Biomateriale pe baza de colagen tratate cu nanoparticule metalice cu proprietati antibacteriene

PROPUNERE PROIECT DE CERCETARE STIINTIFICA

REFERAT DE LITERATURA

Biomateriale  pe baza de colagen tratate cu nanoparticule metalice cu proprietati antibacteriene

CUPRINS:

1        Biomateriale pe baza de colagen: piei si blanuri

1.1     Colagenul. Compozitia chimica si structura supramoleculara

1.1.1 Structura primara

1.1.2 Structura secundara

1.1.3 Structura tertiara

1.1.4 Structura cuaternara

1.2     Cheratina

1.3     Elastina

2        Tehnologia de prelucrare a pieilor animale

3        Proprietatile colagenului

3.1     Interactiunea colagenului cu apa, acizii, bazele si sarurile neutre

3.2     Interactiunea colagenului cu enzime

3.3     Reticularea colagenului

3.4     Reactii de grefare

3.       Propunere proiect de cercetare stiintifica

1  BIOMATERIALE PE BAZA DE COLAGEN: PIEI SI BLANURI

Pieile si blanurile naturale reprezinta biomateriale cu structura complexa, pe baza de colagen.

In compozitia fizico-chimica si structurala a pielii animale, cea mai mare pondere o au apa si proteinele, dupa cum se poate vedea in schema privind compozitia pielii neprelucrate (schema 1).

ALBUMINE/ GLOBULINE

PIELE

						MUCINE-MUCOIDE

Schema 1- Compozitia pielii animale

1.1 COLAGENUL. COMPOZITIA CHIMICA SI STRUCTURA SUPRAMOLECULARA

Colagenul este un polimer natural format prin polimerizarea a 20 de aminoacizi, aranjati in secvente caracteristice pentru molecula de colagen, ce are o structura conformationala unica de triplu helix.

K. Lindeström-Lang, Bernal si colab. [1] propune clasificarea ordonarii structurale a proteinelor, pentru a intelege structura complicata a colagenului, astfel:

a. structura primara reprezinta inlantuirea aminoacizilor in catenele polipeptidice ale macromoleculei de colagen;

b. structura secundara – se refera la un singur lant polipeptidic (helix minor orientat de la stanga spre dreapta) din triplul helix al moleculei de colagen;

c. structura tertiara – este reprezentata de molecula de colagen alcatuita din trei lanturi a  rasucite impreuna de la dreapta spre stanga, in jurul unui ax comun, realizandu-se astfel un triplu helix sau helixul major;

d. structura cuaternara – reprezinta modul de agregare a macromoleculelor de colagen la formarea fibrilelor, fibrelor si tesutului colagenic.

Structura primara

In compozitia colagenului, aminoacidul glicina (Gly) reprezinta aproximativ 33%, iar aminoacizii prolina (Pro) si hidroxiprolina (Hyp) reprezinta circa 22%.

In tabelul 1 sunt prezentati 252b17c cei mai importanti 20 aminoacizi care intra in compozitia colagenului [2].

Tabelul 1 - Cei mai importanti aminoacizi din structura proteinelor

Structura primara a colagenului [3] este determinata de secventa celor 20 de aminoacizi care „cladesc” prin legaturi peptidice mai intai catenele polipeptidice a-helix (structura secundara), iar apoi, prin intermediul a-helixurilor se formeaza suprastructura macromoleculara tertiara si cuaternara.   

Figura 1 - Formarea legaturii peptidice prin reactia dintre gruparea carboxilica

a unui aminoacid cu cea aminica a unui alt aminoacid

Colagenul este in esenta o politripeptida in lantul a-helix, avand glicina in fiecare a treia pozitie. Analiza secventelor colagenului nativ a pus in evidenta faptul ca lanturile polipeptidice pot fi asemanatoare cu un terpolimer pentru care este valabila urmatoarea formula  [1]:

H₂N – NC₁ – (Gly – X – Y)_n – NC₂ – COOH                                                                                [1]

unde:

NC₁ si NC₂ sunt telopeptide,

X este cel mai adesea prolina

Y hidroxiprolina

n = 100 – 400.

