Крім хромосомальної

Крім хромосомальної ДНК в клітинах бактерій додатково можуть існувати факультативні генетичні елементи - епісоми та плазміди (мініхромосоми колись називали - за структурою майже схожі), кількість яки 646f522g ;х може бути від нуля до 3-4, максимум 11 відомо. Копійність кожної з останніх варіює від одної до кількасот і є сталою контрольованою величиною в кожному окремому випадку.

інтегрований стан.

Загалом їх розділяють на 3 типи: R-плазміди, коліцинові, F-фактори. Всі типи детально досліджено .

R-плазміди - завжди несуть гени (один чи більше), що кодують білки, інактивуючі антибіотики.

надбає її шляхом випадкової трансформації - теж стане стійкою до коліцину.

F-фактори є специфічним типом мобільних елементів - вони облігатно кон'югативні і кодують як сигнали кон'югації в ДНК, так і гени, що забезпечують процес формування пілів та транспорт ДНК через цей місток (детально буде далі).

Розміри від 1,5-40 кб для грампозитивних, і аж до 150-220 кб для грамнегативних (однак мегаплазміди завбільшки 40кб і більше - досить випадкове явище і є тільки у агробактерій, псевдомонас, та ще у кількох екзотичних нечислених видів). Дуже цікавими виявилися величезні плазміди 90-150-200 тис пар основ - у агробактерій і Rizobium (гени NIF, транспозони). Ці плазміди почали використовувати генні інженери рослин.

Плазміди кодують гени білків і інколи гени антисенсових РНК, які регулюють їхню реплікацію. Кількість кодуючих рамок - відповідно розмірам - від одної до 300 (найбільший відомий вірус кодує не більше сотні). Ці білки в основному, за деяки 646f522g ;ми виключеннями не є homekeeping гени для бактерії. Найчастіше це R-гени, це nif-гени (nitrogen fixation), гени коліцинів і інших токсинів (холерний токсин та токсин колійної диареї телят), гени факторів інвазивности - білки пілів. Великі плазміди можуть кодувати що завгодно - від ендонуклеаз рестрикції, факторів системи репарації ДНК, гени утилізації токсичних субстранів (толуол, бензол). У молочних стрептококів є плазміда що кодує ензим ферментації молока - для сировиробництва важливі. Але все одно вони практично факультативні для хазяїв.

Значна частина плазмід містять транспозони які обмежені оберненими повторами (плазміда RP4 - Tn3 з геном bla- стійкість до пеніциллінів, плазміда R1 - містить 4 різні R-гени стійкості до різних антибіотиків і сульфоніламідів), і структура послідовностей, які фланкуюють ці гени(IS-insertion sequences), вказують на транспозонове перенесення їх в плазмідну ДНК. Деякі плазмідні транспозони кодують транспозазу і є істними транспозонами. При детальному аналізуванні сиквенсу плазмід та їх генетичної структури можна стверджувати, що більшість плазмід складені з окремих модулів - ділянок різних плазмід, фрагментів бактеріальних хромосом, шматків геномів фагів та транспозонів. Ці модулі відокремлено IS, або консенсусами - слідовими залишками від IS, те що від них залишилося через трильйони раундів реплікації і мільярди генерацій клітин хазяїв. Тобто за науковою гіпотезою плазміди - це продукт природніх рекомбінацій та роботи транспозонів. Деякі надто складні і великі плазміди здатні природньо спонтанно розпадатися на 3 складових елементи, які потім знову якось коінтегрують (плазміда RTF з хазяїв-видів Salmonella та Proteus mirabilis - практично самотрансміссивна (подібно F-фактору), хоча віднесли її до R-плазмід). При розпаді великої плазміди -100 кілобаз утворює більшу RFT 70 кілобаз - утримує гени трансмісивності (див нижче) та меньшу - 30 кілобаз - r-елемент, що несе гени стійкості до антибіотиків.

Але короткий історичний ракурс зробити варто. Накопичувалися знання з молекулярної біології інших плазмід, а саме R-типу (Resistance -стійкість до антибіотиків, коліцинів їх багато і вони є у різних видів і родів бактерій розміри від 2-50 000 т п о) Деякі з таких теж здатні інтегрувати, але вже без допомоги recA, а завдяки 646f522g ; IS елементам, за рахунок транспозонів - містять інвертовані повтори, які обмежують ген транспозази - ендонуклеаза). Вважають, що плазміди надбали R-гени завдяки 646f522g ; транспозонам.

