Microscopia optica
2.1 Introducere. Scurt istoric.
Scopul microscopiei optice este acela de a putea observa obiecte ale caror dimensiuni sunt mai mici de 0,1mm, dar si acela de a observa si analiza detalii ale obiectelor macroscopice, care nu pot fi observate cu ochiul liber.
Instrumentul optic utilizat īn acest scop este microscopul. Descoperirea si perfectionarea microscopului a permis omului, pentru prima data, sa patrunda īn lumea fascinanta si vasta a microcosmosului.
Curiozitatea oamenilor de a descifra tainele microuniversului i-a determinat pe acestia sa gaseasca o cale de 212g68c a-l descoperi īnca din cele mei vechi timpuri.
Galileo Galilei (1564-1642) astronom matematician si fizician italian, profesor la Universitatii din Pisa si Padova, este considerat fondatorul stiintelor exacte si metodelor stiintifice moderne. Īn 1610 el s-a alaturat precursorilor microscopului compus modern.
Francesco Fontana(1580-1656), astronom italian, a fost probabil primul care a schimbat ocularul initial cancav al microscopului cu ocularul convex.
Denumirea de microscop a fost introdusa de catre Demiscianus(1645), membru al Alcademiei din Lincei, iar denumirile de obiectiv si ocular au ramas de la Schyrlaus Rheita(1597-1660), inventatorul lunetei terestre.
Robert Hooke(1635-1703) a realizat primul microscop compus de interes practic(1675), devenind pionierul observatiilor microscopice de precizie. Toate aceste observatii sunt descrise īn cartea sa de referinta īn istoria microscopului, "Micrograpfia or some philosophical description of minute bodies", London, 1665.
Primul microscop din lume era reprezentat de o micuta sfera din sticla:
Fig. 2.1
Acest microscop functioneaza astfel: se pune sfera īn dreptul ochiului, iar insecta care trebuie studiata se asaza īn focarul F. Un punct de pe insecta care trebuie studiata va da un fascicul paralel de lumina, care intra īn ochi.
Fiind un fascicul paralel muschii de acomodare ai cristalinului sunt relaxati si fasciculul se va focaliza īntr-un punct pe retina. Alt punct de pe insecta va fi focalizat īn alt punct de pe retina.
Fie Xins īnaltimea insectei pe verticala. Razele ce pleaca de la extremitatile insectei si trec prin centrul sferei sunt nedeviate. Unghiul dintre fasciculele paralele ce corespund imaginilor extremitatilor insectei pe retina este chiar marimea unghiului pe care o "vedem" folosind microscopul si are eXins a:
2.1 Cānd privim insecta fara
microscop trebuie tinuta la aproximativ 25cm pentru a focaliza
confortabil.
Marimea unghiulara va fi īn acest caz: Xins / 25cm, iar marimea unghiulara M este:
2.2
Principii optice de functionare a microscoapelor
Metoda cea mai simpla de observare a obiectelor mici, avānd dimensiuni sub 0,1mm, este de a folosi lupa.
Microscopul simplu(lupa)
Obiectele nu pot fi apropiate de ochi la o distanta mai mica decāt distanta optima de vedere d, care pentru ochiul emetrop este de aproximativ 25cm, deoarece apar dificultati de vedere. Daca īntre obiect si ochi se interpune o lentila convergenta avānd distanta focala(f) mai mica decāt distanta minima de vedere optica, obiectele pot fi apropiate de ochi, ceea ce determina cresterea aparenta a marimii obiectelor.
Fig. 2.2
Obiectul real care trebuie studiat se asaza īn vecinatatea focarului F1, īntre -2f si 0, astfel īncāt imaginea sa este dreapta, virtuala si marita(y2>0, x2<0). Ochiul plasat īn vecinatetea planului focal imagine, vede imaginea sub un unghi j >j, unde j este unghiul sub care ar vedea direct obiectul y1(fara lupa), daca ar fi asezat īn planul imaginii.
Marimea transversala va fi:
(1)
Formula lentilelor subtiri va fi:
(2)
Grosimentul unui microscop simplu sau compus are expresia:
(3); 
(4); 
; 
(5);
(6).
Grosimentul poate fi exprimat si īn functie de distante:
; 
; 
;
(7). Pornind de la
relatiile (6) si (7) putem discuta grosimentul lupei īn cāteva cazuri
speciale:
Tipuri de microscoape
Īnca din antichitate, dupa cum am aratat īn prima parte a acestui capitol, oamenii au fost preocupati de a patrunde īn tainele naturii, ale microuniversului, ceea ce a impus dezvoltarea microdcopiei optice. Astfel, exista o mare varietate de microscoape, īn functie de necesitatile practice si de principiul optic de evidentiere a imaginii.