Un lant polipeptidic din molecula de colagen contine doua tipuri fundamental diferite de secvente de aminoacizi, care formeaza dimensiuni structurale:

- helicoidale, constituite din 1000-1050 aminoacizi, unde fiecare a treia pozitie este ocupata de glicina si

- nehelicoidale, cu regiuni terminale NC₁, respectiv NC₂, numite telopeptide, care nu mai includ restul de glicina in fiecare a treia pozitie.

Structura secundara

Catenele polipeptidice care intra in constitutia principalelor tipuri de colagen au o conformatie de tip a-elicoidal cristalina, situata in zona centrala a lantului macromolecular[3].

Pauling si Corey au emis ipoteza ca modalitatea cea mai probabila de indoire si rasucire a unui lant este cea helicoidala, sub forma unei spirale   (a-helix denumit si helix minor) cu rasuciri de la stanga spre dreapta [4]. Distanta dintre spirale este de 5,44Å.

Stabilitatea acestei structuri complexe se realizeaza prin legaturi de hidrogen de tipul NH····O=C intre grupele legaturilor peptidice ale aminoacizilor din spirele alaturate. Exista mai multe modele care aproximeaza conformatia reala [5, 6, 7].

In figura 2 se reprezinta schema unui helix de dreapta.

Figura 2 - Helix de dreapta

Parametrii geometrici ai a-helix-ului sunt relativ stabili la factori termodinamici. S-au evidentiat usoare intinderi si contractii ale sale, la modificarea concentratiei solutiilor, tariei ionice a mediului si temperaturii.

Structura tertiara

Macromolecula de colagen (tropocolagenul) [3] este alcatuita din trei lanturi a (2a₁+1a₂) rasucite impreuna de la dreapta spre stanga, ca intr-o funie, in jurul unui ax comun, realizandu-se triplul helix sau helix-ul major (figura 3). Aceasta structura confera macromoleculei o alura de bastonas rigid .

Sunt reprezentate trei α-helix-uri cu spirale ce se rotesc de la stanga la dreapta, iar α-helix-urile se infasoara impreuna de la dreapta spre stanga. Lanturile a si un lant a se deosebesc intre ele prin compozitia cantitativa in diferiti aminoacizi.

Lantul a₁ contine o cantitate mai mare de hidroxiprolina, prolina, alanina, fenilalanina si lizina, in timp ce acidul aspartic, valina, leucina, izoleucina si histidina apar in cantitati mai reduse.

Lanturile polipeptidice ce alcatuiesc molecula de colagen sunt legate prin legaturi transversale, legaturi de hidrogen in domeniul helicoidal si legaturi covalente in domeniul nehelicoidal, care cresc progresiv, pe masura maturarii (imbatranirii) proteinei.

Structura cuaternara

Modul de constituire si de crestere a fibrilelor de colagen ramane una din cele mai importante probleme biologice legate de colagen, cu implicatii in procesele de formare a tesutului conjunctiv [3].

 

Figura 4 Agregarea macromoleculelor de colagen

Mecanismul de agregare (polimerizare) a macromoleculelor de colagen in fibrile implica doua etape:

agregarea unidirectionala cap-cap a moleculelor (macromoleculelor) printr-un proces de polimerizare liniara, ducand la aparitia „protofi­brilelor”, structuri cu diametrul de 15 Å si lungime variabila;

agregarea laterala a protofibrilelor, determinand aparitia fibrilelor, fibrelor si fasciculelor de fibre. Fibrilele au diametre uniforme ce variaza in diferite tesuturi, a caror stadii de dezvoltare pot fi cuprinse intre 50Å si 2000Å.

1.2. CHERATINA

Cheratina face parte din categoria proteinelor fibroase prezente in piele, in special in par, lana si epiderma, dar si in copite si coarne. Cheratina prezenta in celulele pielii confera caracterul hidrofug si de rezistenta a acesteia [8].

            Din punct de vedere structural cheratina este compusa din doua molecule elicoidale rasucite, intre care exista legaturi de hidrogen (figura 5).

Figura 5 - Structura elicoidala a cheratinei

De regula chetratina este alcatuita din sapte resturi aminoacide care se repeta intr-o succesiune de tip a-b-c-d-e-f-g, in care a si d sunt nepolare, ceea ce genereaza o suprafata hidrofoba de-a lungul elicoidei.

