Aplicatii ale transgenezei la plante
Speciile vegetale prezinta o mare diversitate genetica, iar cele salbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obtine gene importante din punct de vedere practic.
Cercetarile de inginerie genetica la plante prezinta o senmificatie teoretica deosebita, facilitand cunoasterea modului de actiune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltarii plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Mayer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie moleculara se pot obtine informatii utile asupra particularitatilor genomului plantelor folosite in ameliorare, a localizarii unor gene de interes, a gradului de inrudire dintre diferite specii, etc. (Greshoff, 1994; Edwards si Kar 636f54g p, 1997).
In ceea ce priveste aplicatiile practice, pana in prezent au fost obtinute o serie de rezultate senmificative, unele aplicate deja in practica asa cum sunt: plantele transgenice rezistente la viroze, la atacul unor daunatori, la ierbicide, plante transgenice de interes horticol, plante transgenice capabile sa sintetizeze metaboliti secundari in cantitati crescute si plante transgenice producatoare de anticorpi 'comestibili' etc.
In continuare sunt prezentate cateva dintre tipurile de aplicatii, insistandu-se pe cele care au un potential aplicativ spectaculos.
1. Protectia plantelor fata de atacul insectelor
Pierderile inregistrate anual de productia agricola globala datorita atacului, insectelor daunatoare sunt estimate la aproximativ 14%, in timp ce raportat la unele specii vegetale in parte pierderile sunt mult mai mari: 52% la grau, 83% la orez, 59% la porumb, 74% la cartofi, 58% la soia si 84% la bumbac (Oerke si colab., 1994). Insectele determina scaderea productiei agricole atat prin actiune directa cat prin actiune indirecta, ca vectori ai unor fitopatogeni variati. Limitarea actiunii acestora se realizeaza prin folosirea pesticidelor, estimata la un cost de aproximativ 10 miliarde de USD anual.
Obtinerea de plante rezistente la daunatori reprezinta poate domeniul cel mai spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante, deoarece a permis regenerarea de plante transgenice care contin gene de origine bacteriana ce le asigura protectie fata de anumite insecte daunatoare. Aceasta asigura, pe de o parte, obtinerea de recolte mai bogate si, pe de alta parte, reducerea cheltuielilor fermierilor pentru pesticide.
In ultimii ani, au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistenta la atacul insectelor, transferabile la plante. Dintre acestea sunt de amintit: gene ce codifica producerea 5-endotoxinei de la- Bacillus thuringiensis, gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici; gene de la plante ce codifica sinteza unor lectine specifice; gene care detennina inducerea sintezei unor compusi vegetali de tipul fitoalexinelor etc.
1.1. Genele pentru b-endotoxina de
Dupa descoperirea sa in 1901 de catre Ishiwata,
aceasta bacterie a fost supusa unor cercetari asupra producerii unor substante
inhibitorii pentru insecte, astfel ca in
In elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observatia ca exista un grup de bacterii Gram pozitive, apartinand speciei Bacillus thuringiensis, care produc o toxina, numita delta-endotoxina sau proteina cristal, capabila sa omoare o gama larga de insecte (coleoptere, lepidoptere, diptere), in functie de tulpina bacteriana. De mare interes este tulpina B.thuringiensis var.tenebrionis care sintetizeaza o 8-endotoxina eficienta impotriva gandacului de Colorado. Genele implicate in sinteza acestei proteine sunt localizate, la majoritatea tulpinilor bacteriene, pe plasmide de dimensiuni mari (75 kb), producerea toxinei facandu-se in cursul sporularii.
De asemenea, s-a dovedit ca proteina cristal (5-endotoxina) este exprimata, in mod normal, ca o pro-toxina inactiva, de dimensiuni mari, care sufera o prelucrare proteolitica in intestinul insectei sensibile, devenind toxina activa.
