Microscopia optica
2.1 Introducere. Scurt istoric.
Scopul microscopiei optice este acela de a putea observa obiecte ale caror dimensiuni sunt mai mici de 0,1mm, dar si acela de a observa si analiza detalii ale obiectelor macroscopice, care nu pot fi observate cu ochiul liber.
Instrumentul optic utilizat în acest scop este microscopul. Descoperirea si perfectionarea microscopului a permis omului, pentru prima data, sa patrunda în lumea fascinanta si vasta a microcosmosului.
Curiozitatea oamenilor de a descifra tainele microuniversului i-a determinat pe acestia sa gaseasca o cale de 212g68c a-l descoperi înca din cele mei vechi timpuri.
Galileo Galilei (1564-1642) astronom matematician si fizician italian, profesor la Universitatii din Pisa si Padova, este considerat fondatorul stiintelor exacte si metodelor stiintifice moderne. În 1610 el s-a alaturat precursorilor microscopului compus modern.
Francesco Fontana(1580-1656), astronom italian, a fost probabil primul care a schimbat ocularul initial cancav al microscopului cu ocularul convex.
Denumirea de microscop a fost introdusa de catre Demiscianus(1645), membru al Alcademiei din Lincei, iar denumirile de obiectiv si ocular au ramas de la Schyrlaus Rheita(1597-1660), inventatorul lunetei terestre.
Robert Hooke(1635-1703) a realizat primul microscop compus de interes practic(1675), devenind pionierul observatiilor microscopice de precizie. Toate aceste observatii sunt descrise în cartea sa de referinta în istoria microscopului, "Micrograpfia or some philosophical description of minute bodies", London, 1665.
Primul microscop din lume era reprezentat de o micuta sfera din sticla:
Fig. 2.1
Acest microscop functioneaza astfel: se pune sfera în dreptul ochiului, iar insecta care trebuie studiata se asaza în focarul F. Un punct de pe insecta care trebuie studiata va da un fascicul paralel de lumina, care intra în ochi.
Fiind un fascicul paralel muschii de acomodare ai cristalinului sunt relaxati si fasciculul se va focaliza într-un punct pe retina. Alt punct de pe insecta va fi focalizat în alt punct de pe retina.
Fie Xins înaltimea insectei pe verticala. Razele ce pleaca de la extremitatile insectei si trec prin centrul sferei sunt nedeviate. Unghiul dintre fasciculele paralele ce corespund imaginilor extremitatilor insectei pe retina este chiar marimea unghiului pe care o "vedem" folosind microscopul si are eXins a:
2.1 Când privim insecta fara
microscop trebuie tinuta la aproximativ 25cm pentru a focaliza
confortabil.
Marimea unghiulara va fi în acest caz: Xins / 25cm, iar marimea unghiulara M este:
2.2
Principii optice de functionare a microscoapelor
Metoda cea mai simpla de observare a obiectelor mici, având dimensiuni sub 0,1mm, este de a folosi lupa.
Microscopul simplu(lupa)
Obiectele nu pot fi apropiate de ochi la o distanta mai mica decât distanta optima de vedere d, care pentru ochiul emetrop este de aproximativ 25cm, deoarece apar dificultati de vedere. Daca între obiect si ochi se interpune o lentila convergenta având distanta focala(f) mai mica decât distanta minima de vedere optica, obiectele pot fi apropiate de ochi, ceea ce determina cresterea aparenta a marimii obiectelor.
Fig. 2.2
Obiectul real care trebuie studiat se asaza în vecinatatea focarului F1, între -2f si 0, astfel încât imaginea sa este dreapta, virtuala si marita(y2>0, x2<0). Ochiul plasat în vecinatetea planului focal imagine, vede imaginea sub un unghi j >j, unde j este unghiul sub care ar vedea direct obiectul y1(fara lupa), daca ar fi asezat în planul imaginii.
Marimea transversala va fi:
(1)
Formula lentilelor subtiri va fi:
(2)
Grosimentul unui microscop simplu sau compus are expresia:
(3); 
(4); 
; 
(5);
(6).
Grosimentul poate fi exprimat si în functie de distante:
; 
; 
;
(7). Pornind de la
relatiile (6) si (7) putem discuta grosimentul lupei în câteva cazuri
speciale:
Tipuri de microscoape
Înca din antichitate, dupa cum am aratat în prima parte a acestui capitol, oamenii au fost preocupati de a patrunde în tainele naturii, ale microuniversului, ceea ce a impus dezvoltarea microdcopiei optice. Astfel, exista o mare varietate de microscoape, în functie de necesitatile practice si de principiul optic de evidentiere a imaginii.
