata (PDB Sigma) ed un mezzo salino liquido (SM, salt medium), di cui č di seguito riportata la composizione:
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Sali |
Quantitā |
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KH2PO4 |
680 mg/l |
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K2HPO4 |
870 mg/l |
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KCl |
200 mg/l |
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NH4NO3 |
1 g/l |
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FeSO4 |
2 mg/l |
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ZnSO4 |
2 mg/l |
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MnSO4 |
2 mg/l |
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CaCl2 |
200 mg/l |
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MgSO4 |
200 mg/l |
Per i saggi in piastre Petri sono stati usati lo stesso mezzo salino ma agarizzato (1,5%) e water-agar (1,5%).
Prima dell'utilizzo, tutti i substrati sono stati sterilizzati in autoclave a 121°C per 20 minuti.
SAGGI IN PIASTRA
Valutazione della capacitā antagonistica di Trichoderma in presenza di Beauvericina
In questo studio č stata testata la capacitā di crescita di Botrytis (w.t. e trasformanti) e T. atroviride (P1) su un substrato contenente Beauvericina e l'effetto della micotossina sull'attivitā antagonistica di Trichoderma nei confronti di Botrytis.
Sono state preparate piastre Petri (da 100 mm) con 15 ml di SM 1X agarizzato a cui č stato addizionato:
saccarosio 1% (controllo)
saccarosio 1% + 75 ml di metanolo
saccarosio 1% + 150 ml di metanolo
saccarosio 1% + Beauvericina (Sigma) 5 ppm
saccarosio 1 % +Beauvericina 10 ppm
Sulle piastre sono stati inoculati, a circa 3 cm di distanza, 15 ml di spore di Botrytis (w.t. e i tre trasformanti) concentrate 106 spore/ml e 15 ml di spore di P1 della stessa concentrazione, adattando i tempi di inoculo alle diverse velocitā di crescita (Trichoderma č stato inoculato 3 giorni dopo Botrytis). Le piastre inoculate sono state incubate a 25° C, al buio.
Saggio di competizione tra Trichoderma e Fusarium proliferatum
Per questo saggio sono state preparate piastre Petri (da 100 mm) di Sm 1X a cui e' stato addizionato saccarosio 1%
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