Cercetari privind functionalizarea colagenului cu ajutorul nanomaterialelor, in vederea obtinerii unor piei si blanuri cu proprietati avansate

Cercetari privind functionalizarea colagenului cu ajutorul nanomaterialelor, in vederea obtinerii unor piei si blanuri cu proprietati avansate

I. STUDIU DE LITERATURA

1. COLAGEN. STRUCTURA SI PROPRIETATI

1.1 INTRODUCERE

Colagenul este proteina fibrilara cea mai abundenta din constitutia organismelor nevertebrate (cili) si vertebrate la nivelul oaselor, pielii, tendoanelor, cartilagiilor, vaselor sangvine, corneei etc. Aproximativ 90% din fibrele proteice ale dermei sunt reprezentate de colagen.

La inceputul secolului XX colagenul era cunoscut numai sub simpla definitie de “constituent al tesutului conjunctiv care prin fierbere se transforma in gelatina”; aceasta definitie reflecta insasi etimologia cuvantului care isi are originea in limaba greaca, collagen insemnand “producator de clei”.

Colagenul datoreaza functiile sale unei conformatii moleculare specifice de triplu helix ce provine dintr-o anumita secventa a aminoacizilor componenti.

Repartitia colagenului in diferite organe se prezinta astfel:

tendon 25-35%

piele 20-30%

oase, cartilagii 10-20%

peretii vaselor sangvine 5-12%

inima, ficat, rinichi 0.5-2%

sistem nervos central 0.2-0.4%

Cunoasterea suprastructurii si interactiunii intre diversele tipuri de colagen este importanta nu numai pentru domeniul biologiei si medicinei, cat si pentru bioingineria colagenului in scop aplicativ.

Posibilitatile largi de modificare chimica si structurala a colagenului din tesuturile conjunctive (piele, tendon, cartilagii, oase) stau la baza proiectarii de bioproduse noi, cu aplicatii in medicina , farmacie, cosmetica, sau produse de uz alimentar si de interes industrial (pentru industria de pielarie si textile).

1.2 COMPOZITIA CHIMICA SI STRUCTURA SUPRAMOLECULARA A COLAGENULUI

Colagenul este un polimer natural format prin polimerizarea a 20 de aminoacizi, aranjati in secvente caracteristice pentru molecula de colagen, ce are o structura conformationala unica de triplu helix.

Astfel, in compozitia colagenului, aminoacidul glicina (Gly) reprezinta aproximativ 33%, iar aminoacizii prolina (Pro) si hidroxiprolina (Hyp) reprezint& 323g61d #259; circa 22%.

Succesiunea de aminoacizi a proteinei este denumita structura primara. Aceasta structura determina modul de impachetare a proteinei: in a-helix, b-stratificata sau b-rasucita. Fiecare aminoacid, cu structura lui speciala, cu forma si functiile chimice proprii, contribuie la tipul de impachetare.

In ultimii 30 de ani, studiile efectuate pe polipeptide sintetice cu diverse secvente au permis predictia conformatiei structurale, in functie de secventa aminoacizilor. Astfel, a fost stabilita succesiunea completa a aminoacizilor constituenti in lanturile a a colagenului tip I. In aceasta terminologie, “a” denumeste un lant colagenic produs de o singura gena. Tipul de colagen, desemnat de o cifra romana I, II, III etc., se refera la o molecula intreaga unica cu lanturile sale de tip a.

K. Lindeström-Lang, Bernal si colab. [19] propune clasificarea ordonarii structurale a proteinelor, pentru a intelege structura complicata a colagenului, astfel:

a.        structura primara reprezinta inlantuirea aminoacizilor in catenele polipeptidice ale macromoleculei de colagen;

b.        structura secundara – se refera la un singur lant polipeptidic (helix minor orientat de la stanga spre dreapta) din triplul helix al moleculei de colagen;

c.        structura tertiara – este reprezentata de molecula de colagen alcatuita din trei lanturi a rasucite impreuna de la dreapta spre stanga, in jurul unui ax comun, realizandu-se astfel un triplu helix sau helixul major;

d.        structura cuaternara – reprezinta modul de agregare a macromo­leculelor de colagen la formarea fibrilelor, fibrelor si tesutului colagenic.