La proiectarea si constructia lor s-a tinut cont de obiectul care trebuie analizat si, implicit, de performantele care trebuie sa le aiba microscoapele pentru a se atinge scopul dorit.
Microscoape destinate învatamântului
Microscoape destinate învatamântului trebuie sa fie superioare, ca reproductibilitate a datelor obtinute, microscoapelor profesionale deoarece sunt folosite de elevi si studenti, care nu au, initial, o pregatire optica adecvata manevrarii aparatelor. Ele au un principiu de functionare mai simplu deoarece procesul de instructie implica, în primul rând, urmarirea modului de funtionare a aparatului.
Un tip de microscop destinat învatamântului este microscopul M.I.- 1, produs de I.O.R., având grosimentul pâna la 640x, obiectiv acromat 6x, 16x si 40x si ocular Huygens 8xsi 16x, permitând analiza unor obiecte cu grosime pâna la 20mm. Cursa masei microscopului este de aproximativ 26mm, iar lungimea tubului optic de aproximativ 160mm. Iluminarea se face natural sau artificial.
Exista si microscoape cu sistem zoom, ceea ce determina o variatie continua a grosimentului, fara ca imagine sa dispara din câmpul vizual al microscopului, permitând astfel observatorului sa sesizeze corelatia dintre grosiment si detaliile imaginii.
Unele microscoape destinate învatamântului permit obtinerea unor imagini stereoscopice, folosindu-se doua sisteme de formare a imaginii.
Microscoape destinate cercetarii
Microscoapele destinate cercetarii nu difera prea mult de microscoapele pentru învatamânt, însa au un grad foarte mare de adaptabilitate, pentru a exista posibilitatea înlocuirii unor componente optice sau mecanice si de a adauga alte accesorii.
Astfel, masuta port-obiect sau capul revolver pot fi înlocuite cu alte sisteme, sistemul de iluminat poate fi modificat, iar imaginea poate fi proiectata sau fotografiata pe un ecran, observarea în câmp luminos poate fi transformata în observare pe câmp obscur, toate aceste modificari facându-se în functie de scopurile practice care trebuie urmarite.
Pentru realizarea modificarilor care se impun, microscoapele destinate cercetarii su o structura mai solida decât cea a microscoapelor destinate învatamântului.
Microscoapele cu contrast de faza
Acest tip de microscopie a fost dezvoltat de F. Zernike în anul 1930 si pune în practica folosirea fenomenului de contrast de faza, în special în studiul preparatelor biologice. Unele preparate biologice, precum bacteriile, sunt greu de studiat la microscop deoarece nu se disting din mediul din care fac parte, decât printr-o usoara variatie a indicelui de refractie.
Contrastul de faza determina aceasta variatie, fara sa fie necesara recurgerea la contrastul de vizibilitate prin colorare chimica, procedeu care ar afecta preparatul studiat.
Contrastul de faza determina modificarea fazei luminii care strabate un obiect transparent si cu indicele de refractie variabil în raport cu faza luminii care trece prin mediul transparent în care se afla obiectul.
Acest tip de microscopie este analog celei interferntiale, deoarece si în acest caz obiectul apare vizibil datorita indicelui sau de refractie si nu datorita absorbtiei luminii, este însa mai ingenioasa deoarece obiectul divide energia luminoasa în doua fascicule de lumina care interfera.
Mecanismul fizic de producere a contrastului de faza este prezentat în urmatoarea figura:
Fig. 2.18
În planul focal al condensatorului de iluminare se asaza o fanta inelara(fanta inelara de luminozitate) a carei imagine se formeaza în planul focal al obiectivului, suprapusa peste elementul fanta-inelara de contrast de faza, constituit dintr-un material usor absorbant si având dimensiunile ceva mai mari decât cele ale imaginii suprapuse.
Fiecare punct de iluminare al fantei da nastere la un fascicul înclinat si paralel de lumina.
Obiectul care trebuie studiat este iluminat de o multime de astfel de fascicule care sunt focalizate în planul elementului fanta-inelara de contrst de faza, acelasi cu planul focal al obiectivului. Numai lumina nedifractata trece prin fanta elementului de contrast de faza, lumina difractata ocolind-o. Acest element reprezinta baza microscopiei cu contrast de faza.
Microscoapele interferentiale
Obiectele pot fi percepute de ochi cu un microscop interferential, daca lumina care trece printr-un obiect transparent sau cea care este reflectata de un obiect opac, interfera cu lumina care a strabatut un alt drum, diferenta de drum optic fiind convertita în diferenta de intensitate luminoasa a imaginii.
Principiile interferometrelo Michelson, Jasmin, Mach-Zehnder, pot fi utilizate si în microscopie.
