Imobilizarea enzimelor prin reticulare.
Imobilizarea enzimei se poate realiza si fara a se utiliza suporturi prin efectuarea de punti covalente cu ajutorul unor reactivi polifunctionali. Se obtin astfel structuri cu īnalta masa moleculara care devin insolubile. Pentru realizarea unei astfel de reactii se pot folosi numero& 929d33j #351;i reactivi, dintre care cei mai utilizati sunt :
|
Principalii reactivi polifunctionali |
|
|
Nume |
Structura |
|
Glutaraldehida |
|
|
Acid bis-diazobenzidin-2,2 -disulfonic |
|
|
Acid difenil-4,4'-diizotiocianat-2,2 -disulfonic |
|
|
1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzen |
|
|
3-metoxi-4,4'-difenil diizotiocianat-metan |
|
De departe glutaraldehida este reactivul cel mai utilizat nu numai pentru a se reticula enzimele ci si pentru realizarea asa numitii imuno-adsorbanti.
Īn acest proces enzima este diluata cu o proteina inerta, cum este albumina, pentru a se limita fenomenele de denaturare si a creste eficacitatea metodei de imobilizare. Derivatii rezultati pot fi si sub forma de membrane. Observatii la microscopul electronic au permis precizarea structurii fine a acestor tipuri de derivati.
Pentru obtinerea unor derivati cu o structura foarte poroasa asemanatoare buretilor, amestecul de enzima, albumina si glutaraldehida este congelat rapid dupa care se creste temperatura pāna la 40C īn mod lent.
Un astfel de proces de reticulare se poate aplica nu numai enzimelor ci si celulelor īntregi. Acestea prezinta avantajul, mai ales īn cazul īn care celula contine o enzima usor accesibila (cum este cazul enzimelor periplasmatice), ca permit utilizarea activitatii catalitice fara a se efectua procesele de extractie si purificare consumatoare de energie, timp si bani. Īn acest caz putem spune ca celula este suportul. De asemenea se evita eliberarea sistemelor care determina autodegradarea celulara printr-o īncalzire a sistemului timp scurt la o temperatura de 700- 800C. Īn plus acest procedeu permite scaderea importanta a costului enzimei imobilizate si este utilizat pe larg pentru imobilizarea glucoz izomerazei folosita pentru producerea de izoglucoza, una dintre cele mai importante aplicatii industriale de enzime imobilizata.
De exemplu cu glutaraldehida firma NOVO a reticulat Bacillus coagulans, iar GIST-BROCADES micelii de Actinoplanes missouriensis.
Avantaje si dezavantaje
Avantaje
Soliditatea legaturii enzima -suport care permite obtinerea de compusrezistenti la diferite variatii importante ale conditiilor de mediu (pH, tarie ionica) si, īn particular, la spalari repetate cu solutii concentrate de clorura de sodiu.
Exista o foarte mare varietate de suporturi si metode de activare, desi este aproape imposibil de a prevedea a priori eficacitatea unei metode de imobilizare, este īntotdeauna posibil sa se gaseasca pentru o enzima data o metoda care sa dea un randament de imobilizare bun.
Stabilitatea legaturilor covalente īntre enzima si suport se poate traduce si prin rigidificarea structurii tridimensionale a enzimei. Din aceasta rezulta noi proprietati, īn special printr-o crestere generala a rezistentei la factorii de denaturare(temperatura, pH, agenti denaturanti). Este semnificativ ca foarte multe enzime imobilizate prezinta o temperatura optima de activitate mai mare decāt a enzimei libere fapt deosebit de important pentru utilizarea enzimei īn flux continuu. Pentru ca rigidificarea enzimei sa nu fie totala, fiind necesara o anumita elasticitate, este obligatoriu sa se stabileasca conditiile optime de imobilizare pentru fiecare enzima īn parte si pentru fiecare procedura de imobilizare.
Dezavantaje
Īn prezent tehnica de imobilizare prin legare covalenta a enzimelor este una dintre cele mai utilizate si nu prezinta dezavantajele tehnicilor anterioare.
|
