EFECTUL INDOMETACINULUI SI ACETAZOLAMIDEI ASUPRA IZOENZIMELOR AC - STUDII IN VIVO

Efectul Indometacinului si Acetazolamidei asupra izoenzimelor AC - studii in vivo

Dr. Lucian Unita, Dr. Alina Iacobescu, Prof. Dr. Ioan Puscas

Introducere

Anhidraza carbonică are numeroase functii fiziologice, toate derivând din reactia de echilibru acido-bazic pe care o catalizeaza.

S-au punctat cel putin 4 trasaturi care confera unicitate acestei reactii printre alte procese catalizate enzimatic: reactia este anorganica reactia poate avea loc în ambele directii la viteze destul de mari si în absenta enzimei,iIntr-un sistem deschis, r 212e48c eactia are loc într-o faza heterogena; mai mult, din moment ce una din componentele sistemului (bioxidul de carbon) este o componenta gazoasa, el poate difuza mai usor sau mai greu, conducând astfel la echilibrul reactiei adica spre stânga sau dreapta, in echilibrul reactiilor sunt implicati un numar relevant de specii moleculare si ionice, mai ales H₂O, CO₂, H⁺, OH^-, H₂CO₃, CO₃^2-. Mai mult, în absenta unor sisteme tampon, reactia este întotdeauna dependenta si asociata modificarilor valorilor de pH. In plus fata de aceste caracteristici, strict în privinta reactiei necatalizate, în afara proprietatatilor aditionale, amintite pâna acum, specifice anhidrazei carbonice, altele care sunt investigate, vor creste complexitatea sistemului:

Distributia izoenzimelor anhidrazei carbonice în corpul uman este aproape ubicuitara. Numai la om, anhidrazele cabonice formeaza o familie de cel putin 12 izoenzime diferite. Cele mai abundente izoenzime în unele zone, cele dotate cu activitate catalitica slaba (adica, concentratia AC I în comparatie cu AC II din hematii).

Efectul primordial, de baza al activitatii anhidrazei carbonice este reglarea kinetica a valorilor bioxidului de carbon, a hidrogenului, a bicarbonatului si a CO₃^2- în multele compartimente ale organismului în care anhidraza carbonica este localizata O astfel de reglare continua genereaza direct sau indirect un set complet de functii fiziologice.

Transportul si eliminarea CO₂, reglarea pH-ului si a presiunii osmotice, secretia lichidelor si reglarea procesului de schimb ionic sunt deci cele mai obisnuite procese fiziologice care implica activitatea catalitica a uneia sau mai multor izoenzime ale anhidrazei carbonice. In fata acestui set de activitati fiziologice mai nou recunoscute, se poate adauga un numar rezonabil de noi roluri care au fost propuse în ultimii ani.

Material si metoda

Materiale

AC I si AC II purificate, tampon HEPES, p-nitrophenol, au fost procurate de la firma Sigma (Diesenhofen, Germany); acetazolamida de la firma Lederle (USA); indometacinul de la Sicomed (Bucuresti).

Descrierea Experimentelor

Studiile in vivo

Studiile in vivo au fost efectuate în acord cu Declaratia de la Helsinki privind drepturile pacientilor, fiind obtinute consimatămintele fiecarui pacient pentru introducerea sa in studiu.

Au fost selectate 3 grupe de câte 15 voluntari sănatosi fiecare, care au primit timp de 10 zile consecutiv urmatoarea terapie:

Grup 1 - indometacin per os, 3 mg/kg corp.;

Grup 2 - acetazolamida, p.o., 30 mg/kg corp.;

Grup 3 - tratament asociat p.o. compus din indometacin (3 mg/kg corp) + acetazolamida (30 mg/kg corp).

La pacientii din toate grupele li s-a determinat secretia acida bazala (BAO) atât înainte cât si dupa 5, respectiv 10 zile de tratament. S-a recoltat de asemenea sânge si fragmente de mucoasa gastrică prin biopsie videoendoscopica la aceleasi intervale de timp si s-a măsurat activitatea AC I si AC II din hematii, precum si AC IV din celulele parietale ale mucoasei gastrice.