Unele tipuri de microscoape interferentiale au principii de functionare fara corespondent în interferometria clasica.
Microscoapele interferentiale pot functiona fie în lumina reflectata, fie în lumina transmisa si pot fi atât calitative cât si cantitative.
Cele care functioneaza în lumina reflectata se folosesc pentru observarea corpurilor microscopice opace, iar cele în lumina transmisa se folosesc când corpul este partial transparent.
Microscoape bazate pe polarizarea luminii
Microscoapele bazate pe polarizarea luminii au polarizorul dispus înaintea condensatorului de iluminare, iar analizatorul este dispus dupa obiectiv. Cel putin unul dintre dispozitivele de polarizare poate fi rotit. Un microscop obisnuit poate fi transformat în microscop cu polarizare daca se fac modificarile mentionate mai sus, însa mai trebui operate anumite schimbari.
Astfel, obiectivul si condensatorul nu trebuie sa prezinte tensiuni, pentru a nu depolariza lumina, iar masa port-obiect trebuie sa fie mobila, pentru a se putea roti în jurul axei optice a microscopului. Deasemenea, sistemul de iluminare trebuie sa permita trecerea de la iluminarea în lumina convergenta la iluminarea în lumina paralela. Utilizând un astfel de microscop, putem detecta daca un cristal este sau nu izotropic, putem observa detaliile dintr-un material transparent si fibros, putem detecta tensiunile din materialele izotrope(cum ar fi sticla optica).
Pentru masuratori cantitative, microscopul trebuie echipat si cu fire reticulare orientate adecvat în planul focal al ocularului si cu o fanta dispusa imediat sub analizator. Masa port-obiect trebuie sa fie mobila pentru a se putea roti în mai multe planuri. Aceste microscoape se utilizeaza în studiile mineralogice, petografice, chimice, etc. În primele microscoape de acest fel se foloseau prisme din spat de Islanda, pe când în cele moderne se utilizeaza filtre polarizante, care elimina lumina parazita, aparuta prin absorbtie.
Microscoape metalografice
Aceste tipuri de microscoape se folosesc curent în metalografie. Pentru a putea fi examinate obiectele opace, microscoapele trebuie sa functioneze în reflexie. Caracteristica lor principala este ca sistemul de iluminare, în general vertical, este parte integranta a microscopului.
Microscoapele metalografice folosesc atât iluminarea cu fond luminos cât si iluminarea cu fond obscur.
Principiile de functionare ale unui microscop metalografic cu iluminare verticala, pe fond luminos, sunt ilustrate în figura de mai jos:
Fig. 2.19
Lumina provenita de la sursa de lumina este orientata de lentila de iluminare A prin diafragma de apertura si diafragma de câmp, dupa care este preluata de lentila de iluminare B, astfel încât divizorul de fascicul o orienteaza catre planul obiect, care joaca si rol de condensator de focalizare. Lumina reflectata de obiect ajunge în ocular si mai departe la observator.
Lentila de iluminare A determina doua plane, unul conjugat cu planul imagine al obiectivului microscopului, iar altul conjugat cu planul pupilei de iesire al obiectivului microscopului, ceea ce permite controlul independent al aperturii si iluminarii câmpului prin intermediul diafragmelor variabile din aceste plane.
Randamentul divizorului de fascicul fiind de cca 20%, apar probleme de luminozitate, mai ales în lumina polarizanta. Contrastul de imagine este redus din cauza reflexiilor pe suprafetele lentilelor obiectivului. Din aceasta cauza, în ultimul timp, aceste suprafete sunt acoperite cu straturi antireflectante.
Randamentul mic al divizorului de fascicul implica folosirea surselor cu plasma compacta de arc de mercur sau xenon, de mare intensitate.
Microscoapele metalografice folosite pentru fotomicrografiere se numesc metalografe. Ele sunt dotate cu o sursa puternica de lumina si un sistem adecvat de fotografiere.
Daca se lucreaza în lumina polarizata, polarizorul se poate plasa oriunde pe axa orizonatala a sistemului de iluminare, iar analizatorul, oriunde pe axa verticala, deasupra divizorului de fascicul, conform figurii a.
Pentru a reduce cât mai mult depolarizarea cauzata de divizorul de fascicul, polarizorul trebuie orientat cu planul de polarizare perpendicular pe planul desenului, deci planul de polarizare al analizatorului trebuie plasat în planul desenului.
Elementele unui microscop metalografic cu iluminare pe verticala, pe fond obscur, sunt si ele ilustrate tot în figura a:
Fig. 2.20
Pentru acest tip de microscop, lentilele obiectivului sunt montate într-un tub de sticla sau de plastic transparent, capatul tubului transparent din partea divizorului de fascicul fiind slefuit sub forma unei suprafete plane, iar capatul din partea planului obiect este proiectat astfel încât lumina care intra în tub sa cada pe obiect sub forma unui con de lumina tubular.