1.2.1 Structura primara

Aminoacizii sunt constituentii cei mai simpli ai proteinelor, rezultand prin hidroliza acida/bazica/enzimatica. Sunt substante cristaline care se topesc cu descompunere, sunt solubile in apa si insolubile in solventi organici, avand formula generala (1):

Structura primara a colagenului este determinata de secventa celor 20 de aminoacizi care „cladesc” prin legaturi peptidice mai intai catenele polipeptidice a-helix (structura secundara), iar apoi, prin intermediul a-helixurilor se formeaza suprastructura macromoleculara tertiara si cuaternara.

Figura 1.8. Formarea legaturii peptidice prin reactia dintre gruparea carboxilica a unui aminoacid cu cea aminica a unui alt aminoacid

In tabelul 1.3. sunt prezentati cei mai importanti 20 aminoacizi care intra in compozitia colagenului [20].

Tabelul 1.3. Cei mai importanti aminoacizi din structura proteinelor

Colagenul este in esenta o politripeptida in lantul a-helix, avand glicina in fiecare a treia pozitie. Analiza secventelor colagenului nativ a pus in evidenta faptul ca lanturile polipeptidice pot fi asemanatoare cu un terpolimer pentru care este valabila urmatoarea formula (2):

H₂N – NC₁ – (Gly – X – Y)_n – NC₂ – COOH (2)

unde:

NC₁ si NC₂ sunt telopeptide,

X este cel mai adesea prolina

Y hidroxiprolina

n = 100 – 400.

Structura secundara

Catenele polipeptidice care intra in constitutia principalelor tipuri de colagen au o conformatie de tip a-elicoidal cristalina, situata in zona centrala a lantului macromolecular.

Pauling si Corey au emis ipoteza ca modalitatea cea mai probabila de indoire si rasucire a unui lant este cea helicoidala, sub forma unei spirale (a-helix denumit si helix minor) cu rasuciri de la stanga spre dreapta [21]. Distanta dintre spirale este de 5,44Å.

Stabilitatea acestei structuri complexe se realizeaza prin legaturi de hidrogen de tipul NH····O=C intre grupele legaturilor peptidice ale aminoacizilor din spirele alaturate. Exista mai multe modele care aproximeaza conformatia reala [23, 24, 25].

In figura 1.10. se reprezinta schema unui helix de dreapta.

Figura 1.10. Helix de dreapta

Parametrii geometrici ai a-helix-ului sunt relativ stabili la factori termodinamici. S-au evidentiat usoare intinderi si contractii ale sale, la modificarea concentratiei solutiilor, tariei ionice a mediului si temperaturii.

Tipurile de colagen specifice membranelor bazale (in special tipul IV) se considera ca au, pentru un lant, conformatii de tip amorf, desi sunt constituite si din blocuri cristaline. Fata de aceasta situatie, conceptia actuala privind conformatia lantului individual oscileaza intre cea cristalina propriu-zisa pentru tipurile I, II, III, V, si X si cristalino-amorfa pentru restul tipurilor.

Structura tertiara

Macromolecula de colagen (tropocolagenul) este alcatuita din trei lanturi a (2a₁+1a₂) rasucite impreuna de la dreapta spre stanga, ca intr-o funie, in jurul unui ax comun, realizandu-se triplul helix sau helix-ul major (figura 1.11). Aceasta structura confera macromoleculei o alura de bastonas rigid [26-28].

Sunt reprezentate trei α-helix-uri cu spirale ce se rotesc de la stanga la dreapta, iar α-helix-urile se infasoara impreuna de la dreapta spre stanga. Lanturile a₁ si un lant a₂ se deosebesc intre ele prin compozitia cantitativa in diferiti aminoacizi.

Lantul a₁ contine o cantitate mai mare de hidroxiprolina, prolina, alanina, fenilalanina si lizina, in timp ce acidul aspartic, valina, leucina, izoleucina si histidina apar in cantitati mai reduse [29].

Lanturile polipeptidice ce alcatuiesc molecula de colagen sunt legate prin legaturi transversale, legaturi de hidrogen in domeniul helicoidal si legaturi covalente in domeniul nehelicoidal, care cresc progresiv, pe masura maturarii (imbatranirii) proteinei [26].