Caracteristic este continutul mare al acesteia in sulf (3%), datorat continutului mare de cisteina din compozitie (11-12%). Cheratina este insolubila in apa si solutii saline, fiind inerta la multi agenti chimici si enzime. Se cunosc trei forme ale acestei proteine : a-cheratina, β-cheratina si o forma amorfa.

In a-cheratina, catena polipeptidica are forma unei elice si consta din repetarea a sapte resturi de aminoacizi (a-b-c-d-e-f-g), in care resturile a si d sunt de obicei nepolare, ceea ce confera hidrofobie. Din cauza configuratiei L a aminoacizilor care o compun, elicea a are sensul unui surub dreapta, iar resturile R ale aminoacizilor sunt proeminente spre exterior. Elicea a are forma unei scari in spirala, in care fiecare rest de aminoacid corespunde unei trepte. Inaltimea unei trepte este de 1.5 Å,  iar distanta dintre spire este de 5.4 Å. Intr-o spira intra 3.6 trepte, cea ce face ca dupa 18 trepte sa intalnim un rest de aminoacid exact in aceeasi pozitie, deci superpozabil, cu cel de la care s-a pornit. In aceasta structura grupa peptidica este plana  din cauza rezonantei, iar resturile de aminoacid sunt rotite unul fata de altul asa incat sa poata stabili legaturi intramoleculare, unind grupari NH si CO din spirele consecutive ale elicei. Aceste legaturi asigura o buna stabilitate intregii structuri (1.5 Kcal/leg), astfel ca o catena polipeptidica suficient de lunga adopta spontan conformatia elicei a

β- cheratina este compusa din straturi paralele de catene polipeptidice la distanta 9.7 Å unul de altul. Fiecare strat este compus din catene polipeptidice, orientate paralel si unite prin legaturi de hidrogen intre grupele CO si NH ale lor.

            Distanta de 4.6 Å dintre catene corespunde tocmai unor asemenea legaturi de hidrogen. Se adopta o usoara incretire a catenelor in aceasta configuratie. Amino- acizii care compun catenele polipeptidice au cofiguratie L la atomii de carbon asimetrici, grupele R ale aminoacizilor ies din planul ondulat, de o parte si de alta a acestuia. Distanta de 9.7 Å dintre straturile de catene polipeptidice este determinata de fortele de atractie dintre grupele R din straturi diferite.

Insolubilitatea cheratinei se datoreaza legaturilor transversale -S-S- existente intre resturile de cisteina din catene polipeptidice diferite sau intre portiuni ale aceleasi catene. Prezenta acestor legaturi se recunoaste prin reactii diferite. Astfel parul sau lana se dizolva usor in solutii apoase de sulfuri alcaline, care reduc legaturile -S-S- la 2 S-H. De asemenea acidul tioglicolic si cianurile alcaline au aceeasi actiune:

R-S-S-R + HCN   →   R-SH + NC-S-R                                                                      [2]

            Legatura S-S mai poate fi rupta si oxidativ, cu apa de brom sau apa oxigenata. Cheratina solubilizata prin agenti reducatori sau oxidanti este hidrolizabila cu enzime proteolitice. Sub actiunea unor substante alcaline precum Na₂CO₃, NaOH, Na₂S, cianuri, borati, gruparea disulfura poate fi atacata.

Reactia de scindarea hidrolitica a cheratinei are loc la pH 10.6, conform figurii 6:

Figura 6  Scindarea hidrolitica a cheratinei

1.3 ELASTINA

             Elastina este un alt constituent proteic al pielii, care formeaza tesuturi fibrose cu o elasticitate comparabila cu a cauciucului [9].

Elastina este una dintre cele mai hidrofobe proteine cunoscute, insolubila datorita legaturilor la resturile de lizina. Acest lucru este datorat  compozitiei, acestei proteine: peste 20% glicina, aproximativ 74% din secventa de aminoacizi o reprezinta aminoacizii nepolari, hidrofobi (glicina, alanina, valina, leucina), comparativ cu 40% in cazul colagenului.

Elastina nu se transforma, precum colagenul, in gelatina la fierbere cu apa si este digerata de tripsina. Ca si colagenul fibrele de elastina sunt compuse din aminoacizi simpli, mai ales glicina, alanina, leucina, prolina si nu contin  hidroxiprolina, triptofanul, sau histidina.