Dimensiunile divizorului de fascicul sunt mai mari decât în cazul microscopului metalografic cu iluminare verticala pe fond luminos, pentru a include suprafata periferica complet reflectanta. A doua lentila condensoare(B) este montata într-o fanta inelara, transparenta, iar lentila A este un dublet special.
Limitatorul de fascicul se afla în planul diafragmei de apertura, iar sursa de lumina în planul focal al lentilei condensoare, astfel încât forma fasciculului de lumina de la diafragma de apertura si pâna la obiectivul microscopului sa fie conica.
Microscoapele metalografice, cu iluminare pe verticala, pe fond obscur se utilizeaza pentru a pune în evidenta zgârieturile fine de pe o suprafata bine slefuita, zgârieturi ce sunt invizibile daca se foloseste iluminarea pe fond luminos.
Fotomicrografia
Reprezinta tehnica de înregistrare a imaginilor microscopice pe film.
Tehnica de lucru este mai complexa în acest caz, deoarece trebuie combinate cunostintele de fotografiere cu cele de microscopie optica.
În fotomicrografie, mici defecte de iluminare, focalizare sau curatire a pieselor optice pot afecta observatiile finale.
Pentru obtinerea unei bune focalizari trebuie tinut cont de o regula generala: puterea de acomodare a ochiului trebuie sa fie un factor neglijabil în operatia de focalizare, deoarece aparatul fotografic nu prezinta aceasta proprietate.
Pentru a evita efectele de acomodare a ochiului se foloseste metoda cu geam mat, metoda ecranului cu geam transparent si metoda focalizarii ocularului.
În cadrul metodei cu geam mat se asaza în locul filtrului un geam mat pe care se formeaza imaginea.
Daca imaginea prezinta un contrast mai slab se foloseste metoda ecranului cu geam transparent, pe care se graveaza o retea de linii. Aceasta metoda se utilizeaza in cazul aparatelor de fotografiat mai mari, prevazute cu burduf.
Metoda de focalizare a ocularului(figura b) se utilizeaza atunci când aparatul fotografic nu permite modificarea distantei pâna la imagine sau nu permite accesul la planul focal.
Fig. 2.21
Aceasta metoda este folosita cel mai des în practica fotomicrografierii, deoarece reduce la minimum influenta efectelor introduse de acomodarea ochiului, mai ales daca profunzimea de focalizare a ocularului este mica.
Distanta de la divizorul de fascicul pâna la planul focal al aparatului fotografic trebuie sa fie egala cu distanta de la divizorul de fascicul la imaginea focalizata de ocular.
În cazul fotomicrografiei, iluminarea trebuie sa fie mai puternica decât în microscopia vizuala, folosindu-se surse de lumina cu plasma concentrata de arc.
Daca unele microscoape de cercetare nu sunt prevazute cu un control automat al expunerii, expunerea va fi stabilita prin încercari prealabile, respectându-se anumite reguli:
timpul de expunere variaza direct proportional cu patratul grosimentului microscopului;
timpul de expunere variaza invers proportional cu apertura numerica a conului de iluminare;
cresterea tensiunii de alimentare a sursei de lumina cu 25% reduce timpul de expunere aproximativ la jumatate.
Un timp de expunere prea mare poate introduce defocalizarea imaginii, în timp ce valori mici pot produce umbre.
Pentru a obtine o valoare optima a timpului de expunere se folosesc filtre neutre.
Exista situatii în care se poate trece de la microscopia vizuala la fotomicrografie, cu ajutorul unei prisme detasabile, ca în urmatoarea figura:
Fi. 2.22
În figura de mai sus se pot distinge un subsistem vizual si un subsistem fotografic, obtinute cu ajutorul prismei, ambele având pozitii fixe. În prezenta prismei lumina este reflectata cître sistemul vizual, iar prin îndepartarea ei, lumina este orientata catre subsisitemul aparatului fotografic. Daca se utilizeaza filme colorate, temperatura de culoarea a sistemului de iluminare a microscopului trebuie controlata. Filmele implica temperaturi de 3200K, 3450K sau 3800K, iar la lampile cu incandescenta având o temperatura de culoare de cca 2800K, temperatura de culoare se poate marii folosind filtre adecvate. Daca se înregistreaza obiecte colorate pe un film alb-negru, trebuie controlat contrastul prin folosirea unor filtre colorate adecvate, dispuse în sistemul de iluminare.
|