Ramachandran a aratat ca exista doua grupari -NH pentru fiecare trei resturi de aminoacizi care sunt legate prin legaturi de hidrogen. Cea de a doua legatura de hidrogen intre -NH si -OH al unui lant vecin nu se formeaza direct, ci prin intermediul unei molecule de apa (figura 1.12.) [30, 31].

Se remarca de exemplu ca la N₁H₁ a lantului B, hidrogenul este legat direct de oxigenul carbonului din lantul C, iar N₂H₂ are hidrogenul legat la molecula de apa, care in intoarcere se leaga la oxigenul carbonului din lantul A.

Figura 1.12. Structura moleculei de colagen cu punte de apa

Aceasta structura cu punte de apa serveste la explicarea rolului indeplinit de hidroxiprolina in structura colagenului. Molecula de apa poate fi legata prin intermediul unei legaturi de hidrogen cu grupa -OH a hidroxiprolinei. Numai unul din protonii moleculei de apa actioneaza drept donor pentru o legatura de hidrogen la un oxigen carbonilic, in timp ce oxigenul apei este implicat intr-o legatura de hidrogen cu gruparea -NH. De aceea, al doilea proton al apei este liber si acesta se poate lega prin intermediul unei legaturi de hidrogen cu un atom de oxigen al hidroxiprolinei. In felul acesta, hidroxiprolina din colagen poate servi drept receptor de legatura de hidrogen, stabilizand structura.

Molecula de colagen constituie elementul conformational care con­struieste suprastructura diferitelor tipuri genetice de colagen din tesutul conjunctiv, prin procesul de agregare extracelulara. Domeniile cu triplu helix au dimensiuni variabile de la 300 la 1000 reziduuri de aminoacizi. Triplu helix-urile cele mai lungi, continand 1000 aminoacizi pe fiecare α-helix, formeaza izotipurile de colagen fibrilar, prin agregarea laterala si decalarea lor cu un sfert din lungime. Acest aliniament al moleculelor de colagen confera colagenului fibrilar o periodicitate axiala unica de 67 nm, observata la microscopul electronic.

Lungimea moleculei de colagen fibrilar este de 4,4 ori lungimea periodicitatii axiale (cca. 300 nm), indicand o suprapunere a moleculelor la capete de 25 nm. La ambele capete ale moleculei sunt extensii de peptide nehelicoidale: NH₂ – terminala si COOH – terminala.

Structura cuaternara

Modul de constituire si de crestere a fibrilelor de colagen ramane una din cele mai importante probleme biologice legate de colagen, cu implicatii in procesele de formare a tesutului conjunctiv [26].

Studiile privind precipitarea colagenului din solutii coloidale (geluri) au adus contributii importante la stabilirea mecanismului de agregare (polimerizare) a macromoleculelor de colagen in fibrile. Procesul implica doua etape:

agregarea unidirectionala cap-cap a moleculelor (macromoleculelor) printr-un proces de polimerizare liniara, ducand la aparitia „protofi­brilelor”, structuri cu diametrul de 15 Å si lungime variabila;

agregarea laterala a protofibrilelor, determinand aparitia fibrilelor, fibrelor si fasciculelor de fibre. Fibrilele au diametre uniforme ce variaza in diferite tesuturi, a caror stadii de dezvoltare pot fi cuprinse intre 50Å si 2000Å.

1.3 PROPRIETATILE COLAGENULUI

Colagenul sub toate formele sale caracteristice se prezinta ca un polimer care se individualizeaza prin hidrofilie accentuata, caracter ionic variabil si functionalitate diversa, putand fi implicat intr-un mare numar de sisteme de interactiuni cu alte componente micro sau macromoleculare [43-46].

Stabilitatea structurii colagenului este asigurata de multitudinea de legaturi stabile: covalente, electrovalente, legaturi de hidrogen si legaturi hidrofobe. In starea naturala, pielea contine 75-80% apa, aceasta separand elementele structurale, in principal prin legaturi reversibile de hidrogen formate la nivelul a-helixului si triplu helixului (intra si intermoleculare). Legatura de hidrogen de tipul H···OH formata de o molecula de apa cu alta molecula de apa sau direct la grupele reactive din catena polipeptidica, stabilizeaza structura moleculei de colagen, iar la nivelul fibrilelor si fibrelor tesutului intermediaza reactii reversibile in mediul „apos biologic”.