La proiectarea si constructia lor s-a tinut cont de obiectul care trebuie analizat si, implicit, de performantele care trebuie sa le aiba microscoapele pentru a se atinge scopul dorit.
Microscoape destinate īnvatamāntului
Microscoape destinate īnvatamāntului trebuie sa fie superioare, ca reproductibilitate a datelor obtinute, microscoapelor profesionale deoarece sunt folosite de elevi si studenti, care nu au, initial, o pregatire optica adecvata manevrarii aparatelor. Ele au un principiu de functionare mai simplu deoarece procesul de instructie implica, īn primul rānd, urmarirea modului de funtionare a aparatului.
Un tip de microscop destinat īnvatamāntului este microscopul M.I.- 1, produs de I.O.R., avānd grosimentul pāna la 640x, obiectiv acromat 6x, 16x si 40x si ocular Huygens 8xsi 16x, permitānd analiza unor obiecte cu grosime pāna la 20mm. Cursa masei microscopului este de aproximativ 26mm, iar lungimea tubului optic de aproximativ 160mm. Iluminarea se face natural sau artificial.
Exista si microscoape cu sistem zoom, ceea ce determina o variatie continua a grosimentului, fara ca imagine sa dispara din cāmpul vizual al microscopului, permitānd astfel observatorului sa sesizeze corelatia dintre grosiment si detaliile imaginii.
Unele microscoape destinate īnvatamāntului permit obtinerea unor imagini stereoscopice, folosindu-se doua sisteme de formare a imaginii.
Microscoape destinate cercetarii
Microscoapele destinate cercetarii nu difera prea mult de microscoapele pentru īnvatamānt, īnsa au un grad foarte mare de adaptabilitate, pentru a exista posibilitatea īnlocuirii unor componente optice sau mecanice si de a adauga alte accesorii.
Astfel, masuta port-obiect sau capul revolver pot fi īnlocuite cu alte sisteme, sistemul de iluminat poate fi modificat, iar imaginea poate fi proiectata sau fotografiata pe un ecran, observarea īn cāmp luminos poate fi transformata īn observare pe cāmp obscur, toate aceste modificari facāndu-se īn functie de scopurile practice care trebuie urmarite.
Pentru realizarea modificarilor care se impun, microscoapele destinate cercetarii su o structura mai solida decāt cea a microscoapelor destinate īnvatamāntului.
Microscoapele cu contrast de faza
Acest tip de microscopie a fost dezvoltat de F. Zernike īn anul 1930 si pune īn practica folosirea fenomenului de contrast de faza, īn special īn studiul preparatelor biologice. Unele preparate biologice, precum bacteriile, sunt greu de studiat la microscop deoarece nu se disting din mediul din care fac parte, decāt printr-o usoara variatie a indicelui de refractie.
Contrastul de faza determina aceasta variatie, fara sa fie necesara recurgerea la contrastul de vizibilitate prin colorare chimica, procedeu care ar afecta preparatul studiat.
Contrastul de faza determina modificarea fazei luminii care strabate un obiect transparent si cu indicele de refractie variabil īn raport cu faza luminii care trece prin mediul transparent īn care se afla obiectul.
Acest tip de microscopie este analog celei interferntiale, deoarece si īn acest caz obiectul apare vizibil datorita indicelui sau de refractie si nu datorita absorbtiei luminii, este īnsa mai ingenioasa deoarece obiectul divide energia luminoasa īn doua fascicule de lumina care interfera.
Mecanismul fizic de producere a contrastului de faza este prezentat īn urmatoarea figura:
Fig. 2.18
Īn planul focal al condensatorului de iluminare se asaza o fanta inelara(fanta inelara de luminozitate) a carei imagine se formeaza īn planul focal al obiectivului, suprapusa peste elementul fanta-inelara de contrast de faza, constituit dintr-un material usor absorbant si avānd dimensiunile ceva mai mari decāt cele ale imaginii suprapuse.
Fiecare punct de iluminare al fantei da nastere la un fascicul īnclinat si paralel de lumina.
Obiectul care trebuie studiat este iluminat de o multime de astfel de fascicule care sunt focalizate īn planul elementului fanta-inelara de contrst de faza, acelasi cu planul focal al obiectivului. Numai lumina nedifractata trece prin fanta elementului de contrast de faza, lumina difractata ocolind-o. Acest element reprezinta baza microscopiei cu contrast de faza.
Microscoapele interferentiale
Obiectele pot fi percepute de ochi cu un microscop interferential, daca lumina care trece printr-un obiect transparent sau cea care este reflectata de un obiect opac, interfera cu lumina care a strabatut un alt drum, diferenta de drum optic fiind convertita īn diferenta de intensitate luminoasa a imaginii.
Principiile interferometrelo Michelson, Jasmin, Mach-Zehnder, pot fi utilizate si īn microscopie.
