Cinetici Enzimatice in Sisteme Bifazice Apa-Solvent Organic

Cinetici Enzimatice in Sisteme Bifazice Apa-Solvent Organic

Exemple practice de utilizare a enzimelor "in sens invers"

Se stie de lung timp ca daca proteazele sunt alimentate cu inalte concentratii de proteine solubile, peptide sau aminoacizi, se produc polimeri (plasteine) aparent in mod intamplator, cu structuri mai degraba hidrofobice.

VIII

Termolizina imobilizata nu poate fi folosita in acest proces deoarece s-a determinat ca precipita impreuna u complexul insolubil format. Insa, acest lucru poate fi evitat prin utilizarea ei intr-un sistem bifazic lichid/lichid.

Tabel .

Specificitatea unor proteaze industriale specifice care implica intermediari acil.

- AA reprezinta orice rest amino acid si Z reprezinta resturile amino acid, esteri sau amide.

- Situsurile de clivaj sunt cele preferate de enzima pura; preparatele brute pot avea specificitati mai largi.

Sinteza aspartamului este un exemplu foarte simplu de cum pot fi utilizate proteazele in sinteza peptidelor. Cele mai multe proteaze au specificitate pentru situsurile pe care le cliveaza si pot fi utilizate pentru sinteza de legaturi peptidice specifice. Factorii care favorizeaza sinteza peptidelor sunt alegerea corecta a pH-ului, selectia resturilor ce se protejeaza pentru grupele amino si carboxil incat sa se favorizeze precipitarea produsului si utilizarea sistemelor bifazice lichid/lichid, toti factorii care actioneaza la controlul echilibrului reactiei. O strategie alternativa este sinteza controlata in mod cinetic in care viteza sintezei produsului peptidic (K_P) este foarte asemanatoare cu viteza de hidroliza a peptidei (K_H). Aceasta poate fi asigurata prin furnizarea unui amino acid sau unei peptide care este un nucleofil mai puternic decat apa pentru a accepta o unitate peptidica de la intermediarul enzima-peptida. Aceasta reactie controlata cinetic poate fi reprezentata astfel:

IX

unde X reprezinta un alcool, o amina sau alta functie activa, de exemplu reactantul este un ester, o amida (peptide) sau acid carboxilic activata. Viteza relativa de formare a peptidei comparata cu hidroliza ei depinde de raportul K_P/K_H, raportul valorilor K_m pentru apa si amina si concentratiile relative ale aminei (neprotonate) si apei. Astfel, cand este necesar, productia reactiei poate fi imbunatatita prin scaderea activitatii apei. A fost determinat ca productia poate fi crescuta prin reducerea temperaturii la 4⁰C, probabil prin un efect de disproportionare asupra valorilor K_m. Pentru asemenea reactii controlate cinetic concentratiile aminei si enzimei ar trebui sa fie cat de inalt posibil si numai acele enzime care utilizeaza intermediari peptide legate covalent de enzima pot fi utilizate. De asemenea, in asemenea control termodinamic reactia este stopata inainte de a se atinge echilibrul, peptida produsa va fi convertita inapoi prin intermediul enzimei la acidul carboxilic, proces realizat aproape ireversibil prin ionizarea sa in solutii la valori de pH mai mari decat valoarea sa de pK_a, asa cum se vede in schema:

X

Peptidele pot fi lungite fie prin aditia cate unui rest de amino acid fie prin condensarea de fragmente peptidice. Dimensiunea unei peptide dorite ca produs final poate determina tipul de sinteza utilizat. Condensarea fragmentelor poate fi realizata in procese controlate cinetic in timp ce elongarea treptata se realizeaza cel mai bine folosind procese controlate termodiamic in sisteme bifazice solid/lichid (de exemplu precipitarea) sau lichid/lichid.

In general putine proteaze sunt cerute pentru astfel de scopuri sintetice. Deoarece ele costa destul de mult, in special la activitatile inalte necesare pentru controlul cinetic, ele pot fi imobilizate pentru a se putea folosi in repetate randuri. Se pot da o serie exemple de sinteze peptidice. Conversia insulinei de porc la insulina umana necesita inlocuirea restului alanin C-terminal (β30) prin treonina. Aceasta se poate realiza printr-o singura etapa de transpeptizare catalizata de tripsina folosindu-se o treonina cu carboxilul protejat intr-o solutie apoasa cu un co-solvent organic. Grupul protector poate fi ulterior indepartat simplu printr-o hidroliza balnda si produsul purificat prin cromatografie prin gel de silice (schema XI).