Comportarea mecanica, fizico-chimica si chimica a colagenului se datoreaza dualismului structurii sale, cristaline si amorfe, prezentand atat proprietatile cristalelor, cat si ale gelurilor. Stabilitatea relativa a colagenului (dimensionala, biologica, chimica etc.) este atribuita proprietatilor cristaline, iar cele clasice de flexibilitate, reactivitate etc. proprietatilor particulelor amorfe polare. Datorita coexistentei ambelor structuri, se poate tana (tabaci) pielea animala si obtine o gama larga de sortimente de piele finisata. La caracteristicile specifice pielii tabacite concura si proprietatile colagenului de coloid fibrilar si structura sa histologica specifica.

Asadar, colagenul poate exista atat in stare de gel, cat si in stare de sol. In stare solvita nu difuzeaza prin membrane semipermeabile, intrucat particulele au marimi mai mici de 1 mm, deci prezinta dimensiunile starii coloidale. Particulele coloidale pot fi formate din macromolecule sau agregate moleculare colagenice, faza incipienta in formarea colagenului insolubil.

Starea coloidala a colagenului in solutie ii confera toate proprietatile fizico-chimice caracteristice sistemelor coloidale: presiune osmotica mica, capacitate de difuzie scazuta, tensioactivitate, etc. Datorita caracterului coloidal, repartitia ionilor din solutie prin membrane semipermeabile va fi influentata de echilibru de membrana Donnan [26, 37]. Exista o inegalitate de repartitie a ionilor difuzibili in momentul echilibrului. Colagenul insolubil, indeplinind rolul ionului nedifuzibil, constituie si o membrana semipermeabila care, in mediul acid este incarcat pozitiv, iar ionii acidului sunt difuzibili. In prezenta sarurilor neutre potentialul de membrana scade; scaderea se accentueaza pe masura cresterii concentratiei de sare [37].

Transformarile fizico-chimice care au loc in piele in cursul procesului de obtinere a pieilor finite, sunt conditionate de structura semicristalina a colagenului si de proprietatile sale coloidale si polielectrolitice. Proprietatile fizico-chimice ale colagenului fibrilar, in special insolubilitatea si tensiunea la rupere mare, sunt direct legate de aranjamentul moleculelor polimerizate, unite prin legaturi intra si intermoleculare. Pentru a transforma pielea cruda in piele finita in procesul de tanare, se introduc noi reticulari intermoleculare prin intermediul substantelor tanante anorganice (saruri de crom, zirconiu) si organice (aldehide, polifenoli).

Proprietati fizico-chimice

Din punct de vedere al proprietatilor fizico-chimice, importanta este prezenta reticularilor covalente intra si intermoleculare care explica:

efectele de stabilitate structurala, in diverse medii apoase;

resorbtia, umflarea, semipermeabilitatea, echilibru de membrana Donnan;

functia de schimbator de ioni.

Interactiunea colagenului cu apa, acizii, bazele si sarurile neutre

Un rol important in structura moleculei de colagen il are apa care face parte integranta din aceasta, formand un sistem de tip „cluster”. Absorbtia apei este atribuita grupelor polare specifice –NH₂ si –COOH din catena laterala, sau –CO–NH– din catena principala.

Absorbtia apei are loc in primul rand la grupele ionice –COO­^- si NH₃⁺ in jurul carora se orienteaza moleculele de apa. Apa absorbita in suprastructura specifica colagenului poate fi raportata ca apa libera sau apa legata, in functie de taria legaturilor formate din dipolul apei si sarcina electrostatica a grupei polare. Astfel, cca. 80% este apa libera, iar 20% este apa legata, aceasta devenind o apa structurata cu proprietati biologice active specifice.

Colagenul este un produs amfoter datorita grupelor bazice si acide din catenele lanturilor polipeptidice. Un rol deosebit il au grupele aminice si carboxilice. Grupa amidica din lantul polipeptidic si grupele hidroxilice ale catenelor laterale au o insemnatate redusa asupra caracterului amfoter. Prin introducerea colagenului in mediu alcalin sau acid se constata o tendinta puternica de patrundere a apei. Are loc umflarea, care este determinata de pH-ul sistemului si de capacitatea de combinare a colagenului cu acizi sau baze [42].

Legarea acizilor si bazelor de catre colagen este functie de numarul grupelor polare capabile de a se salifia si este determinata de rapoartele stoechiometrice dintre proteina colagenica si acizi sau baze. Aceste rapoarte sunt constante cand actiunea acizilor si bazelor se limiteaza numai la legaturi intermoleculare [42].