Aceasta recunoaste receptorii specifici de la nivelul celulelor intestinale si blocheaza functiile acestor celule, ceea ce conduce la moartea insectelor.
Studiile asupra genelor ce codifica proteinele inhibitoare produse de Bacillus thuringiensis au condus la gruparea acestora in patru tipuri pe baza specificitatii de actiune (de tipul insecta tinta) si a secventei de nucleotide:
Ø genele cry de tipul I codifica proteine de 130kDa specifice pentru larvele de lepidoptere;
Ø genele cry de tipul II codifica proteine de 70kDa active asupra larvelor de diptere si lepidoptere;
Ø genele Cly de tipul III codifica proteine de 70kDa cu actiune specifica asupra larvelor de coleoptere;
Ø genele cry de tipul III codifica proteine inhibitorii pentru larvele de diptere.
S-a reusit obtinerea genelor pentru proteina cristal de la mai multe tulpini de B.thuingiensis prin amplificare genetica (PCR). Deoarece s-a dovedit ca gena specifica pentru proteina cristal se exprima foarte slab in celulele vegetale transformate, s-a realizat o gena modificata, ce contine doar informatia pentru portiunea N-terminala a proteinei (aminoacizii 1-645). Mai mult, pentru a mari exprimarea genei in plante, secventa naturala pentru aminoacizii 1-415 bogata in AT a fost inlocuita de o secventa sintetica, bogata in GC, ce contine codonii preferati de celulele vegetale. Aceste gene recombinate au fost introduse in vectori derivati de la plasmida Ti (vectori binari ce contin promotorul CaMV duplicat, fapt ce mareste de 5 ori procesul de transcriere si gene marker de selectie-pentru rezistenta la antibiotice sau la erbicidul fosfinotricin), transferate in celule de A.tumefaciens ce contin plasmide Ti dezarmate.
Tulpinile bacteriene recombinate au fost apoi utilizate pentru infectarea plantelor test (cartof, tutun, bumbac). Selectia s-a realizat mai intai in functie de markerii de selectie purtati de vectori, iar in final, plantele regenerate au fost supuse atacului insectelor. Plantele transgenice regenerate au manifestat rezistenta la atacul insectelor daunatoare, caracterul mentinadu-se si exprimandu-se si in cazul experimentelor in camp.
Prima planta transgenica obtinuta care manifesta rezistenta la atacul insectelor apartine speciei Nicotina tabacum (Vaeck si colab., 1987), ea exprimand gena crylA, intreaga sau trunchiata, clonata sub controlul unui promotor constitutiv astfel incat proteina inhibitoare reprezinta 0,02% din totalul de proteine vegetale (din frunze).
Fujimoto si colab. (1993) au utilizat o metodologie asemanatoare pentru a transforma plante de orez, iar Perlak si colab.(l993), prin donarea unei gene cry III sintetica au obtinut plante transgenice de tutun si cartof rezistente la atacul gandacului de Colorado.
Mai recent, Arencibia si colab. (1997) au utilizat pentru donare o gena modificata cry IA(b) sub controlul promotorului CaMV si au obtinut plante transgenice de trestie de zahar cu rezistenta la larvele de Diatraea saccharalis.
Data
fiind semnificatia practica a rezistentei plantelor la insectele daunatoare,
cercetarile au fost extinse si la alte specii de plante, obtinandu-se plante de
vinete rezistente la atacul unor coleoptere (Arpaia si colab., 1997), brocoli
cu rezistenta la anumite specii de lepidoptere (Selvapandian si colab., 1998),
porumb cu rezistenta
1. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect de insecticid
Exprimarea de catre plantele transgenice a unor enzime, cum ar fi chitinaza, colesterol oxidaza, lipoxigenaza, fenol-oxidaza, peroxidaza sau izopentenil transferaza (ipt) ar putea constitui o alternativa la utilizarea genei pentru d-endotoxina (Shanna si colab.,2000).
