UNIVERSITATEA OVIDIUS CONSTANTA
FACULTATEA DE MEDICIN DENTARA SI FARMACIE
SPECILIZAREA FARMACIE
DISCIPLINA DE FARMACOGNOZIE
Susceptibilitatea de inductie
diferentiala a stilbenului
la 7 varietati de struguri rosii dupa
radiatia UV-C post recoltare
student: kazziz ammar
anul iii, grupa 3
indrumatori: s.l. drd. LAURA BUCUR
asist. univ. ANTOANELA POPESCU
Abstract.
Capacitate de inductie a stilbenului din 7 varietati de struguri ro-sii Tempranillo (TEM), Cabernet Sauvignion (CAS), Merlot (MER), Syrah (SYR), Monastrel (MON), Garnacha (GAR), si Carinena (CAR) expuse la iradiatii cu raze UV-C dupa recoltare este raportata pentru prima oara. Inductia transpiceatannolului, transveratrolului si viniferinelor, printre alti stilbeni a fost caracterizata folosind lichid de cromatografie de inalta performanta. Toate varietatile de vinuri si-au crescut concentratiile de resveratrol, piceatannol si viniferine dupa tra-tamentul cu radiatii UV-C cu exceptia varietatii MON in care numai piceatannolul a fost inclus. Alti stilbeni ca astringinul (glucozida pi-ceatannolului) sau piceidul (glucozida resveratrolului) au fost induse mai putin si numai in anumite varietati. Capacitatea de inductie de stil-beni din strugurii supusi la iradiatii UV-C nu au corespuns la maxi-mul de continut in stilbeni din fiecare varietate.
Capacitatea totala de stilbeni din struguri a variat de la 2,4 fold in MER la 10,9 fold in CAS si CAR in comparatie cu strugurii netra-tati (control). Continutul total de stilbeni (mg stilbeni/ 100g struguri proaspeti) dupa iradiatia UV-C a variat de la 1,16 in MON si 3,5 in MER. In general inductia maxima a stilbenilor specifici in toate varie-tatile au urmat aceasta secventa: resveratrol > piceatannol > ε1viniferin > piceid. Aceasta inductie maxima a fost de 22,7 fold pentru resvera-trol in CAS, 6,4 fold pentru piceatannol in CAR, 3,8 fold pentru piceid in TEM si 8,4 fold pentru ε1viniferin in CAS si CAR in comparative cu controlul.
Concentratia maxima a stilbenilor specifici dupa iradierea cu UV-C a atins nivelul de 2,5(mg stilben/100g struguri proaspeti) pentru resveratrol in MER, 0,42 pentru piceatanol in mer, 0,16 pentru pi-ceid in MON si 0,39 pentru ε1viniferin in CAR. Ecranarea capacitatii de inductie a stilbenului in strugurii rosii tratati cu iradiatie UV-C poa-te fi utila pentru selectarea varietatii celei mai potrivite pentru a pro-duce vinuri rosii imbogatite cu stilbeni pentru cresterea proprietatilor benefice pentru sanatate.
Introducere
S-a demonstrat ca anumiti compusi fenolici detin proprietati be-
nefice pentru sanatate ca si capacitatea de antioxidant, inhibitia de li-poproteine cu densitate mica, oxidarea. De fapt consumul de surse bo-gate in compusi fenolici ca fructele si legumele a fost corelat cu inci-denta mai mica de boli cardiovasculare si unele tipuri de cancer.
Strugurii si produsii sai derivati, ca vinul, sunt surse dietetice im-portante cu continut ridicat in polifenoli. Un grup important de polife-noli bioactivi prezenti in vin sunt stilbenii. Resveratrol (3,5,4' trihi-droxi-trans-stilben) este cel mai studiat stilben de pana acum. Multe studii anterioare au raportat activitatea biologica a acestui polifenol, ca de exemplu activitatea estrogenica, efectul protector cardiovascular, capacitatea neuroprotectoare si activitatea chemoprofilactica impotri-va cancerului. Piceatanolul (3,5,3',4'-tetra hidroxitransstilben), un resveratrol analog a demonstrat proprietati anticancerigene si cardio-protectoare. In plus, viniferinele, polimerii resvera-trolului au fost fo-losite in medicina ca medicamente anti-inflamatoare.