Interactiunile colagenului cu acizii

Capacitatea de combinare a colagenului cu acizii este determinata de numarul grupelor bazice, iar capacitatea sa de combinare cu bazele este determinata de numarul grupelor carboxilice. Curba de titrare potentiometrica caracterizeaza numarul si gradul de ionizare a grupelor aminice si carboxilice [47].

In cazul concentratiilor mici de acizi se ajunge la o legare stoechiometrica a cationilor la grupele carboxilice ale moleculei de colagen, in timp ce anionii acidului se combina cu grupele bazice.

La concentratii mici de acizi se mareste stabilitatea hidrotermica a colagenului, probabil datorita apropierii reciproce a catenelor polipeptidice. Cu cresterea concentratiei solutiilor de acizi stabilitatea scade brusc la un moment dat, ca urmare a ruperii legaturilor de hidrogen, ceea ce are drept consecinta modificarea ireversibila a stabilitatii triplului helix. Combinarea maxima prin legaturi ionice are loc la pH = 1,0 – 1,5.

Comparandu-se curbele de umflare ale colagenului din piele cu diversi acizi (figura 1.19), se constata ca acidul clorhidric produce cea mai puternica umflare [42, 48].

Figura 1.19. Curbele de umflare ale colagenului din derma pielii in solutii acide: 1-acid clorhidric; 2-acid acetic; 3-acid formic; 4- acid naftalensulfonic; 5-acid sulfuric

Umflarea colagenului cu acid β-naftalensulfonic este mai mica decat in acid sulfuric sau clorhidric, desi este un acid puternic, iar constantele de ionizare se apropie de constanta de ionizare a acidului clorhidric. Diferenta dintre gradul de umflare a colagenului in acid β-naftalensulfonic si acid sulfuric este explicata prin afinitatea acizilor sulfurici aromatici, ce are ca rezultat scaderea ionizarii compusului colagen-acid β-naftalensulfonic, deci micsoreaza factorii osmotic si electrostatic [42].

Compusii organici ca acidul acetic produc umflarea colagenului. In solutii concentrate de acid acetic umflarea nu prezinta un maximum. Acelasi lucru este valabil si in cazul solutiilor de acid lactic si formic.

Adaugarea de saruri neutre in solutiile de acizi schimba echilibrul dintre acid si colagen. Conform teoriei echilibrului de membrana Donnan, adaugarea de sare scade inegalitatea de repartitie a ionilor intre colagen si solutie, iar pH-ul colagenului scade (tabelul 1.4) [29]. Astfel de solutii sunt utilizate curent atat in procesul de prelucrare a pieilor, cat si in procedeele de extractie / solubilizare a colagenului din derma pielii.

Tabelul 1.4. Influenta adaosului de NaCl asupra pH-ului solutiilor de acizi: HCl si H₂SO₄

Interactiunile colagenului cu bazele

Umflarea colagenului in mediu alcalin se explica in mod similar cu umflarea acida.

Intensitatea umflarii in prezenta hidroxizilor monobazici variaza in ordinea:

KOH > NaOH > NH₄OH.

Ca si in mediu acid, in mediu alcalin odata cu cresterea alcalinitatii cationului de compensare scade gradul de umflare al colagenului dermic (figura 1.20) [42, 48] .

Figura 1.20. Umflarea colagenului din derma pielii in solutie de: 1 – NaOH; 2 – NH₄OH; 3 – Ca(OH)­₂

In general hidroxizii bibazici au o putere de umflare mai mica decat cei monobazici. In functie de capacitatea lor de umflare, hidroxizii bibazici se clasifica in ordinea: Ba(OH)₂ > Sn(OH)₂ > Ca(OH)₂

Scaderea umflarii functie de natura hidroxidului se explica prin reducerea intensitatii factorului osmotic, determinat de constanta de ionizare mai mica in comparatie cu cea a hidroxizilor monobazici. Daca umflarea acida scade mult prin adaugarea de sare neutra, umflarea alcalina scade efectiv putin.

Umflarea colagenului

Pe langa apa care se gaseste la pH-ul izoelectric, cu cresterea sau scaderea pH-ului, colagenul se imbogateste in sarcini negative sau pozitive si din aceasta cauza, datorita efectelor osmotice, cantitatea de apa creste, asa cum se poate vedea din figura 1.21 [26] .