Dintre enzimele care pot asigura protectie plantelor transgenice fata de atacul insectelor, un loc aparte este ocupat de chitinaze, enzime ce actioneaza asupra chitinei, component de baza al inve1isurilor insectelor. Astfel, plantele transgenice de tutun care exprima gene pentru chitinaza izolate de la insecte (Ding si colab, 1998) sau de la fasole (Gatehouse si colab., 1993) manifesta o rezistenta crescuta la lepidoptere.
O
alta enzima de origine bacteriana care manifesta actiune insecticida este colesterol oxidaza. Spre exemplu,
introducerea si exprimarea genei cho A pentru colesterol oxidaza de
Utilizarea pentru clonare a genei pentru enzima izopentenil transferaza (ipt) bacteriana prin fuziune cu promotorul genei pentru inhibitorul proteazic II a determinat obtinerea unor plante transgenice de Nicotina plumbaginifolia rezistente la actiunea larvelor unor lepidoptere specifice (Smigocki si colab., 1993)
O serie de gene ce codifica diferiti inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate din diferite surse (plante, microorganisme) si clonate in diferite specii vegetale, cum ar fi Medicago sativa, tutun, porumb etc; plantele transgenice obtinute au manifestat o rezistenta crescuta fata de diferite insecte daunatoare romparativ cu plantele normale, nemodificate genetic (Edmonds si colab., 1996; Yeh si colab., 1997).
Ca o concluzie se poate spune ca, in ciuda rezultatelor remarcabile obtinute pana acum, genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultura sunt fie prea specifice, fie doar partial efective asupra tinte1or reprezentate de insectele daunatoare. De aceea, pentru a folosi plantele transgenice ca adevarate 'arme' pentru controlul daunatorilor ar fi necesar ca la nivelul lor sa existe transgene care sa determine sinteza unor compusi cu actiuni diferite asupra aceleiasi tinte.
De asemenea, desi s-au obtinut plante transgenice cu rezistenta la daunatoare in cazul mai multor specii de plante cultivate, mai putine rezultate au fost raportate in cazul cerealelor, a legumelor si a plante1or oleaginoase. Mai mult, in cazul acestor plante sunt necesare studii suplimentare referitoare la siguranta lor, la posibila toxicitate pentru om si animale, a implicatiilor ecologice ale utilizarii lor si, nu in ultimul rand la pretul de cost care trebuie sa fie accesibil fermierilor si tarilor sarace (Riva si colab., 2000).
1.3. Gene de rezistenta la fitopatogeni microbieni, virali si la nematode
Rezistenta plantelor la diferite boli a constituit un subiect pentru studii efectuate de multa vreme, reusindu-se identificarea unui numar relativ mare de gene de rezistenta. Desi s-a crezut ca genele endogene de rezistenta ar asigura un efect durabil pentru plantele corespunzatoare, doar in foarte putine cazuri acest, lucru a fost adevarat. De exemplu, in cazul cartofului, programul de control al anumitor boli, cum este putregaiul provocat de Phytophtora infestans a trebuit abandonat deoarece rezistenta la aceasta boala a plantelor de cartor obtinute prin transferul celor 11 gene de rezistenta pe baza incrucisarilor cu specia salbatica Solanum demissum s-a dovedit a fi scurta durata (Landeo si colab., 1995). De asemenea, identificarea eventualelor gene de rezistenta in genomul diferitelor specii vegetale si transferul lor la alte plante de cultura este extrem de dificila si consumatoare de timp daca se utilizeaza metode traditionale (hibridarile intra- si interspecifice).