Diferentierea activitatii AC I de AC II din hematii s-a realizat prin testul cu nicotinati descris de Prof.Puscas, test prin care se realizeaza inhibitia selectiva a AC I de AC II.

Izolarea AC IV din celulele parietale ale mucoasei gastrice umane s-a făcut prin tehnica descrisa de Maren si colab.

Tehnica de determinare a activitatii anhidrazei carbonice

Determinarea activitatii anhidrazei carbonice s-a facut prin metoda stopped-flow. Aceasta consta în urmarirea enzimatica a reactiei de hidratare a CO₂ prin tehnica colorimetrica de schimbare a pH-ului. Este masurat timpul în care pH-ul amestecului de reactie scade de la valoarea initiala de 7,5 la valoarea finala de 6,5. Urmarirea reactiei se face spectrofotometric la lungimea de unda de 400 nm, cu un spectrofotometru de cinetica rapida model HI-TECH SF-51MX (Anglia), echipat cu o unitate de amestecare si un sistem de 4 seringi pentru introducerea reactivilor. Semnalul transmis de un fotomultiplicator conectat la camera de amestecare este preluat si vizualizat de un computer echipat cu un coprocesor matematic si un program cinetic de tip RKBIN IS-1. Reactivii folositi sunt : p-nitrofenol în concentratie de 0,2 mM (ca indicator de pH), tampon HEPES în concentratie de 20 mM, solutie stoc de anhidraza carbonica II în concentratie de 3,44x10^-5 M, solutie CO₂ (15 mM) obtinuta prin barbotarea CO₂ în apa bidistilata si Na₂SO₄ - 0,1 M pentru mentinerea tariei ionice. Toti reactivii sunt adusi la un pH initial de 7,5.

- Formula de calcul a activitatii anhidrazei carbonice este urmatoarea:

A = T₀-T    UE/ml

T

unde T₀ = timpul reactiei necatalizate

iar T = timpul reactiei catalizate (în prezenta anhidrazei carbonice din hematii sau din mucoasa gastrica

- Formula de calcul a activitatii anhidrazei carbonice în prezenta indometacin, in vitro, este:

A1 = T₀-T₁    UE/ml

T₁

unde T₀ = timpul reactiei necatalizate

iar    T₁ = timpul reactiei catalizate în prezenta anhidrazei carbonice asociate cu indometacin la diferite concentratii molare.

Procentul de activare al indometacinului se obtine din relatia : (A₁-A/A) x100.

Rezultate

In Grupul 1, indometacinul creste BAO de la 2.11±0.81 to 4.67±1.02 mEq/h (p<0.001). Activitatea totala a AC din hematii creste de la 1.288 0.126 UE/ml la 2.771 0.143 UE/ml (p<0.05) din care activitatea AC II creste de la 1.06 0.121 UE/ml la 2.258 0.138 UE/ml (p<0.05) iar AC I de la 0.228 0.012 UE/ml la 0.513 0.022 UE/ml (p<0.05). Activitatea AC IV din mucoasa gastrica creste de la 1.163 0.132 UE/ml la 2.135 0.141 UE/ml (p<0.05).

In Grupul 2, acetazolamida reduce BAO de la 3.41±1.05 la 0.16±0.07 mEq/h (p<0.001). Activitatea totala a AC din hematii scade de la 1.216 0.119 UE/ml la 0.499 0.106 UE/ml (p<0.05) din care AC II scade de la 0.975 0.189 UE/ml la 0.389 0.094 UE/ml (p<0.05), iar AC I de la 0.241 0.010 UE/ml la 0.110 0.016 UE/ml (p<0.05). Activitatea AC IV din mucoasa gastrica scade de la 0.936 0.152 UE/ml la 0.355 0.087 UE/ml (p<0.05).