TEHNOLOGIA DE PRELUCRARE A PIEILOR ANIMALE

            Tehnolgia de prelucrare a pieilor utilizeaza colagenul din derma (piele gelatina ) ce a suferit o serie de modificari chimice: dezaminari la resturile glutamina si asparagina, hidroliza grupelor eterice de legare a derivatilor glicozidici, precum si o hidroliza partiala a catenelor polipeptidice.

Tabacirea este un proces complex prin care pielea animala, special pregatita este tratata cu materiale chimice capabile sa reticuleze colagenul, sa reduca cantitatea de apa din compozitia pielii, de la circa 80% in stare cruda, la circa 16% in stare de piele finita. Scopul acestor tratamente complexe este de a conferi acestui material proteic, urmatoarele caracteristici:

Stabilizarea la actiunea enzimelor care genereaza bacteriile de degradare, a  materialelor chimice;

Cresterea rezistentei hidrotermice;

Reducerea sau eliminarea tendintei de umflare;

Cresterea rezistentelor mecanice;

Reducerea densitatii prin separarea fibrelor;

Reducerea deformabilitatii;

Reducerea capacitatii de contractie in volum, suprafata si grosime;

Cresterea porozitatii texturii fibroase.

Influenta cea mai importanta in realizarea acestor proprietati o au agentii de reticulare ai colagenului reprezentati de diversi agenti tananti.

            La modul general, prelucrarea pieilor se face in trei etape distincte dupa scop[10].

1. Prima etapa urmareste transformarea compozitionala si structurala a materiei prime prin eliminarea unor componente care nu sunt necesare sau chiar impiedica prelucrarea ulterioara. Aceste operatii au drept consecinta afanarea structurii fibroase a pielii si modificarea reactivitatii chimice a acesteia.

            Operatiile implicate in aceste modificari sunt:

INMUIEREA PIEILOR - urmareste rehidratarea acesteia pana la un nivel comparabil cu cel al pieilor proaspat jupuite, indepartarea agentului de conservare, a impuritatilor  precum si a substantelor interfibrilare solubile in apa.

DESCARNAREA (STRECUIREA) - consta in indepartarea prin efect mecanic a aderentelor de pe ambele fete ale pielii, indeosebi resturile de hipoderma.

DEPARAREA-CENUSARIREA - urmareste inlaturarea  epidermei si productiilor sale madificand totodata si structurile dermice si componentii necolagenici.

SERUIREA - elimina  structurile si aderentele hipodermice labilizate in urma operatiilor anterioare.

DECALCIFICAREA - solubilizeaza  si indeparteaza agentii alcalini utilizati la operatia anterioara.

SAMALUIREA -  actioneaza enzimatic asupra structurii fibroase a dermei, relaxand-o si eliberand-o practic de structurile necolagenice.

PICLAREA – reprezinta un tratament acid care opreste actiunea enzimelor de samaluire si pregateste derma pentru operatia de tabacire.

A doua etapa decide practic ansamblul si nivelul proprietatilor de intrebuintare ale semifabricatului de piele. Ea consta in aplicarea unor tratamente chimice numite generic tabacire. Scopul tabacirii este acela de a conferii pielii stabilitatea compozitionala si dimensionala la solicitari hidrotermice si hidrolitice. Tabacirea se poate realiza mineral (saruri de crom), vegetal sau mixt.

3. A treia etapa denumita generic  finisare are preponderent drept scop definirea sortimentala si orientarea estetica. Prin finisare semifabricatul de piele capata o forma finala si niste caracteristici impuse sau dorite.

3. PROPRIETATILE COLAGENULUI

Colagenul sub toate formele sale caracteristice se prezinta ca un polimer care se individualizeaza prin hidrofilie accentuata, caracter ionic variabil si functionalitate diversa, putand fi implicat intr-un mare numar de sisteme de interactiuni cu alte componente micro sau macromoleculare [11-14].