Plante transgenice producatoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi
Progresele inregistrate in ultimii 10 ani in biologia moleculara si in domeniul imunologiei au permis o mai buna intelegere a numeroase boli si au condus la dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare. Una dintre directiile promitatoare in acest sens este obtinerea de plante transgenice in care sa se exprime gene pentru diferiti antigeni. Proteinele antigenice derivate de la plantele transgenice elimina sau previn unele boli la animale, iar in testele clinice in cazul oamenilor ele s-au dovedit a fi sigure si functionale (WalmsJey si Arntzen, 2000). S-a dovedit ca raspunsul imun al unui organism fata de un anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din structura epitopilor agentilor etiologici (Vior, 2000). In acest sens au fost elaborate tehnologii de obtinere a vaccinurilor subunitare care au avantajul ca elimina utilizarea de virusuri 'vii' sau de microorganisme patogene active, dar dezavantajul ca sunt termosensibile si foarte scumpe.
Producerea unor asemenea vaccinuri in plante elimina unele impedimente curente: pretul de cost ar fi mic, se elimina riscul contaminarii de patogeni animali, se asigura o stabilitate pentru produsul obtinut, iar administrarea se poate face pe cale orala si nu prin injectare.
Primele testari c1inice ale unui vaccin produs de plante au fost realizate in 1998, prin demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat produs de plante transgenice de cartof: administrarea 'vaccinului' comestibil a condus la inducerea unui raspuns imun la nivelul mucoaselor (Tacket si colab., 1998).
Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile 'comestibile' produse de plante transgenice tin de stabilirea metodelor optime de administrare si dozare, a tipului de raspuns imun, si a duratei sale in cazul patogenilor de tipul Vibrio dzolerae, Pseudomonas aeruginosa, HIV sau virusul hepatitei murine (Mason si colab., 1998).
Experimente
recente efectuate de Brennan si colab. (1999) au evidentiat posibilitatea
folosirii unor proteine antigenice derivate de
O a doua strategie interesanta este clonarea in plante a genelor ce codifica sinteza unor anticorpi specifici, pentru obtinerea de 'anticorpi monoclonali vegetali'. Producerea primului tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descrisa de Hiatt si colab. (1989). Plantele transgenice au fost obtinute prin utilizarea sistemului de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens.
S-a dovedit ca anticorpii functionali au fost produsi doar atunci cand moleculele de ADNc ce codifica cele doua tipuri de catene ale unui anticorp contin o secventa senmal derivata de la genele pentru anticorpi de soarece. Acest fapt sugereaza ca echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoaste secvente 'leader' heterologe, permitand exprimarea genelor clonate sub controlul lor. Desi promitatoare, aceste experimente sunt abia la inceput, fiind necesare studii suplimentare In vederea optimizarii producerii unor asemenea compusi de catre celulele vegetale, la nivel de bioreactor sau direct in camp, la un pret de cost convenabil (Whitelam si colab., 1994).
3. Plante transgenice folosite pentru cercetari asupra unor procese fiziologice fundamentale
Formarea tesuturilor tumorale ca urmare a introducerii unor gene bacteriene in genomul vegetal prin transformarea realizata de bacteriile din genul Agrobacterium constituie un exemplu de modificare genetica naturala a procesului si biosinteza a fitohormonilor.Astfel, prin integrarea in genomul plantelor gazda a genelor bacteriene care induc sinteza anormala a acidului indolilacetic (IAA) si a citokinelor (CK) determina proliferarea necontrolata a celulelor vegetale. Utilizarea drept plante test a speciilor Arabidopsis thaliana si Nicotina tabacum au evidentiat faptul ca exista mai multe cai posibile de biosinteza ale IAA, unele implicand triptofanul ca intermediar, iar altele presupunand implicarea indolului sau a unor alti precursori timpurii.
In concluzie, prelucrarea genelor ce codifica enzimele implicate in biosinteza fitohormonilor demonstreaza posibilitatea obtinerii de plante transgenice care sa prezinte niveluri mai ridicate sau mai scazute ale acestor hormoni, in functie de scopul urmarit cu aceste plante.
