PRINCIPII DE GENETICA IN DIAGNOSTIC, TRATAMENT SI PROFILAXIE
13.1. Principii de genetica de diagnostic
Ñ Particularitati
è diagnosticul componentei ereditare a unei boli se impune cat mai precoce
F in medicina: preconceptional, prenatal, postnatal, presimptomatic
F in epidemiologie - ore // zile de la eveniment
F in criminalistica - ore // zile // ani - de la eveniment
F in medicina legala - ????
è diagnosticul componentei ereditare nu incepe si se termina cu bolnavul
F punct de plecare pentru investi 252j95c garea intregii familii
13.1.1. Diagnosticul genetic clinic = pasul initial = bolnavul se prezinta la practician
13.1.2. Diagnosticul genetic paraclinic
A) prin tehnici invazive
Ñ Fetoscopia = vizualizarea fatului //placentei // cordonului ombilical
è permite diagnosticul malformatiilor congenitale
è permite terapia fetala
è rar utilizata - risc de avort = 5%
Ñ Amniocenteza = punctia tansvaginala // transabdominala a cavitatii amniotice
è prelevare 5-10ml proba è investigatii citogenetice, biochimice, ADN
è investigatiile citogenetice = rezultat tardiv - celule imbatranite
è risc mic pentru embrion
Ñ Biopsia de vilozitate coriala = prelevare sub control ecografic proba anexe fetale
è risc relativ mediu pentru embrion
è investigatiile citogenetice = rezultat precoce - celule tinere
Ñ Cordocenteza = prelevare de sange embrionar din cordonul ombilical
è risc mare pentru embrion è utilizata in situatii speciale
B) prin tehnici neinvazive
Ñ Ecografia fatului = examen de rutina ce permite
è evaluare greutate si dimensiuni fetale
è prognosticul datei nasterii
è diagnosticul sex fat // malformatii congenitale
Ñ Radiografia fetala
è efectuata numai in bolile ereditare ale sistemului osos
13.1.3. Diagnosticul citogenetic
Ñ Testul Barr - diagnosticul anomalii numerice gonozomiale (cromosom X)
Ñ Cariotipul simplu - diagnosticul anomaliilor cromosomiale numerice
Ñ Cariotipul prin marcaj in benzi (bandarea cromosomilor) - tehnicile G, Q, R
è permite diagnosticul anomaliilor cromosomiale structurale
13.1.4. Diagnosticul genetic biochimic
Ñ Evidentierea acumularii de substrate / produse metabolice anormale
è ex. = Fen - r. cu perclorura de fier, t. Guthrie, hartie Fenistix
Ñ Separarea cromatografica a unor substrate
è ex. = aminoacizii (aminoacidopatii) + colorare cu ninhidrina
F alifatici (albastru), aromatici (maro), imidazolici (roz)
Ñ Separarea electroforetica a polipeptidelor
è ex. = hemoglobinopatii, izoenzime etc
Ñ Teste enzimatice = diagnostic
è homozigoti recesivi (afectati)
è heterozigoti (purtatori)
è homozigoti dominanti (normali)
Ñ Teste imunologice = markeri - antigene de histocompatibilitate (haplotipuri)
è dg. presimptomatic, dg. purtatori, dg. paternitate, eval. risc
Ñ Dozarea nivelului umoral al unui produs biologic
è ex. = factorii de coagulare
Ñ Secventare proteina = evidentiere a.a. mutant (nu detecteaza mutatiile sinonime)
è ex. = bolile moleculare
13.1.5. Diagnosticul genetic molecular (analiza ADN)
Ñ Sursa ADN = orice celula nucleata è 10ml de sange è g ADN
Ñ Analiza ADNN
è dg. genetic indirect = sonde ADN // loci polimorfi // secvente repetitive // PCR
è dg. genetic direct = secventare alela mutanta //ASOs // PCR
13.1.5.1. Diagnosticul indirect prin tehnici de genetica moleculara
Ñ Metoda - variabilitatea secventelor AND - detectarea unei alele mutante
F polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie (RFLPs)
F variabilitatea numarului de secvente repetitive (VNTRs)
A. RFLPs
Ñ Enzime de restrictie
è celule procariote = aparare contra ADN strain > 400 enzime
F recunosc peste 100 secvente diferite cu lungimi de 4-6pb
F taie ADN in fragmente de lungimi diferite
F identificare fragmente - proba (antisecventa) ADN marcata
Ñ RFLPs - determina prezenta / absenta siturilor restrictie
è 20% indivizi - variatii situri de restrictie = polimorfism genetic
F survin la ~ 200-500pb in genomul uman
F majoritatea fara expresie fenotipica (clinica) = mutatii tacute
F numai 1/6-1/5 pot fi identificate prin enzime de restrictie
B. VNTRs = secvente repetitive = microsateliti / minisateliti / oligonucleotide
F numarul de secvente repetitive difera intre omologi (70%)
F detectarea simultana a unor loci multipli = amprenta ADN
F utilitate: medicina, medicina legala, criminalistica