Stilbenii sunt fenoli non-flanoidici apartinand grupului fitialexi-ne, de exemplu molecule induse in raspunsul la stres, ca agent pato-gen, tratamentul cu ozon, iradierea cu UV-C inainte si dupa recoltare.
Vinul si strugurii sunt considerati a fii cele mai importante surse alimentare de stilbeni deoarece sunt absenti in majoritatea fructelor si legumelor. Un consum moderat de vin rosu (2 pahare/zi) sunt conside-rate un obicei sanatos.
Considerand potentiala utilitate a iradierii cu UV-C a strugurilor pentru a produce vinuri rosii imbogatite cu stilbeni, ecranarea capaci-tatii de inductie a stilbenilor din varietatile de vinuri rosii ar fi de mare interes. Aceasta ecranare nu a fost abordata anterior.
Scopul prezentei lucrari este de a caracteriza suscebilitatea de inductie a stilbenilor din 7 varietati de vinuri rosii (Tempranillo, TEM; Cabernet Sauvignion, CAS; Merlot, MER; Syrah, SYR; Monastrel, MON ; Garnacha, GAR si Carinene, CAR) dupa iradierea cu UV-C dupa recoltare.
Materiale si metode
Reactivi
Trans-resveratrol (3,5,4'trihidroxistilben ; 99%) si trans-piceatanolul (3,5,3',4'-tetrahidroxistilben ;100%) au fost procurate de la compania Sigma(Madrid, Spania). Acidul formic si metanolul (MeOH) au fost procurate de Merck (Darmstadt, Germania). Sistemul Mili-Q (Millipo-re Corp, Bedford, MA) cu apa ultra pura a fost folosit la acest studiu.
Struguri folositi la producerea vinurilor
Varietatile de vin rosu tem, cas, mer, syr, mon, gar si car au fost recoltate la momentul de maxima maturitate in regiunea Bullas (Murcia,Spania) in septembrie 2002. Aceste varietati acopera mai mult de 82% din strugurii folositi pentru producerea de vinuri in re-giunea Murcia.
Iradiatia UV-C
Grupurile de struguri au fost iradiate cu UV-C conform protocolului lui Cantos. Grupurile de struguri iradiate si netratate au fost depozitate la temperatura de 22°C in cutii perforate. Umiditatea relativa a fost de 90-95% in ambele cazuri. In fiecare zi un set din strugurii iradiati si din cei netratati au fost transferati pentru a fi depozitati la temperatura de 2°C pentru a urmari cinetica inductiva a stilbenului la temperaturile de 22°C si 2°C. Parametrul "zi maxima" a fost denumit ca numarul de zi necesar pentru a se ajunge la continutul maxim de stilbeni. Acest parametru a fost egal cu 6 pentru toti stilbenii in toate varietatile. Studiul a fost continuat dupa ce parametrul "zi maxima" a fost atins.
Continutul maxim in stilbeni a fost definit ca fiind continutul de stilbeni obtinut dupa tratamentul cu UV-C la "ziua maxima".
Capacitatea de inductie este definit ca fiind raportul dintre conti-nutul de stilben obtinut dupa tratamentul cu UV-C si continutul de stilbeni la "ziua maxima".