4. Clonarea genelor in celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul Agrobacterium
Pentru evidentierea particularitatilor procesului de clonare in celulele vegetale vor fi prezentate in continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum si elementele specifice ale vectorilor de clonare si a markerilor de selectie pentru celulele vegetale.
4.1. Particularitatile bacteriilor din genul Agrobacterium
A.tumefaciens si A.rhizogenes sunt bacterii ce traiesc in sol, ele fiind capabile de a produce boli unor specii de plante dicotiledonate si gimnosperme. S-a dovedit ca tulpinile de A.tumefaciens determina aparitia unor tumori de tip 'crown gall' pe tulpinile ranite ale unor plante (in special la nivelul coletului), in timp ce tulpinile de A.rhizogenes induc formarea de radacini adventive (de tip 'hairy') la nivelul tesuturilor vegetale ranite.
Modificarile morfogenice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de A.tumefaciens si A.rhizogenes se datoreaza transferului unor gene de origine bacteriana in celulele vegetale. Bacteriile din genul Agrobacterium prezinta un sistem genetic organizat care permite introducerea de gene noi in celula vegetala, gratie prezentei in celula lor a unei plasmide Ti ('tumor inducing') sau Ri ('root inducing'), ce reprezinta factorul determinant al producerii tumori lor, respectiv'al radacinilor anormale, la plante. Transferul unei portiuni din aceste plasmide in genomul celulei vegetale determina modificari functionale, ce se concretizeaza prin aparitia fenomenului tumoral. Aceste plasmide constituie un sistem organizat si complex de transfer de informatie genetica naturala in celula vegetala, fara influenta asupra echilibrului ecologic.
In principiu, plasmidele Ti contin mai multe regiuni, cu functii distincte: regiunea ADN- T (continand genele de tumorigeneza), regiunea de virulenta (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controleaza transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc.
4.Regiunea de virulenta cuprinde gene esentiale pentru transferul de ADN bacterian in celulele vegetale, fara a fi insa ele insele transferate. Regiunea vir cuprinde un segment de aproximativ 30-40kb (in functie de tulpina bacteriana), fiind formata din mai mult de 20 de gene organizate in cel putin sase unitati transcriptionale (operonii): virA(o gena), virB (11 gene), virC (2 gene), virD(4 gene), virE (2 gene) si virG (o gena) (Weising si Kahl, 1996). Toti acesti operoni sunt indusi in prezenta celulelor vegetale ranite, functiile lor fiind urmatoarele:
Ø virA si virG codifica proteine responsabile de recunoasterea celulelor vegetale ranite si de inducerea celorlalte functii vir;
Ø virC si virD codif1ca proteine ce asigura formarea unei copii de ADN-T monocatenar, transferabil in celula vegetala;
Ø virD si virE codifica proteine ce formeaza un complex impreuna cu ADN-T ghidandu-l spre nucleul celulei vegetale;
Ø virB codifica proteine ce raspund de transportul ADN- T proteine prin membrana plasmatica bacteriana.
Exprimarea genelor localizate in regiunea de virulenta a plasmidelor Ti este inductibila, fiind reglata de actiunea unor factori din exterior.
Experimental s-a demonstrat ca, sub actiunea unor molecule semnal din exsudatele plantelor sau la nivelul ranilor produse la plante are loc o puternica activare a acestor gene. Aceste molecule semnal sunt compusi fenolici de tipul acetosiringonei sau a al fahidroxiacetosiringonei, care au actiune asupra genelor reglatoare virA si virG.
Produsii acestor gene sunt asemanatori cu alte proteine membranare bacteriene cu rol in reglare.
Alaturi de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene, localizate la nivelul cromozomului bacterian implicate, se pare, intr-o mai mica masura in procesul de transformare genetica.