          3.1. Interactiunea colagenului cu apa, acizii, bazele si sarurile neutre

Un rol important in structura moleculei de colagen il are apa care face parte integranta din aceasta, formand un sistem de tip „cluster”. Absorbtia apei este atribuita grupelor polare specifice –NH₂ si –COOH din catena laterala, sau  –CO–NH– din catena principala.

Absorbtia apei are loc in primul rand la grupele ionice –COO­^- si NH₃⁺ in jurul carora se orienteaza moleculele de apa. Apa absorbita in suprastructura specifica colagenului poate fi raportata ca apa libera sau apa legata, in functie de taria legaturilor formate din dipolul apei si sarcina electrostatica a grupei polare. Astfel, cca. 80% este apa libera, iar 20% este apa legata, aceasta devenind o apa structurata cu proprietati biologice active specifice.

Grupele polare ale colagenului au capacitatea de a lega un strat mono­molecular de apa puternic legata, de care sunt fixate alte straturi de apa, prin intermediul dipolului molecular de apa, cu intensitati descrescande. Limita dintre straturile de molecule de apa legate de grupele polare ale colagenului, care nu au proprietatile apei lichide si moleculele de apa lichida asociata intre ele, este mai greu de delimitat. Astfel, o solutie de colagen de 1% concentratie se prezinta sub forma de gel compact stabil, in toata masa lui, cca. 99% din apa fiind orientata si reticulata de 1% substanta colagenica, cu conditia ca mole­culele de colagen sa aiba o structura nativa nedenaturata de triplu helix.

Colagenul este un produs amfoter datorita grupelor bazice si acide din  catenele lanturilor polipeptidice. Un rol deosebit il au grupele aminice si carboxilice. Grupa amidica din lantul polipeptidic si grupele hidroxilice ale catenelor laterale au o insemnatate redusa asupra caracterului amfoter. Prin introducerea colagenului in mediu alcalin sau acid se constata o tendinta puternica de patrundere a apei. Are loc umflarea, care este determinata de pH-ul sistemului si de capacitatea de combinare a colagenului cu acizi sau baze [3].

Legarea acizilor si bazelor de catre colagen este functie de numarul grupelor polare capabile de a se salifia si este determinata de rapoartele stoechiometrice dintre proteina colagenica si acizi sau baze. Aceste rapoarte sunt constante cand actiunea acizilor si bazelor se limiteaza numai la legaturi intermoleculare [3].

Capacitatea de combinare a colagenului cu acizii este determinata de numarul grupelor bazice, iar capacitatea sa de combinare cu bazele este determinata de numarul grupelor carboxilice. Curba de titrare potentiometrica caracterizeaza numarul si gradul de ionizare a grupelor aminice si carboxilice [3].

Figura 7 Reactia colagenului cu acizii si bazele

In cazul concentratiilor mici de acizi se ajunge la o legare stoechiometrica a cationilor la grupele carboxilice ale moleculei de colagen, in timp ce anionii acidului se combina cu grupele bazice.

La concentratii mici de acizi se mareste stabilitatea hidrotermica a colagenului, probabil datorita apropierii reciproce a catenelor polipeptidice. Cu cresterea concentratiei solutiilor de acizi stabilitatea scade brusc la un moment dat, ca urmare a ruperii legaturilor de hidrogen, ceea ce are drept consecinta modificarea ireversibila a stabilitatii triplului helix. Combinarea maxima prin legaturi ionice are loc la pH = 1,0 – 1,5.

Comparandu-se curbele de umflare ale colagenului din piele cu diversi acizi (figura 8), se constata ca acidul clorhidric produce cea mai puternica umflare [3].

Figura 8 Curbele de umflare ale colagenului  din derma pielii in

solutii acide: 1-acid clorhidric; 2-acid acetic; 3-acid formic;

4- acid naftalensulfonic; 5-acid sulfuric

Umflarea colagenului cu acid β-naftalensulfonic este mai mica decat in acid sulfuric sau clorhidric, desi este un acid puternic, iar constantele de ionizare se apropie de constanta de ionizare a acidului clorhidric. Diferenta dintre gradul de umflare a colagenului in acid β-naftalensulfonic si acid sulfuric este explicata prin afinitatea acizilor sulfurici aromatici, ce are ca rezultat scaderea ionizarii compusului colagen-acid β-naftalensulfonic, deci micsoreaza factorii osmotic si electrostatic [3].