Extractia stilbenilor
Pericarpul strugurilor (3g) a fost omogenizat intr-un aparat Ultraturax T-25 (Janke si Kuntel, Ika-Labortechnick) la 24.000 rpm timp de 1 minut dupa ce s-au adaugat 6 ml acetat de etil. Pericarpul de la struguri a reprezentat aproximativ 11% din greutatea totala de struguri proaspeti din varietatile TEM, SYR, CAR si GAR. Aceasta proportie a fost 14% pentru MON si MER si de 22% pentru CAS. Acetatul de etil a fost folosit pentru a micsora interferenta antocianilor, polifenoli ce nu pot fii indusi de razele UV-C. In plus, folosirea acetatului de etil ne-a ajutat sa detectam agliconii si glucozidele stilbenilor. Apoi 2ml au fost extrasi au fost extrasi din supernatant concentrat sub vid, redizolvat in 0,5 ml MeOH, filtrat printr-o membrana filtrant de 0,45
μm Millex-HV 13 (Millipore Corp. sua) si apoi analizat printr-un lichid de cromatografie de inalta performanta si detectie spectrometrica.
Cromatografia cu lichid de inalta performanta si detectie spectrome-trica (HPLC-DAD-MS-MS)
Analizele au fost elaborate conform protocolului Cantos et. al. Separarea cromatografica a fost realizata intr-o coloana C18 LiChroCart (25x 0,4 cm, dimensiunea particulelor 5 μm, Merck (Darmstadt, Germania) folosind folosind apa: acid formic(95:5,v/v) (A) si MeOH (B) ca faze mobile. Detectorul de masa a fost un spectrometru de ioni (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania) echipat cu un sistem de ionizare prin pulverizare electrica si controlat printr-un software.
Idenificarea si cuantificarea stilbenilor
Stilbenii au fost identificati si cuantificati folosind procedura Cantos et.al. Stilbenii au fost identificati prin spectrul lor UV si prin spectrul MS. Piceatanol pur (m/z 243) si resveratrol (m/z 228) au fost folositi ca stilbeni standard si cuantificati la 320 nm.
Analiza statistica
Valorile medii de continut in stilben din strugurii tratati cu raze UV-C si cei netratati au fost comparate folosind diferenta cea mai mica utilizand programul SPSS 11.0 ( SPSS Inc, Chicago, IL).
Rezultate
Trans-resveratrol (3,5,4'trihidroxistilben ), si trans-piceatanolul (3,5, 3', 4'-tetrahidroxistilben), α- si ε- viniferine (polimerii resveratrolului)
au fost principalii stilbeni indusi dupa iradierea cu UV-C dupa recol-tarea celor 7 varietati de struguri tratate in acest studiu.
Aceeasi inductie cinetica a fost observata pentru toti stilbenii si in toate varietatile . Figurile 1 si 2 arata cresterea concentratiei de res-veratrol si viniferine pana in "ziua maxima" ca si stabilitatea acestor stilbeni in timpul perioadei de depozitare la 2°C din "ziua maxima". Cinetica inductiei resveratrolului, cel mai indus stilben este aratata in Fig 1. Capacitatea maxima de inductie nu a corespuns cu maximul de continut in stilbeni. De exemplu, inductia maxima a resveratrolului (23 fold) a fost obtinuta in varietatea CAS in timpul ce continutul ma-xim (2,5 mg resveratrol/100 g struguri proaspeti) a fost gasita in varie-tatea MER . Varietatea cu cea mai mica inductie in resveratrol a fost in MON. Viniferinele au fost induse semnificativ in toate varietatile cu exceptia MON. Viniferinele au fost identificate si cuantificate con-form spectrului UV, timpului de retentie, valorii m/z si fragmentelor MS/MS anterior descrise de Cantos et.al. Viniferinele au fost clasifi-cate in ε-viniferine (dimeri ai resveratrolului cu m/z de 679). Nomenclatura diferitelor viniferine, ca stilbenii a fost preluata de la Cantos et.al. ε0 -viniferina a fost detectata numai in MON. α1- viniferi-na a fost indusa semnificativ numai in varietatile MON, GAR si CAR.
ε1 -viniferina a fost indusa semnificativ in toate varietatile de struguri tratate cu raze UV-C cu exceptia MON. ε2 -viniferina a fost detectata in toate varietatile, dar nu i s-a putut determina coeficientul de induc-tie deoarece s-a gasit in cantitati foarte mici in strugurii netratati.