In Grupul 3 unde s-a asociat terapia cu indometacin si acetazolamida nu s-au inregistrat modificari semnificative nici ale BAO nici ale activitatii izoenzimelor AC I, II si IV.

Fig.1 - Modificarile activitatii AC I si AC II eritrocitare la grupele studiate

Fig.2 - Modificarile activitatii AC IV gastrice la grupele studiate

Fig. 3 - Modificarile secretiei gastrice acide bazale la grupele studiate

DISCUTII

Indometacinul creste activitatea AC I si AC II eritrocitara in vivo, precum si activitatea AC IV gastrica si renala. In vivo, activitatea enzimei creste progresiv pe toata durata tratamentului cu indometacin. Dupa 5 zile de tratament activitatea AC creste cu peste 100% fata de valorile bazale (initiale).

Efectul inhibitor in vivo al acetazolamidei asupra AC I si AC II eritrocitare, precum si asupra AC IV din celulele parietale gastrice se instaleaza progresiv cu durata tratamentului si paralel cu inhibitia secretieie gastrice acide. Dupa 5 zile de tratament inhibitia BAO ajunge la 100%. In vivo asocierea indometacinului la acetazolamida in doze terapeutice uzuale anuleaza efctul inhibitor al acetazolamidei asupra izoenzimelor AC. In grupul tratat cu indometacin se poate observa o crestere atât a AC din hematii cât si a celei din mucoasa gastrica, asociate cu cresterea secretiei gastrice acide bazale, fapt datorat prezeneti aceleasi izoenzime AC II în hematii si in mucoasa gastrica. In grupul tratat cu acetazolamida, reducerea activitatii AC II si AC IV este corelata cu scăderea secretiei gastrice acide. Comparativ cu efectele produse de indometacin si acetazolamida la grupele 1 si 2, asocierea celor doua substante la grupul 3 nu produce modificari semnificative nici ale activitatii AC nici ale secretiei gastrice acide. Rezultatele obtinute arată ca in vivo indometacinul antagonizează complet activitatea izoenzimelor AC, respectiv anuleaza efectul inhibitor al acetazolamidei asupra anhidrazei carbonice. Datele sugerează că anhidraza carbonica este situsul interactiunii dintre indometacin si acetazolamida, iar prin aceasta enzima este implicată în mecansimul prin care indometacinul antagonizează cresterea fluxului cerebral produs de acetazolamidă; descreste fluxul sanguin din mucoasa gastrica cu reducerea efectului citoprotector al acetazolamidei si inducerea ulcerelor prin indometacin; antagonizează efectele diuretice ale acetazolamidei. Indometacinul, ca antiinflamator nesteroidian, este cunoscut că scade activitatea ciclooxigenazei si consecutiv sinteza de prostaglandine, afectând mucoasa gastrica si duodenală si antagonizând răspunsul vascular cerebral la prostaciclină. Rezultatele obtinute sugerează că între anhidraza carbonică si ciclooxigenază ar exista o relatie inversă si anume: activarea AC este însotită de inhibitia COX si invers, iar corelatia dintre cele două enzime s-ar realiza prin intermediul modificărilor de pH induse de activarea sau inhibitia AC produsă de indometacin, respectiv acetazolamidă.

Concluzii

Indometacinul activează izoenzimele AC I, AC II purificate si AC IV gastrica si renala printr-un mecanism direct de actiune.

Acetazolamida inhibă izoenzimele AC I, AC II purificate si AC IV gastrica si renala printr-un mecanism direct de actiune.

Asocierea indometacinului la acetazolamidă reduce fectul inhibitor al acesteia asupra izoenzimelor AC cu peste 80%.

In vivo, indometacinul, utilizat într-un experiment cronic are un efect activator asupra AC I, AC II din eritrocite si AC IV din mucoasa gastrica, paralel cu cresterea secretiei gastrice acide.