Ці знання згодом (70-і роки) привели до виникнення ідей створенння штучних конструкцій типу епісомальних елементів - плазмід для спрямованого переносу певного генетичного матеріалу в клітини бактерій. Така можливість маніпулювання генетичними послідовностями з´явилася незабаром - після розробок в області ензимології ендонуклеаз рестрикції бактерій та лігаз з фагів. Тобто навчилися чистити ферменти і оптимізували ферментативну активність цих білків in vitro. З цього момента почалася ера рекомбінантних ДНК. Можливості в цій області зростали в основному пропорційно відкриттям і розробкам у сфері :

Питання - Чому деякі можуть бути епісомами а інші - ні (плазміда і епісома - не один і той термін, не синонім. Більшість науковців схильні, що швидше плазміда - більш широке поняття, а епісома - випадок інтегруючої плазміди). Всі F-фактори є епісоми, деякі R можуть інтегрувати - епісоми. Коліцинові дуже рідко інтегрують. Частіше інтеграція за рахунок IS (insertion sequence-елементарний найпростіший транспозон) послідовностей - їх може бути 2-3 в 1 плазміді. Довжина цих IS-від 700-1500 пар. Якщо в хромосомі є відповідні, відносно гомологічні до флангів IS-елементу ділянки, то інтеграція може відбутися.

спонтанний процес, випадковий, трапляється в звичайних природніх умовах рідко -10 в мінус 6-7 ступені. Якщо плазміда знаходить в новому хазяїні відповідні умови для існування та реплікації (реплікон працює - сигнали реплікації її ДНК) - вона пропагується далі і зберігається, особливо якщо ї гени надають селективні переваги для хазяїна - бактерії. Назвали це трансформацією. Ефективно трансформуються лише компетентні для цього клітини - молоді. Генні інженери мало не щодня ставлять штучну трансформацію - хімічний, осмотичний щок..Це підвищує ефективність на 7-9 порядків. Корифей генної інженерії Томас Маніатіс спочатку працював шляхом природньої трансформації, лише підвищив концентрацію плазмідної ДНК та клітин мксимально і в такий спосіб підняв ефективність на 3-4 порядки. Але лише в 1970 році експериментально встановили, що клітини, відмиті розчином солі Са, або в присутності високої концентрації цих іонів поглинають ДНК з високою ефективністю і трансформуються. Особливо кільцеві та суперскручені форми плазмід, навіть повнорозмірну інтактну хромосому E coli інколи вдається трансформувати. Лінійні фрагменти поглиналися гірше (теж трансформація фрагментованими двонитьовими ДНК підпадає під поняття трансформації). При звичайні трансформації клітина ковтає двонитьову ДНК кільцеву релаксовану (нікована), чи суперспіралізовану кільцеву, чи лінійну цілою, чатсіше навіть конгломерати з кількох молекул солі Са+ДНК. В середині клітин ніки та розриви репаруються і гірази закручують і компактизують її. Які уяви про молекулярні механізми трансформації? Високі концентрації кальцію та осмотичний шок викликають зміни на рівні експресії бактеріальних генів - підвищується репеаративна активність ДНК-полімераз, рекомбіназ, метилювання ДНК і це яки 646f522g ;мось чином сприяє виживанню екзогенної ДНК. Так з'явилося поняття "приготувати компетентні клітини" (в 99,9% випадків тут мова йде про E coli). Зараз крім CaCl -компетентних є кілька інщих методів (осмотичний шок ПЕГ, гліцерином з одновалентними іонами .). Можливість отримувати компетентні E coli з ефективністю 10 в 6-8 ступені - це була одна з передумов революції в геній інженерії. Потім з'ясували що цей принцип отримання компетентних клітин працює практично для всіх грамнегативних та грампозитивних бактерій. Однак деякі бактерії групи етеробактерій трансформуються великою дозою плазмідноі ДНК без спеціальної обробки з ефективністю 10 в 4-6 ступені на мікрограм ДНК. Деякі види мікробів є проблемними для трансформації (штучної) - наприклад Streptomyces (біотехнологічні роботи з продуцентів антибіотикив). Такі для трансформації "роздягають" лізоцимом - отримують сферопласти і ці трансформуються з відносно прийнятною ефективністю. Потім відмили від дізоциму і ті відновлять клітинну оболонку.