Cu privire la stabilitatea stilbenilor indusi in timpul perioadei de conservare a fost observata o descrestere brusca in continutul de res-veratrol. Concentratia de resveratrol in timpul celor 6 zile de conserva-re la 2°C s-a diminuat cu 4 fold pentru tem, cas si mer si cu 2 fold pentru SYR si GAR. Numai varietatile CAR au aratat descrestere mai mica. Acest comportament a fost comun pentru toti stilbenii in timpul perioadei de conservare cu exceptia viniferinelor, care au aratat un continut constant la temperatura de 2°C.
Alti stilbeni ca trans-piceid si trans-astringin au fost de asemenea cuantificati cu toate ca au fost indusi in anumite varietati. In plus, alti stilbeni minor ca 'piceid b' si pterostilben au fost detectati prin HPLC- DAD-MS-MS, dar nu au fost cuantificati datorita concentratiei lor mici. Piceid a fost gasit in toate varietatile de vinuri, dar continutul sau crescut semnificativ doar in TEM, SYR GAR si CAR. Piceid b, descris anterior in tabelul varietatilor de struguri a fost cuantificat numai in varietatea MON (80μg/100g fw). Piceatanol a fost indus semnificativ in toate varietatile de struguri cu o maxima inductie in CAR (6,4 fold) si continut maxim de 0,42mg/100g fw in TEM si CAS pana la 50μg/100g fw in MON. Cis-resveratrol si cis-piceid nu au fost gasite in varietatile de struguri.
Discutie
Capacitatea de inductie a stilbenilor dupa iradiatia cu raze UV-C post-recoltare a fost raportata anterior. Insa nu exista studii anterioare cu privire la capacitatea de inductie a stilbenilor prin iradiatia cu raze UV-C in varietatile de struguri. Cinetica inductiei stilbenilor in varie-tatile de struguri au aratat acelasi comportament ca cel din tabelul cu varietatile de struguri. Capacitatea de inductie a stilbenilor din strugu-rii pentru vinuri a fost mult mai mica cea pentru strugurii de masa. Continutul final de stilbeni atins dupa iradiatia cu UV-C a fost aproxi-mativ egala atat in strugurii de masa cat si cei din productia de vinuri.
Continutul anterior in resveratrol din varietatile de CAS si MER nu este egal cu cel obtinut de noi. Aceasta diferenta poate fi explicata prin originea diferita si a speciilor studiate.
Piceid-ul a fost detectat in toate varietatile de strugurii de vin, in studiile anterioare poate fi gasit numai in strugurii de masa. Continutul in piceatanol si astringin a fost mai mare in strugurii de masa.
Continutul total de viniferine a fost aproximativ egal in strugurii de masa si cei pentru vinuri. O noua ε-viniferinaa a fost descrisa in va-rietatea MON pentru prima data.
Stabilitatea stilbenelor indusi cu raze UV dupa ce parametrul "zi maxima" a fost atins, a aratat rezultate diferite in strugurii de vin fata de cei de masa. Scaderea in stilbeni, in special resveratrol a fost mai pronuntata la strugurii de vin decat in cei de masa.
O concentratie totala in compusi fenolici de 2000 si respectiv 2600 mg/dl a fost descrisa pentru vinurile rosii derivand de la varietatile cas si mer si un continut total de 3 si respectiv 9 mg/dl. A fost studiat si riscul potential de consum a unei cantitati mari de stilbeni. Acest studiu a concluzionat ca un consum de doze mari de resveratrol nu a fost toxic pentru sobolani mai in varsta de 28 zile. Acest studiu prezinta noi date referitoare la tipul si continutul in stilbeni in varietatile de struguri.
Conform rezultatelor noastre, este importanta alegerea varietatii de struguri pentru producerea unui vin bogat in stilbeni, si prin urmare, cu proprieti cu valoare terapeutica crescute.
|