Dintre aceste gene mentionam: genele chvA si chvB implicate in sinteza si secretia beta-1,2 glucanului; gena chvE necesara pentru inducerea regiunii vir si pentru chemotactismul bacterian; locusul cel responsabil de sinteza fibrinelor de celuloza implicate in atasarea bacteriilor la celulele vegetale; gena psA (exoC) implicat in sinteza glucanului ciclic si a acidului succinoglicanic; locusul alt implicat in sinteza unor proteine celulare de suprafata
4.3. Mecanismul transferului ADN-T in celula vegetala
Primele etape ale interactiunii dintre plante si celulele de Agrobacterium sunt urmatoarele:
Ø celulele vegetale ranite elibereaza o serie de compusi fenolici (ex.acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic) care servesc drept chemoatractanti pentru agrobacterii;
Ø recunoasterea celulelor ranite si atasarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a exprimarii constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare bacteriana;
Ø inducerea functiilor vir plasmidiale si inceperea procesului de transfer al ADN-T in doua etape: una ce se desfasoara in celula bacteriana si o alta ce are loc in celula vegetala.
Etapa bacteriana include evenimentele ce conduc la producerea si exportul ADN-T incepand cu activare a functiilor vir plasmidiale de catre compusii fenolici sau glucidici eliberati din celulele vegetale ranite. Pentru ca ADN- T sa fie transferat este necesara prezenta secventelor marginale de 25pb si cel putin in cazul unor anumite plasmide Ti, existenta unui element suplimentar localizat in afara ADN- T ('overdrive').
Proteina virD2 recunoaste marginile ADN-T si le cliveaza generand un segment de ADN monocatenar lung de aproximativ 20kb, simultan avand loc sinteza catenei lipsa.
Pentru a ajunge in nucleul celulei vegetale, complexul ADN-T-proteine traverseaza membrana plasmatica si spatiul periplasmic bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale si membrana nucleara.
Rolul proteinelor vir este complex: pe de o parte protejeaza ADN-T de atacul exonucleazelor, asigura transportul intr-o forma corespunzatoare si participa la fonnarea unor pori la nivelul membranei plasmatice si la nivelul membranei externe a bacteriei. La procesul de translocare mai participa si proteinele codificate de operonii suplimentari virF si virH cu rol in directionarea complexului ADN-T spre nucleul celulei vegetale.
Odata patruns in citoplasma celulelor vegetale, complexul T (ADN si proteine) este preluat de proteinele vegetale si transportat in nucleu, unde ADN-T este integrat in genom.
Integrarea ADN- T in genomul celulei vegetale
Ultima etapa a procesului de transformare genetica a plantelor este integrarea ADN- T in genomul celulei vegetale.Date recente au evidentiat ca, dupa integrare, ADN- T adopta trasaturile cromatinei eucariote: formarea de nucleosomi si sensibilitatea la actiunea DN-azei.Acest din urma aspect sugereaza o integrare preferentiala la nivelul regiunilor din genomul vegetal care sunt transcrise (Kahl si colab., 1987).
De asemenea, o serie de date experimentale au condus la concluzia ca integrarea ADN- T are loc atat la nivelul exonilor cat si la nivelul intronilor fara a fi observata vreo preferinta pentru una sau alta dintre secvente. Mai mult, cercetari recente au aratat ca integrarea ADN-T s-ar realiza la nivelul unor 'puncte fierbinti' din genomul vegetal: la nivelul zonelor unde ADN au suferit unele modificari si unde este necesara interventia enzimelor implicate in procesul reparator (Tinland, 1996).
Patrunderea complexului ADN- T este facilitata de proteinele insotitoare virD2 si virE2, la care se adauga si proteina virF, cu rol mai mic in acest proces.
Mecanismul exact al integrarii ADN-T in genomul vegetal nu a fost clarificat, dar se considera ca integrarea se realizeaza prin recombinare nelegitima (Finberg si colab.,1995; Puchta, 1998).