Головний елемент - Реплікони плазмід - сигнали ori-сигнал для праймази (РНК-полімераза), точка старту для ДНК-полімераз клітини і виступає на рівні сумарного клітинного геному як окремий реплікон. Довжина 350-800 нп, Col E1, рМВ1 -600 пар. Буває більше 1 кілобази.

Спектр бактерій хазяїв для різних ori - є такі, що працюють в широкому спектрі бактерій - наприклад реплікони RP та RK працюють для всіх грамнегативних бактерій, і плазміди з ними можуть ампліфікуватися в Ecoli і агробактеріях. Реплікон Сol E1 - для широкого сімейства ентеробактерій, pMB1- суворо для для Ecoli. Чому це так. Векторна рекомбінантна плазміда повинна ефективно реплікуватися, інакше ампліфікуватися в клітинах хазяїна, і існують системи регуляції реплікації для кожного ori, які мають забезпечувати достатню копійність вектору в клітинах хазяїна. Є низькокопійні або з контрольованим рівнем копійности, тоді популяція (пул) бактерій в бульйоні гомогенна по копійності плазміди (BR322 - 20-30). Є висококопійні, або з релаксованим контролем копійности (pUC19 - 100-200). Супервисока надлишкова копійність (1000) тільки в специфічних штучних хімічних умовах - хлорамфенікол (блок синтезу регуляторного білку на рівні трансляції і відміна контролю копійності - навіть для BR322 можливо).

Механізм регуляції реплікації плазмідних ДНК

Механізм регуляції реплікації плазмідних ДНК з репліконами родин  ColE1  та  incFII відбувається через взаємодію двох РНК-транскриптів. Іниціація синтезу одного з цих транскриптів (РНК II) починається на відстані 555 н.о. від точки початку реплікації ori. В цьому районі РНК II гибридизується/дегібридизується зі своєю ДНК-матрицею і розщеплюється місцями РНКазою Н (в точці початку реплікації залишаються шматочки 5-8 нт). Фрагмент розщепленої РНК виступає затравкою для ДНК-полімерази I, яка синтезує новий ланцюг ДНК. Друга РНК довжиною 108 основ (РНК I) транскрибується з протилежної нитки ДНК в області, що кодує 5'-кінець РНК II. Комплементарне зв'язування РНК I та РНК II перешкоджає гибридизації останньої з ДНК-матрицею (зтягує її з власної матриці ще до розщеплення РНК-азою Н), блокуючи таким чином формування РНК-затравки для ДНК-полімерази. Ефективність блокування залежить від швидкості гибридизації РНК I з РНК II, яка повинна статися раніше, ніж спрацює РНК-аза Н і згибридизуються шматочки РНК II та ДНК. Швидкість зв'язування двох РНК регулюється вторинною структурою взаємодіючих молекул та білком Rom, що їх стабілізує. Аналіз вторинної структури послідовності РНК I і РНК II виявив в них обох три паліндроми, які утворюють три шпильки. Згідно з запропонованою моделлю взаємодія між молекулами РНК І і РНК II відбувається спочатку в районі відкритих петель відповідних паліндромів (DNA kissing), що забезпечує наступне просторове зближення 5'-кінця РНК I з РНК II і утворення гибриду довжиною 108 п.о. за принципом "застібки-блискавки". Білок  Rom (або інколи звуть Rop- repressor of melting/priming), яки 646f522g ;й сприяє утворенню гибриду в клітинах, кодується ділянкою плазміди!, що знаходиться між 402 та 708 н.о. в 3'-напрямку від точки ініциації реплікації. Отже, синтез мРНК білку активується реплікацією ДНК, білок Rоm прискорює гибридизацію РНК I та РНК II, що призводить до блокування реплікації плазміди і обмеження її копій у клітині. Тут треба уявляти динамічність та конкуренцію трьох-чотирьох молекулярних процесів, порогові діючі концентранції, кінетику..