Glicozidaze utilizate in reactii de sinteza

Acest domeniu este practice neglijat deoarece polizaharidele se pot obtine relative usor din surse vegetale sau microbiene, functia poilzaharidelor nu este asa de specific legata de structura lor si pentru ca teoria care descrie semnificatia functional a oligozaharidelor este inca in dezvoltare/studiu. Desi exista o abundenta de cunostiinte despre glicozidaze si specificitatile lor, nu exista nici o ratiune fundamentala de ce ele nu ar trebui utilizate la sinteza oligozaharidelor. Exista putine exemple in literatura de oligozaharide obtinute prin

XI

utilizarea de enzime ca dextransucraza (EC 2.4.1.5), levansucraza (EC 2.4.1.10), ciclomaltodextrin glucanotransferaza (EC 2.4.1.19) si β-galactozidaza (EC 3.2.1.23) care adauga resturi de glucoza, fructoza sau galactoza la acceptori potriviti. Fructosiltransferazele (de exemplu inulosucranaza, EC 2.4.1.9) au fost utilizate pentru a se sintetiza compusi ca sucroza-6-acetat, xilosucroza (β-D-fructofuranozil-(2,1)-a-D-xilopiranozida) si indulcitorul putin cariogenic (cariogenic = compus care ataca dintii,cariaza) "neozahar", care consta dintr-un amestec de glucoza, sucroza si fructani legati β-2,1 cu resturi de glucoza nereducatoare terminale (compozitia tipica inainte de rafinarea cromatografica:2% fructoza, 26% glucoza, 11% sucroza, 30% 1-kestoza (β-D-fructofuranozil-(2,1)-β-D-fructofuranozil-(2,1)-a-D-glucopiranoza), 25% nistoza (β-D-fructofuranozil-(2,1)-β-D-fructofuranozil-(2,1)-β-D-fructofuranozil-(2,1)-a-D-glucopiranoza)si 6% oligozaharide superioare.

sucroza + glucoza-6-acetat Dsucroza-6-acetat + glucoza XII

sucroza + xiloza D xilosucroza + glucoza XIII

sucroza + sucroza D 1-kestoza + glucoza XIV

1-kestoza + sucroza D nistoza + glucoza XV

sucroza + dextran (G_n) D fructoza + dextran (G_n+1) XVI

Asa cum se arata in reactia XVI, dextransucraza poate fi utilizata pentru producerea de dextran (un polimer format din resturi de glucoza legate a-1,6) din sucroza. Dextranul este utilizat ca gel cromatografic, cum sunt cele Sephadex, in sisteme apoase cu doua faze, cum s-a prezentat deja si ca extender al plasmei sanguine. Pentru oricare dintre aceste utilitati nu este de dorit ca in dextran sa ramana celule, astfel incat dextransucraza produsa de extracelular de catre Leuconostoc mesenteroides trebuie purificata inainte de utilizare. Dimensiunea moleculelor de dextran poate fi controlata prin includerea de mici concentratii de glucide cum este maltoza care concureaza cu sucroza ca acceptoare pentru resturile de glucozade la moleculele de sucroza donoare.

Sinteza controlata in mod termodinamic a oligozaharidelor, catalizata de glicozidaze, este posibila prin utilizarea unei concentratii inalte de substrat si o "capcana moleculara" pentru a indeparta produsii. De exemplu, β-galactozidaza poate fi utilizata pentru a se sintetiza N-acetillactozamina (β-D-galactopiranozil-(1,6)-2-acetamido-2-deoxi-D-glucoza) folosindu-se o coloana de carbon-celita pentru indepartarea produsului cum se formeaza.

    XVII

Se pare ca nu exista incercari sistematice de a se obtine hetero-oligozaharide prin reactii controlate pe etape cinetic sau termodinamic asa cum se utilizeaza la sinteza de peptide.

Interesterificarea lipidelor

Nu este nici o oportunitate sau necsitate de a se realiza polimeri sau oligomeri folosind lipaze sau esteraze dar acest lucru este posibil si sunt o serie de avantaje comerciale de a se utiliza astfel de enzime cum sunt transferazele in transsterificari (schimbarea gruparii carboxyl intre esteri), acidolize (schimbarea gruparii carboxyl intre esteri si acizi carboxilii) si alcoolize (schimbarea alcoolilor intre esteri si alcooli). Unele trigliceride, untul de cacao fiind un exemplu proeminent, avand o mare valoare datorita proprietatilor sale fizice si raritatea sa comparativa. De aceea, exista un interes comercial remarcabil de a se gasi cai de producere de trigliceridede inalta valoare din materiale brute cat mai ieftine. O astfel de cale poate fi realizata folosindu-se lipaze (de exemplu lipaza extracelulara produsa de Rhizopus sau Mucor Miehei) care actioneaza ca transacilaze.

XVIII

Aceasa reactie de acidoliza poate fi folosita pentru cresterea valorii uleiului de rapita schimband acidul linoleic cu acid linolenic si crescand valoarea uleiului de palmier si a celui de floarea soarelui prin cresterea continutului lor de acid oleic.

lipaza    
CH₃CH₂OCOCH₃ + (CH₃)₂CHCH₂CH₂OH (CH₃)₂CHCH₂CH₂OCOCH₃ + CH₃CH₂OH XIX

Etil acetat + isoamilalcool isoamil acetat + ethanol