Acest tip de umflare se realizeaza prin modificarea pH-ului la intensitati ionice diferite si temperaturi joase si constante. Cantitatea de apa absorbita de piele in regiunile extreme ale pH-ului, este determinata de doi factori contrari: fortele osmotice care tind sa patrunda in piele si fortele de coeziune reprezentate prin insasi structura supramoleculara a colagenului, care se opun absorbtiei.

Figura 1.21. Absorbtia apei de catre pielea gelatina, pielea proaspata
si pielea uscata, la diferite valori de pH

Efectul de opunere a microstructurii pielii la absorbtia apei poate fi evidentiat prin urmatoarele exemple [49]:

manunchiurile de fibre izolate din pieile brute de bovine, conservate cu sare, absorb apa reprezentand de 20 ori greutatea lor, la pH-ul acid al umflarii maxime, in timp ce pielea cruda intacta absoarbe numai de 3-4 ori greutatea sa;

colagenul extras sub forma de gelatina (triplu helix denaturat) absoarbe in stare uscata, de 10 ori mai multa apa decat pielea cruda, cu un continut egal de proteina.

Absorbtia de apa de catre pieile uscate in domeniu de pH acid si izoelectric este cu circa 1/5 mai mica decat a pieilor proaspete, in timp ce in domeniul alcalin absorbtia este mai mica, dar mai apropiata de cea a pieilor proaspete. Absorbtia mai redusa a apei in pieile uscate se datoreaza modificarilor fizico-chimice din substantele interfibrilare, care provoca o crestere a coeziunii fibrelor. Alcaliile au un efect solubilizant mai mare asupra substantelor interfibrilare si deci un efect restrictiv mai mic asupra absorbtiei apei de catre pielea uscata.

Cand colagenul reactioneaza cu un acid sau o baza, exista conditii pentru stabilirea unui echilibru osmotic de membrana Donnan intre colagen si solutia externa, intrucat in colagen sunt ioni care nu difuzeaza. Prezenta de ioni nedifuzibili duce la o distributie inegala a ionilor difuzibili intre solid (piele) si solutia externa, ceea ce conduce la un aflux de apa pentru egalarea concentratiei ionice din interiorul pielii si solutia externa.

Cauzele umflarii

Echilibrul de membrana este starea speciala in care ajung solutiile polielectrolitilor, despartite printr-o membrana semipermeabila de solutia de electrolit simplu, din cauza membranei care opreste difuzia macroionilor. Echilibrul de membrana al lui Donann explica fenomenul de umflare al colagenului din derma pielii, prin excesul de ioni „e”, nedifuzibili, din interiorul dermei:

e = 2y + z – 2x

in care:

x = concentratia ionilor din solutia exterioara;

y = concentratia ionilor mobili din derma;

z = concentratia ionilor fixati.

Presiunea osmotica este proportionala cu excesul de ioni si este cu atat mai mare, cu cat valoarea pH-ului este mai scazuta sau mai ridicata. Ionii acizilor sau ai bazelor patrund in interiorul structurii colagenului, formand saruri disociabile cu grupele reactive polare. Se creaza, astfel, un exces de ioni nedifuzibili „z”. Pentru egalarea presiunii osmotice apa va trece prin membrana semipermeabila, in cazul de fata insasi derma pielii provocand umflarea [42].

Umflarea poate fi explicata si prin sarcina electrica a grupelor reactive ale colagenului [50]. Respingerea electrostatica a catenelor incarcate cu aceeasi sarcina in mediu acid sau alcalin, determina deformarea catenelor polipeptidice ale moleculelor de colagen. Prin degajarea grupelor polare din legaturile electrostatice initiale se mareste numarul centrelor polare, de care se poate lega dipolul apei. In acest fel, se obtine o umflare suplimentara (figura 1.22) .

Figura 1.22. Reprezentarea schematica a umflarii colagenului

in mediu acid si alcalin

Influenta ionizarii in fenomenul de umflare suplimentara concorda cu ideile moderne legate de structura atmosferei ionice si a centrelor ionogene ale polielectrolitilor coloidali.