Регуляція ініціації реплікації плазмід за участю низькомолекулярних РНК у прокаріот є розповсюдженим механізмом. Такий спосіб регуляції є загальновизнаним також для плазмід родин RI, F та NRI бактерій Е соli, рТ181 бактерій Staphiloc.аureus. Причому наслідки асРНК регуляції реплікації та копійності плазмід RI та F є фатальними для E coli. Тут асРНК (ген sok) довжиною 180 н.о. блокує мРНК гену mok. А білок Mok позитивно регулює трансляцію мРНК гену hok, білковий продукт якого є летальним токсином для E coli. У разі недостатньої копійності плазміди синтезується багато білку Нok, від якого бактерія загине. Якщо копійність плазміди та її гену sok вище необхідного порогу, sok блокують трансляцію mok і трансляція мРНК hok не активується, тому що гибрид перших двох (асРНК:мРНК) руйнується у клітині РНКазою ІІІ.

Якщо трансформувати в одну клітину бактерії 2 плазміди з репліконами одного типу, навіть дуже схожі, вони не можуть співіснувати в одній клітині бактерій довго. Це інколи називають імунністю - ?.конкуренція на фоні регуляції копійності .

Отже, головна методологічна база штучних генетично-трансферних процесів між клітинами бактерій з допомогою плазмідних репліконів - це є трансформація, яка має неперевершене значення для генної інженерії. Однак не варто забувати і про електропорацію бактеріальних клітин плазмідною ДНК, яка набагато ефективніше і простіше методично..

В життєвому циклі бактерій відсутній процес формування гамет, гаплоїдних форм, тощо. Дійсно, куди ще скорочувати, якщо віртуально лише одна хромосома - хіба що тільки редукуватися до одноланцюгової форми. Так воно і відбувається.. Є парасексуальний процес - кон'югація - обмін послідовностями ДНК у вигляді однонитьового ланцюга. Кон'югація відбувається з допомогою F-фактору і характерна лише для клітин, які його мають (генотип записують F-). Це епісома, тобто плазміда, яка може інтегрувати - Hfr-(розшифрувати назву). Інтегрує через IS-елемент. Вся епісома у формі двонитьового ланцюга може вбудовуватися без витіснення чи втрати хазяйських послідовностей.

За період 50-70 років 20-го сторіччя значних успіхів в молекулярній біології бактерій досягли завдяки 646f522g ; дослідженю молекулярних механізмів процесу кон'югації бактерій за участю F-епісом (Fertility статевого фактору). Власне тоді ретельно і глибоко вивчили властивості і потенційні можливості природньої трансдукції генів, опосередкованої епісомами F-типу. Ці плазміди несуть в собі елементи IS-типу, які в клітинах бактерій за участю ендонуклеаз-рекомбіназ (recA) забезпечували як інтеграцію в хромосому хазяїна так і вищеплювання з неї. При такій структурі ці F- епісоми існують в трьох формах - кільцева неінтегрована (F-, F+ -відповідно без, та з фрагментом хромосоми, захопленим при інтеграціях попередніх), лінійна неінтегрована однонитьова (під час коньюгації, коли переноситься однонитьові F-послідовності ) і лінійна інтегрована в хромосому (hfr+). Остання може сприяти переходу всієї бактеріальної хромосомі в лінійну форму і, маючи в собі нуклеотидні сигнали транспортування через кон'югаційний місток між клітинами, як паровозик тягне за собою через ту перетинку всю хромосому у вигляді однонитьової ДНК.

Коли генетики навчилися миттєво зупиняти в часі протягування хромосоми в ході кон'югації через канал між клітинами (90 хвилин) і викликати послідовні розриви хромосоми в такий спосіб, це дало змогу побудувати досить детальні генетичні карти локусів хромосоми E coli а потім інших бактерій. В 60-70 роки практикум з молекулярної генетики студента-біолога Cold-Spring Hrbour Univers базувався головним чином на набоірі штамів бактерій F+ F- для кон'югації. Продукти часткової кон'югації у формі рекомбінованих делеційних мутантів аналізували на чашках з дефіцитом того чи іншого компонента -з'ясовували ауксотрофність по амінокислотам, нуклеозидам тощо.