Compusii organici ca acidul acetic produc umflarea colagenului. In solutii concentrate de acid acetic umflarea nu prezinta un maximum. Acelasi lucru este valabil si in cazul solutiilor de acid lactic si formic.

Adaugarea de saruri neutre in solutiile de acizi schimba echilibrul dintre acid si colagen. Conform teoriei echilibrului de membrana Donnan, adaugarea de sare scade inegalitatea de repartitie a ionilor intre colagen si solutie, iar pH-ul colagenului scade (tabelul 2). Astfel de solutii sunt utilizate curent atat in procesul de prelucrare a pieilor, cat si in procedeele de extractie / solubilizare a colagenului din derma pielii.

Tabelul 2 Influenta adaosului de NaCl asupra pH-ului solutiilor de acizi: HCl si H₂SO₄

Umflarea colagenului in mediu alcalin se explica in mod similar cu umflarea acida.

Intensitatea umflarii in prezenta hidroxizilor monobazici variaza in ordinea:

KOH > NaOH > NH₄OH.

Ca si in mediu acid, in mediu alcalin odata cu cresterea alcalinitatii cationului de compensare scade gradul de umflare al colagenului dermic (figura 9) [3] .

Figura 9 Umflarea colagenului din derma pielii in solutie de:1 – NaOH; 2 – NH₄OH; 3 – Ca(OH)­₂

In general hidroxizii bibazici au o putere de umflare mai mica decat cei monobazici. In functie de capacitatea lor de umflare, hidroxizii bibazici se clasifica in ordinea:          

Ba(OH)₂ > Sn(OH)₂ > Ca(OH)₂

Scaderea umflarii functie de natura hidroxidului se explica prin reducerea intensitatii factorului osmotic, determinat de constanta de ionizare mai mica in comparatie cu cea a hidroxizilor monobazici. Daca umflarea acida scade mult prin adaugarea de sare neutra, umflarea alcalina scade efectiv putin.

Reactia cu acid acetic

Figura 10 Formarea de noi legaturi de hidrogen intre colagen si acid acetic

3.2  Interactiunea colagenului cu enzime

Tripsina scindeaza catena polipeptidica la nivelul legaturilor peptidice formate intre gruparile carboxil si resturile de arginina si lizina, cat si a legaturilor amidice si esterice ale acestor aminoacizi bazici. Secventa resturilor de aminoacizi care se gasesc in vecinatatea situsului catalitic activ al tripsinei este: – glicina – asparagina – serina – glicina – prolina – valina. Restul de serina joaca un rol esential in activitatea catalitica a tripsinei, de aceea tripsina este considerata o serin-enzima [3].

            Chimotripsina hidrolizeaza legatura polipeptidica in care e implicata gruparea carboxil a tirozinei, fenilalaninei si triptofanului si intr-o mai mica masura la nivelul metioninei si leucinei. In centrul catalitic activ al chimo­tripsinei se afla un rest de serina si secventa de aminoacizi din vecinatatea centrului catalitic activ este – glicina – aspargina – serina – glicina–[3].

Pepsina si catepsina – actioneaza la un pH optim 2 – 4, si respectiv 3 – 4,  fiind in general usor deplasat spre valori de pH mai putin acide in cazul proteinelor denaturate termic sau tratate cu uree. Pepsina scindeaza legaturile peptidice formate prin participarea gruparii amino a resturilor de fenil alanina si tirozina, cu gruparea carboxil a altor resturi de aminoacizi (acid glutamic, metionina, glicina, cisteina etc.). Pe langa activitatea proteazica, pepsina are si o activitate peptidazica, esterazica si transpeptidazica[3].

3.3  Reticularea colagenului

Modificarea colagenului se refera in primul rand la procesul de reticulare, prin care grupele polare libere sunt implicate in formarea de noi legaturi intermoleculare.

Materialele tanante [15] vegetale reticuleaza macromolecula de colagen prin numeroase legaturi de hidrogen  care se formeaza intre grupele fenolice ale tanantului vegetal si grupele aminice ale colagenului (figura 11):

Reticularea colagenului se realizeaza prin legaturi de hidrogen intre grupele fenolice ale tanantului vegetal si grupele aminice ale colagenului.