Sintetizand datele de pana acum se pot enunta cateva concluzii referitoare la procesul de integrare:
Ø integrarea ADN- T nu este situs-specifica si nu necesita prezenta in ADN vegetal a unor secvente omoloage, fiind deci vorba de un proces de recombinare 'nelegitima';
Ø integrarea ADN- T conduce la aparitia unor mici deletii (13-73pb) ale ADN vegetal, la nivelul situsului de insertie;
5. Vectori de clonare pentru celula vegetala
Pentru realizarea transferului eficient de gene in celulele vegetale tinta au fost construiti vectori de donare specifici, de obicei derivati de la plasmidele Ti sau Ri sau de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale.
5.1. Vectori plasmidiali
Sistemul natural de transfer este impropriu pentru a fi utilizat, ca atare, in scopul ameliorarii plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost modificate drastic, prin eliminarea genelor ce detelmina producerea tumorilor, prin mentinerea si clonarea in alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale si a unor promotori ce sunt recunoscuti de echipamentul de transcriere al celulelor vegetale. De asemenea, intre extremitatile ADN-T prelucrat, au fost introduse gene marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunzatori (tnos, P35S), obtinandu-se vectori de clonare foarte eficienti.
O alta strategie in transferul de gene in celula vegetala o constituie utilizarea, vectorilor 'binari', in care regiunile vir si ADN-T sunt separate fizic pe plasmide diferite. S-au obtinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide, ambele capabile de replicare in Agrobacterium :
Ø o plasmida Ti modificata, dezarmata total (fara ADN-T) ce contine genele vir;
Ø o plasmida cu spectru larg de gazda (o plasmida tip 'naveta', capabila de replicare in E.coli si in A.tumafaciens), ce contine gena ce trebuie introdusa in celula vegetala, impreuna cu un marker de selectie pentru celulele vegetale transformate.
5. Vectori virali
Desi se cunoaste ca Agrobacterium tumefaciens nu infecteaza monocotiledonatele, prin prelucrarea plasmidei Ti a ADN-T, in sensul introducerii intre marginile acestei regiuni a genomului virusului variegarii pommbului sau a CaMV, s-a reusit transferul respectivelor gene la cereale. Acest tip de infectie a primit denumirea de agroinfectie.
In ultimii ani, pentru obtinerea de plante transgenice au fost testati si vectori derivati de la diferite virusuri specifice plantelor. Desi la animale cei mai utilizati vectori sunt cei derivati de la retrovirusuri, la plante acest lucru nu s-a realizat pentru ca virusurile ce infecteaza plantele sunt mai putin cunoscute la nivel molecular. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se numara: virusul mozaicului amopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV), virusul piticismului la grau (WDV), virusul mozaicului galben al tomatelor (TGMV) etc.
6. Modalitati de introducere a genelor de interes in celulele vegetale
Pentru introducerea vectorilor de donare recombinati in celulele vegetale tinta au fost elaborate numeroase metode, a caror eficienta variaza in functie de specia vegetala testata sau de tipul de tesut utilizat in experimente. Dintre acestea mentionam:
Ø metoda co-cultivarii celulelor bacteriene A. Tumefaciens sau A.rhizogenes ce contin vectori de clonare specifici) cu fragmente de tesut vegetal, cu suspensii celulare vegetale, cu protoplasti vegetali, cu lastari sau chiar cu seminte;
Ø electrotransformarea celulelor vegetale (tesut intact, celule intregi sau protoplasti) folosindu-se ADN plasmidial modificat;
Ø transformarea directa a protoplastilor vegetali cu ADN plasmidal purificat dintr-o gazda bacteriana;
Ø microinjectarea ADN in celule sau in tesutul conducator (macroinjectarea);
Ø metoda biolistica (bombardarea celulelor vegetale cu microproiecti1e reprezentate de particule de tungsten sau aur coloidal acoperi te cu ADN de interes);
Ø utilizarea lipozomilor care sa asigure protejarea ADN de interes fata de actiunea nucleazelor celulelor transfonnate.
|