F-фактор існує в клітині бактерій віртуально в однокопійному стані. Тобто співвідношення хромосома:F-фактор= 1:1.

Поруч з IS-елементом в ДНК F-фактору є сайт однонитьового розрізання (нікування - nick-зарубка, надсічка). Останній сайт назвали Т-origin (Т-трансфер). При розрізанні по одному ланцюгу 5'- кінець залишається з'єднаним з ендонуклеазою ковалентно. Епітоп (*конформація на поверхні білку - профіль для взаємодії з іншим білком через іонні та гідрофобні зв'язки ) цієї нуклеази впізнає транспортний білок. Останній і тягне весь комплекс через місток F-піля - в реціпієнтну клітину - "жіночу".

Що в акцепторній клітині відбувається. Якщо в момент кон'югації F був в епісомальному стані без додаткових послідовностей хромосомальних - просто пол бактерії змінюється і переносяться деякі епісомальні F-гени. Якщо F-фактор з інтегрованого стану (Hfr+),- перенесення хромосоми. В донорній клітині відбувається гибридизація з гомологічною ділянкою хромосоми, активація подовження (синтезу) 3'-кінця екзогенного ланцюга (шляхом) за принципом колеса що котиться, потім підрівнюється і лігується розрив (Rec A система сприяє). Тобто ,можлива інтеграція через гомологічну рекомбінацію в хромосому реціпієнта. Буває, що акцепторна клітина вже має інтегровану копію Ф-елементу, тоді теж можлива інтеграція, причому по гомології F-факторів.

Інколи перед кон'югацією відбувається перехід F-фактору з стану Hfr в епісомальний стан з вирізанням частини хромосоми. Це вже F+ генотип, і фактор позначають F+(.). Якщо така F+-епісома перенесеться в донорну клітину, то це називають сексдукцією, або F-дукцією. Сексдукована F+ епісома може замкнутися в кільце і стати епісомою в новій клітині, але частіше тут іде гомологічна інтеграція. Варто зазначити, що інтегративна сексдукція завжди є не заміщуючою інтеграцією, а інсерцією.

Очевидна повна аналогія сексдукції з трансдукуючими фагами, тільки тут не потрібно пакування в віріони, а отже розмір фрагменту для рекомбінаційного перенесення та вбудування не обмежується - пряме перенесення голої ДНК через місток. Отримані клітини називають мерозиготами (ніколи не інтегрує вся донорна хромосома а її частка). Як відбувається інтеграція, чи спочатку добудова 2-го ланцюга і потім інсерція, чи однонитьова форма просто липне на гомологічниу ділянку і до неї пришивається чи переноситься другий ланцюг ДНК реципієнтної клітини - невідомо. Система RecA -швидше за все відповідає.

Ще дещо про переенесення плазмід. Деякі плазміди переносяться не спонтанно, трансформацією, як вище сказав, а закономірно за специфічним механізмом - трансміссивно (кон'югація). Це відбувається між штамами родичів як правило - частково процес детерміновано послідовностями самих плазмід - in cis і частково хромосомними генами. Повна аналогія с сексдукцією, мабуть існував единий анцестор - "бактерія пра-батько" грамнегативних бактерій з епісомою. Закономірне перенесення назвали транскон'югацією, плазміди самотрансміссивними, а нові штами з новою плазмідою - транскон'югантами. Деякі з R-плазмід є трансміссивними, а коліцинові плазміди практично дуже рідко є трансміссивними. Загалом це відомо лише у декількох родів бактерій грамнегативних і плазміди у них гігантські 100-250 кілобаз, тому проста тривіальна спонтанна трансформація через бульон тут маловірогідна - таку молекулу клітина не "проковтне", потрібне прикріплення і активний транспорт.