Unele tipuri de microscoape interferentiale au principii de functionare fara corespondent īn interferometria clasica.
Microscoapele interferentiale pot functiona fie īn lumina reflectata, fie īn lumina transmisa si pot fi atāt calitative cāt si cantitative.
Cele care functioneaza īn lumina reflectata se folosesc pentru observarea corpurilor microscopice opace, iar cele īn lumina transmisa se folosesc cānd corpul este partial transparent.
Microscoape bazate pe polarizarea luminii
Microscoapele bazate pe polarizarea luminii au polarizorul dispus īnaintea condensatorului de iluminare, iar analizatorul este dispus dupa obiectiv. Cel putin unul dintre dispozitivele de polarizare poate fi rotit. Un microscop obisnuit poate fi transformat īn microscop cu polarizare daca se fac modificarile mentionate mai sus, īnsa mai trebui operate anumite schimbari.
Astfel, obiectivul si condensatorul nu trebuie sa prezinte tensiuni, pentru a nu depolariza lumina, iar masa port-obiect trebuie sa fie mobila, pentru a se putea roti īn jurul axei optice a microscopului. Deasemenea, sistemul de iluminare trebuie sa permita trecerea de la iluminarea īn lumina convergenta la iluminarea īn lumina paralela. Utilizānd un astfel de microscop, putem detecta daca un cristal este sau nu izotropic, putem observa detaliile dintr-un material transparent si fibros, putem detecta tensiunile din materialele izotrope(cum ar fi sticla optica).
Pentru masuratori cantitative, microscopul trebuie echipat si cu fire reticulare orientate adecvat īn planul focal al ocularului si cu o fanta dispusa imediat sub analizator. Masa port-obiect trebuie sa fie mobila pentru a se putea roti īn mai multe planuri. Aceste microscoape se utilizeaza īn studiile mineralogice, petografice, chimice, etc. Īn primele microscoape de acest fel se foloseau prisme din spat de Islanda, pe cānd īn cele moderne se utilizeaza filtre polarizante, care elimina lumina parazita, aparuta prin absorbtie.
Microscoape metalografice
Aceste tipuri de microscoape se folosesc curent īn metalografie. Pentru a putea fi examinate obiectele opace, microscoapele trebuie sa functioneze īn reflexie. Caracteristica lor principala este ca sistemul de iluminare, īn general vertical, este parte integranta a microscopului.
Microscoapele metalografice folosesc atāt iluminarea cu fond luminos cāt si iluminarea cu fond obscur.
Principiile de functionare ale unui microscop metalografic cu iluminare verticala, pe fond luminos, sunt ilustrate īn figura de mai jos:
Fig. 2.19
Lumina provenita de la sursa de lumina este orientata de lentila de iluminare A prin diafragma de apertura si diafragma de cāmp, dupa care este preluata de lentila de iluminare B, astfel īncāt divizorul de fascicul o orienteaza catre planul obiect, care joaca si rol de condensator de focalizare. Lumina reflectata de obiect ajunge īn ocular si mai departe la observator.
Lentila de iluminare A determina doua plane, unul conjugat cu planul imagine al obiectivului microscopului, iar altul conjugat cu planul pupilei de iesire al obiectivului microscopului, ceea ce permite controlul independent al aperturii si iluminarii cāmpului prin intermediul diafragmelor variabile din aceste plane.
Randamentul divizorului de fascicul fiind de cca 20%, apar probleme de luminozitate, mai ales īn lumina polarizanta. Contrastul de imagine este redus din cauza reflexiilor pe suprafetele lentilelor obiectivului. Din aceasta cauza, īn ultimul timp, aceste suprafete sunt acoperite cu straturi antireflectante.
Randamentul mic al divizorului de fascicul implica folosirea surselor cu plasma compacta de arc de mercur sau xenon, de mare intensitate.
Microscoapele metalografice folosite pentru fotomicrografiere se numesc metalografe. Ele sunt dotate cu o sursa puternica de lumina si un sistem adecvat de fotografiere.
Daca se lucreaza īn lumina polarizata, polarizorul se poate plasa oriunde pe axa orizonatala a sistemului de iluminare, iar analizatorul, oriunde pe axa verticala, deasupra divizorului de fascicul, conform figurii a.
Pentru a reduce cāt mai mult depolarizarea cauzata de divizorul de fascicul, polarizorul trebuie orientat cu planul de polarizare perpendicular pe planul desenului, deci planul de polarizare al analizatorului trebuie plasat īn planul desenului.