Umflarea liotropa

La stabilizarea structurii colagenului o contributie importanta o au reticularile prin intermediul legaturilor de hidrogen, atunci cand temperatura nu depaseste 40⁰C. Prin tratarea cu acizi, baze, saruri, are loc o perturbare a acestei stabilitati pana la nivelul a-helix-urilor din moleculele de colagen, care se manifesta prin scaderea temperaturii de contractie, solubilizare si prin cresterea cantitatii de apa absorbita si modificarea solubilitatii.

Fiecare tip de reactiv produce efectele sale liotrope caracteristice, prin perturbarea interactiunilor intercatenare si are drept rezultat o absorbtie mai mare a apei. In contrast cu umflarea osmotica, cand fibrele colagenice devin translucide, la umflarea liotropa nu se constata nici o alterare a aspectului opac, natural al acestora. Gradul de umflare liotropa este mult mai mic, in comparatie cu umflarea osmotica, iar modificarile dimensiunilor fibrelor de colagen sunt neinsemnate. Umflarea liotropa poate fi evidentiata si in solutiile de saruri unde fortele osmotice Donnan sunt neglijabile. In general ea poate fi observata la orice pH, numai daca concentratia sarii este suficient de mare (adica > 0,5 M), iar in intervalul neutru al pH-ului (6-8), chiar la o concentratie a sarii relativ mica.

Pe baza datelor obtinute pana in prezent [29], s-a stabilit o ordine a anionilor si a cationilor privind comportarea la umflare a agentilor liotropi:

F^- < Cl^- < NO₃^- < Br^- < SCN^-

K⁺ < Na⁺ < Ca²⁺ < Li⁺

Alcoolii alifatici provoaca intotdeauna o reducere a gradului de umflare in raport cu valoarea determinata in apa pura. Efectul este ilustrat in figura 1.23 pentru peliculele de colagen obtinute prin turnarea unei dispersii de colagen din tendoane de vitel si reticulare cu p-benzochinona [27].

Ordinea este: CH₃OH > CH₃H₇OH > C₂H₅OH

Gradul de umflare al membranei de colagen in alcoolii puri este de 60% in CH₃OH, 15% in C₂H₅OH si 13% in C₃H₇OH. Aceasta demonstreaza ca afinitatea alcoolilor puri pentru colagen variaza in ordinea: CH₃OH > C₂H₅OH > C₃H₇OH.

Figura 1.23. Interactiunea selectiva a colagenului cu alcoolii alifatici,

exprimata in fractii molare N_A, la 20⁰C si pH = 6

Docking si Heymann au solubilizat gelatina uscata, insolubila, intr-o solutie de sare de concentratie finala C_s, solutiei in exces, in echilibru cu gelul [51]. O valoare pozitiva a diferentei C_sⁱ – C_s^f indica o imbogatire a sarii in solutia din gel (in raport cu solutia exterioara), datorita unei interactiuni preferentiale colagen-sare.

Astfel, a fost studiata absorbtia ionilor diverselor saruri de catre gelatina (figura 1.24).

Valorile pozitive mari ale C_sⁱ – C_s^f denota o absorbtie mare de sare, care evidentiaza absorbtia normala a apei de catre gelatina initiala uscata, pe cand valorile negative mari demonstreaza ca absorbtia de sare este mica sau neglijabila.

Cresterea absorbtiei de sare, asa cum rezulta din figura, este:

SO^-2₄^- < CH₃COO^- < Cl^- < NO₃^- < Br^- < SCN^-

K⁺ < Mg²⁺ < Na⁺ < Cs²⁺ < Li⁺ < Ca²⁺

Problema locului de fixare a ionului pe colagen a fost studiata de multi specialisti si in special cei din industria de pielarie [29]. Majoritatea operatiilor tehnologice de tanare a pieilor se bazeaza pe procese de osmoza si reticulare chimica. In general, fixarea ionului se face la grupele polare ale macro­mo­leculei, adica la grupele amidice din catenele laterale si legaturile peptidice din catena principala. In apropierea punctului izoelectric este preferentiala legatura directa a ionilor cu legaturile peptidice ale colagenului. Fixarea ionilor este mai mare in zonele structurale amorfe decat in cele cristaline. De asemenea, colagenul denaturat (gelatina) contine o cantitate mai mare de ioni fixati, comparativ cu colagenul nedenaturat nativ.