Одна рідко кон'югативний перенос епісомалнонго генетичног елементу можливий не лише між бактеріями родичами, чи віддаленими видами бактерій. Трансформація клітин коріння рослин агробактеріями, коли переноситься Т-ДНК - фрагмент Ті-плазміди яки 646f522g ;й по суті є транспозоном - це теж транскон'югація. Таке генетично-детерміноване, не випадкове (еволюційно значиме) перенесення генів між клітинами видів різних царств відоме вже для 2 випадків - обидва з грамнегативними бактеріями cімейства Rhizobiacea. Перший - агробактерії - другий вид Rhizobium. Останні здатний трансформувати клітини простіших грибів роду Мікориза (примітивні багатоклітинні еукаріоти).

Але поняття трансформація (генетична) є більш широким поняттям і крім плазмідної ДНК можуть переноситися фрагменти хромосомальної ДНК, які яки 646f522g ;мось певним чином вбудовуються і зберігаються стабільно в поколіннях в складі нової хромосоми. Згадаємо експерименти Гріффіта з пневмококками. Це теж природній процес - але реальніше виглядає в лабораторному посуді, в брюшній порожнині дослідних мишей, там ефективність така, що відразу детектується дослідником. Поговоримо про те, що вже відомо і які гіпотези про тонкі механізми трансформації бактерій високомолекулярними лінійними фрагментами ДНК - продуктами деградації хромосом донорних клітин, про гіпотетичні механізми трансформації голою ДНК. Гріффіт зробив експеримент 1928 році, в 1944 англійці провели серію доказовизх експериментів, а потім ще десятки лабораторій визначали молекулярні аспекти такої трансформації. Тут нічого такого що є для фагів та F-фатору немає (ні пілів, ні транспортних білків). Також цей процес суттєво відрізняється від трансформації плазмідною ДНК. Фрагменти лінійної хросмосомальної ДНК повинні специфічно взаємодіяти з рецепторними білками на мембрані бактерії. Для цього існує мембрано-асоційований ДНК-зв'язуючий білок, яки 646f522g ;й транспортується на мембрану бактерій і вбудовується при участі другого білку - автолізину. Перший білок асоціюється з нуклеазою. На мембрані dowble strand, а в клітині стає single strand DNA. Цей етап неспецифічний за рахунок конститутивних екзонуклеаз. Далі -інтеграція можлива лише для специфічних гомологічних послідовностей (нехай часткова, але гомологія) - гібридизація, екстензія, перенесення зв'язку хімічного на ланцюгах, добудова комплементарного ланцюга, підрівнювання кінців, репарація лігазою. Точний механізм молекулярний - так як і при кон'югації не зовсім зрозумілий. Можливо, компетентними для подібної трансформації є клітини, в яки 646f522g ;х відбувається репликативний синтез хромосоми. За оцінкою таких трансферних процесів у бактеріях з точки зору еволюційної, рівня ефективності вони виглядають більш другорядними, і, напевне, загалом воно так і є. І спочатку цей процесс вважали артефактом генетичних трансферних процесів бактерій, навіть не зважаючи на те, що така трансформація вперше довела вченим що молекула спадковості є ДНК. Однак є екстравагантні виключення. Пізніше на клітинах бактерій Hemophilus і Neisseria - обидві є проблемою для інфекціоністів та епідеміологів - небезпечні для людини - довели, що принаймні для них передача таких лінійних ДНК є закодована генетично. Ці бактерії кодують ДНК - звязуючий білок , що локалізується в периплазматичному просторі. Цей біло впізнає не всі впідряд двонитьові ДНК, а консенсусну послідовність типу 5'-AAGTGGGTCA-3'. Цей консенсус є практично генетичним маркером геному Hemophilus - зустрічається понад 600 разів -раз на кожні 4 кілобаз.

Розрізняють рестриковану та загальну (теж відносно рестрикована). Властива лише лізогенним фагам. Чому рестрикована - приклад на фагу лямбда - інтегрує в один сайт лише, отже може трансдукувати тільки гени gal та bio E coli. Загальна - коли специфічність інтеграції слабогомологічна. Інколи в фагову оболонку пакується лише бактеріальна ДНК фланкована вірусними повторами комплементарними з сигналом пакування. При загальній трансдукції, на відміну спеціальної чи рестрикованої, фрагмент гомологічний може заміщуватися фрагментом, що приніс фаг, причому інтеграція може бути разом з фагом, чи обмежено - тільки гомологічна область вбудується, як при трансформації - за рахунок RecA.