Elementele unui microscop metalografic cu iluminare pe verticala, pe fond obscur, sunt si ele ilustrate tot īn figura a:
Fig. 2.20
Pentru acest tip de microscop, lentilele obiectivului sunt montate īntr-un tub de sticla sau de plastic transparent, capatul tubului transparent din partea divizorului de fascicul fiind slefuit sub forma unei suprafete plane, iar capatul din partea planului obiect este proiectat astfel īncāt lumina care intra īn tub sa cada pe obiect sub forma unui con de lumina tubular.
Dimensiunile divizorului de fascicul sunt mai mari decāt īn cazul microscopului metalografic cu iluminare verticala pe fond luminos, pentru a include suprafata periferica complet reflectanta. A doua lentila condensoare(B) este montata īntr-o fanta inelara, transparenta, iar lentila A este un dublet special.
Limitatorul de fascicul se afla īn planul diafragmei de apertura, iar sursa de lumina īn planul focal al lentilei condensoare, astfel īncāt forma fasciculului de lumina de la diafragma de apertura si pāna la obiectivul microscopului sa fie conica.
Microscoapele metalografice, cu iluminare pe verticala, pe fond obscur se utilizeaza pentru a pune īn evidenta zgārieturile fine de pe o suprafata bine slefuita, zgārieturi ce sunt invizibile daca se foloseste iluminarea pe fond luminos.
Fotomicrografia
Reprezinta tehnica de īnregistrare a imaginilor microscopice pe film.
Tehnica de lucru este mai complexa īn acest caz, deoarece trebuie combinate cunostintele de fotografiere cu cele de microscopie optica.
Īn fotomicrografie, mici defecte de iluminare, focalizare sau curatire a pieselor optice pot afecta observatiile finale.
Pentru obtinerea unei bune focalizari trebuie tinut cont de o regula generala: puterea de acomodare a ochiului trebuie sa fie un factor neglijabil īn operatia de focalizare, deoarece aparatul fotografic nu prezinta aceasta proprietate.
Pentru a evita efectele de acomodare a ochiului se foloseste metoda cu geam mat, metoda ecranului cu geam transparent si metoda focalizarii ocularului.
Īn cadrul metodei cu geam mat se asaza īn locul filtrului un geam mat pe care se formeaza imaginea.
Daca imaginea prezinta un contrast mai slab se foloseste metoda ecranului cu geam transparent, pe care se graveaza o retea de linii. Aceasta metoda se utilizeaza in cazul aparatelor de fotografiat mai mari, prevazute cu burduf.
Metoda de focalizare a ocularului(figura b) se utilizeaza atunci cānd aparatul fotografic nu permite modificarea distantei pāna la imagine sau nu permite accesul la planul focal.
Fig. 2.21
Aceasta metoda este folosita cel mai des īn practica fotomicrografierii, deoarece reduce la minimum influenta efectelor introduse de acomodarea ochiului, mai ales daca profunzimea de focalizare a ocularului este mica.
Distanta de la divizorul de fascicul pāna la planul focal al aparatului fotografic trebuie sa fie egala cu distanta de la divizorul de fascicul la imaginea focalizata de ocular.
Īn cazul fotomicrografiei, iluminarea trebuie sa fie mai puternica decāt īn microscopia vizuala, folosindu-se surse de lumina cu plasma concentrata de arc.
Daca unele microscoape de cercetare nu sunt prevazute cu un control automat al expunerii, expunerea va fi stabilita prin īncercari prealabile, respectāndu-se anumite reguli:
timpul de expunere variaza direct proportional cu patratul grosimentului microscopului;
timpul de expunere variaza invers proportional cu apertura numerica a conului de iluminare;
cresterea tensiunii de alimentare a sursei de lumina cu 25% reduce timpul de expunere aproximativ la jumatate.
Un timp de expunere prea mare poate introduce defocalizarea imaginii, īn timp ce valori mici pot produce umbre.
Pentru a obtine o valoare optima a timpului de expunere se folosesc filtre neutre.
Exista situatii īn care se poate trece de la microscopia vizuala la fotomicrografie, cu ajutorul unei prisme detasabile, ca īn urmatoarea figura:
Fi. 2.22
Īn figura de mai sus se pot distinge un subsistem vizual si un subsistem fotografic, obtinute cu ajutorul prismei, ambele avānd pozitii fixe. Īn prezenta prismei lumina este reflectata cītre sistemul vizual, iar prin īndepartarea ei, lumina este orientata catre subsisitemul aparatului fotografic. Daca se utilizeaza filme colorate, temperatura de culoarea a sistemului de iluminare a microscopului trebuie controlata. Filmele implica temperaturi de 3200K, 3450K sau 3800K, iar la lampile cu incandescenta avānd o temperatura de culoare de cca 2800K, temperatura de culoare se poate marii folosind filtre adecvate. Daca se īnregistreaza obiecte colorate pe un film alb-negru, trebuie controlat contrastul prin folosirea unor filtre colorate adecvate, dispuse īn sistemul de iluminare.
|