In vivo, acetazolamida, utilizată într-un experiment cronic are un efect inhibitor asupra AC I, AC II din eritrocite si AC IV din mucoasa gastrica, paralele cu scăderea secretiei gastrice acide.

Asocierea celor doi agenti terapeutici in vivo nu produce modificări semnificative asupra activitătii izoenzimelor AC si nici asupra secretiei gastrice acide.

Activarea anhidrazei carbonice si antagonizarea efectelor inhibitoare ale acetazolamidei produse de indoemtacin ar putea fi unul din mecanismele leziunilor induse de acest medicament, alaturi de cel cunoscut, de inhibitie a secretiei de prostaglandine.

Inhibitia produsa de indoemtacin asupra ciclooxigenazei s-ar putea realiza "via AC", care prin variatiile de pH pe care le antreneaza ar putea produce modificari ale activitatii ciclooxigenazei si corespunzator al sintezei de prostaglandine.

Anhidraza carbonica este situsul antagonismului dintre indometacin si acetazolamida, prin aceasta explicându-se antagonizarea efectelor citoprotectoare, vasodilatatoare si diuretice ale acetazolamidei de catre indometacin.

Bibliografie

Arakawa T., Absence of effect of 16,16-dimetil prostaglandinm E₂ on reduction of gastric mucosal blood flow caused by indomethacin in rats. Dig. Dis. Sci. 34:1369-1373 .

Clive.D.M. Renal syndromes associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs. N.Engl.J. Med. 310:563-572.1984.

Ehsanullah R.S.B., Page M.C., Tidesley G., Wood J.R. Prevention of gastroduodenal damage induced by non-steroidal antiinflammatory drugs; Controlled trial of ranitidine. BMJ 297:1011-1021. 1988.

Graham D.Y., Agrawal N.M., Roth S.H. Prevention of AINS-induced gstric ulcer with misoprostol: Multicentre, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet 2: 1277-1280.1988.

Hansen T.M., Matzen P. and Madsen P. Endoscopic evaluation of the effect of indomethacin capsules and suppositories on the gastric mucosa in rheumatic patients. J. Rheumatol. 11:484-487. 1984.

Kollberg B., Aly A., Rubio C., Johansson C., Acetazolamide interferes with the profective effect of prostaglandin E₂ in the rat gastric mucosa. Scand.J.Gastroent. 16. 385-387 .

Lanas A.I., Remacha B., Esteva F., Saintz R. Risk factors associated with refractory peptic ulcers. Gastroenterology 109:1124-1133.1995.

Maren T.H., Carbonic anhydrase: chemistry and inhibition. Physiol. Rev. 47:595-748.1967.

Mellem H., Stave R., Osnes M. Simptoms in patients with peptic ulcer and hematemesis and/or melena related to the use of non-steroid anti-inflammatory drugs. Scand. J. Gastroenterology 20:1246-1248.1985.

Puscas I., Carbonic anhydrase inhibitors in the treatment of gastric and duodenal ulcers. In: Szabo S., Mozsik G., eds.Elsevier, New York: 164-179,1987.

Puscas I., Coltau M., Pasca R., Nonsteroidal anti-inflammatory drugs activate carbonic anhidrase by a direct mechanism of action. J.Pharmacol. Exp. Ther. 227:1464-1466,1996.

Puscas I., Coltau M., Prostagalnsins with vasodilating effect inhibit carbonic anhydrase while vasoconstrictive prostaglansins and leukotrienes B₄ and C₄ increase CA activity. Int.J. Clin. Pharmacol.Ther. 33:177-181,1995.

Puscas I., Puscas C., Buzas G. Inhibition of human gastric mucosa carbonic anhydrase by prostaciclin (PGI₂). Dig.Dis.Sci.31:759-789,1986.

Whittle B.J.R., Higgs G.A., Eakins K.E. et al. Selective inhibition of prostaglandin products in inflammatory exudates and gastric mucosa. Nature 284:271-273, 1980.