è VNTRs - secvente microsatelit F prezente la cca. 30Kb, lungime < 1Kb
è VNTRs -secvente minisatelit F lungime 1-3Kb
è STR (small tandem repeats) - secvente inalt repetitive
Tehnici pentru identificarea polimorfismului ADN
Ñ Southern blotting - necesita 5-10μg ADN - rezultate - 1 saptamana
è taiere ADN in situri de restrictie
è separare fragmente prin electroforeza
è transfer fragmente pe un filtru de celuloza
è identificarea secventei dorite cu o antisecventa marcata
Ñ PCR - necesita 50ng ADN - rezultate - o zi
è amplificare prin replicare a unui fragment de AND
F in 20-30 runde = amplificare de 10
è digestia fragmentului cu enzime de restrictie
è separarea fragmentelor prin electroforeza
è coloraea fragmentelor cu bromura de etidiu, florocromi
è vizualizare cu UV
13.1.5.2. Diagnosticul direct prin tehnici de genetica moleculara
è permite diagnosticul molecular exact
Ñ Southern blotting + PCR
è permite detectarea mutatiilor genice
F deletii = benzi micsorate sau absente
F amplificare trinucleotide = benzi mai late
Ñ Oligonucleotidele specifice alelelor (ASOs)
è identificate prin probe complementare pentru ADN normal / mutant
è prezenta / absenta hibridizarii poate identifica indivizii
F homozigoti normali
F heterozigoti (purtatori) normali
F homozigoti afectati
Ñ Secventarea ADN - utilizeaza o singura catena
è sinteza oligonucleotide cu lungime crescanda
4 reactii paralele (capilare diferite)
1 capilar - marcarea nucleotidelor prin 4 florocromi diferiti
è stopare polimerizare = adaos deoxinucleotide specifice
è identificare oligonucleotid dupa pozitia pe gel (soft specializat)
è citirea secventei pe gel / calculator
Principii genetice de tratament
Ñ Filiera dogmei centrale - tratamentul se adreseaza
è substratului
F dieta de restrictie / imbogatire
F favorizarea eliminarii produsului toxic
F derivatii chirurgicale
è produsilor genici
F terapie de substitutie
F transplant de tesuturi (maduva hematogena, fibroblaste)
è genelor
F culturi de celule de la pacient
F sinteza gena prin revers-transcriptaza
F constituire banca de gene - pe plasmide
F transfer de gene in culturi de celule
F selectare celule ce au fixat gena normala
F transfer celule in organism
-1. Limitarea substratului = dieta
Ñ In bolile cu deficit de enzime pe caile catabolice
è fenilcetonurie - galactozemie - deficit de lactoza etc
-2. Indepartarea unui produs metabolic ce se acumuleaza
Ñ Indepartarea medicamentoasa - in boala Wilson - cu D-penicilamina
Ñ Indepartarea prin dializa - in cistinurie pentru a preveni litiaza
Ñ Inductia enzimatica a enzimelor RER - in s. Crigler-Najar - glicuronil transferaza
-3. Administrarea produsului deficitar
Ñ Suplimentarea proteinei deficitare
è STH, T-3, cortizon, aldosteron, hormoni sexuali, insulina, facori coagulare etc.
Ñ Tratamentul de substitutie = deficit total / partial de enzime - in tezaurismoze, MPZ
-4. Tratamentul chirurgical
Ñ Tratamentul chirurgical de rutina = corectare, estetic, preventiv
è malformatii, extirpare tumori etc
Ñ Chirurgia pe uter deschis = malformatii - pericol vital in perioada neonatala
è hidrocefalie, obstructie cai urinare, hernie diafragmatica etc.
Ñ Transplant tesuturi // organe è cornee, timus, rinichi, pancreas, maduva hematogena
-5. Terapia genica
Ñ Transfer de gene in culturi de celule prin vectori virali
è tropism pentru un tip celular
è defectiv - sa nu produca boala
è insertie gena in pozitia normala // apropiata
13.3. Principii genetice de profilaxie
è profilaxia - justificat de costurile sociale
Ñ Ancheta familial - pornind de la proband
Ñ Identificare heterozigoti - inainte de cstorie in familiile cu risc genetic
Ñ Screening familial pentru o boala + diagnostic presimptomatic
Ñ Diagnostic prenatal - ecografic, citogenetic, biochimic, molecular
Ñ Sfat genetic - candidatilor la casatorie // parintilor cu istoric familial
Ñ Inseminare artificiala - sot cu boala dominanta // oligo/azoospermie
Ñ Fecundarea in vitro - sotie cu boala dominanta
è sincronizare ciclu donatoare (sanatoasa) + acceptoare (afectata)
è recoltare ovul prin aspirare
è fertilizare prin ICSI
è pastrare embrion in cultura pana la stadiul de blastocist
è transfer zigot la mama-acceptoare
Ñ Modificare mediu - educatie, evitare factori declansatori
Ñ Tratament profilactic - prevenire malignizare, agravare etc.
|