Sarurile neutre au o actiune puternic liotropa la pH-ul izoelectric al colagenului. Sarurile liotrope sunt electroliti care ionizeaza in apa si sunt absorbiti polar pe colagen, fara schimb ionic.

La absorbtia ionilor de acelasi semn se stabileste o ordine de „tarie” a absorbtiei, numita serie liotropa.

Seriile liotrope ale absorbtiei cationilor si anionilor sunt urmatoarele:

Th⁴⁺ > Al³⁺ > H⁺ > Na⁺ > K⁺ > Li⁺ > Ba²⁺ > Mg²⁺ Sr²⁺ > Ca²⁺ > Rb²⁺ > citrat > tartrat > S₂O₃^2- > SO₄^2- > CH₃COO^- > Cl^- > NO₃^- > Br^- > I^- > CNS^-

Efectul liotropic al sarurilor neutre se manifesta mai ales la concentratii ridicate si se datoreaza in principal moleculei de sare si nu ionilor. Sarurile cu efectul liotrop cel mai pronuntat sunt acelea care in solutii concentrate sunt numai partial ionizate, cum sunt clorurile de metale bivalente (Ca, Mg, Ba).

In figura 1.24 este redat efectul liotropic al diferitelor saruri neutre, sub forma de solutie 4M, asupra pulberii de piele, apreciat dupa gradul de solubilizare al colagenului. Astfel, s-a observat ca in solutii naturale de sulfat de sodiu nu are loc distructia colagenului nici dupa 170 zile la 37⁰C, in timp ce mai mult de 30% din colagenul initial se pierde din proba pastrata in apa acoperita cu toluen si de asemenea peste 30% din solutia de clorura de magneziu.

Intensitatea de actiune a sarurilor depinde de interactiunea dintre sare si colagen si de stabilitatea compusului de valenta secundara format intre sare si proteina. Compusii sare-colagen se pot desprinde din masa totala si pot sa treaca in solutie.

Figura 1.24. Efectul liotropic al diferitelor saruri neutre, in solutii 4M asupra pulberii de piele

Intrucat tratarea cu sarurile neutre nu altereaza capacitatea de valenta ionica a colagenului, substantele care reactioneaza strict electrovalent cu proteina nu vor fi afectate. Actiunea anionilor asupra colagenului este legata de o interactiune electrostatica indirecta cu o legatura peptidica, care duce la degradarea consecutiva a legaturilor de hidrogen intermoleculare. Sarurile bazice de crom cationice, taninurile vegetale, acizii si bazele reactioneaza la fel cu colagenul tratat cu diferite saruri neutre, ca si cu cel netratat.

Detalii asupra efectului liotropic al sarurilor neutre si a unor compusi organici (ureici, ai acidului acetic si fenolilor) asupra colagenului si a gradului de umflare a acestuia, sunt prezentate in literatura de specialitate din domeniul industriei de pielarie [29].

Structura supramoleculara a colagenului puternic hidratata se comporta ca un cristal lichid. Proprietatile de cristal lichid se manifesta in vivo in etapele de structurare inalt ordonata (piele, cornee, cartilagiu, tendon) precum si in stari condensate (os). Proprietatile piezoelectrice sunt specifice pentru tesuturile tari (os) si semisolide (tendon, cartilaj) si au un rol important in remodelarea acestor tesuturi. Conductia electrica in colagen este de tip protonic si este influentata de continutul de apa si de temperatura.

Dupa cum se va vedea (capitolul 3) cunoasterea aprofundata a pro­prietatilor colagenului, comportarea lui in prezenta acizilor, bazelor, solutiilor de saruri, are o importanta practica pentru etapa de realizare a unor bioproduse colagenice biofunctionalizate prin dopare cu diferite oligoelemente.

Transformari termice ale colagenului

Influenta temperaturii asupra colagenului se manifesta la o anumita valoare prin fenomenul de contractie. Temperatura la care are loc contractia se numeste temperatura de contractie (T_c) si este specifica diferitelor materiale colagenice. La contractia colagenului, fortele moleculare devin mai mari decat fortele intermoleculare. Contractia nu are loc brusc la o temperatura data, ci este un proces lent care progreseaza in timp, pe masura desfacerii legaturilor intermoleculare [26].

Astfel, la pielea „gelatina” (piele bruta tratata cu alcalii) supusa incalzirii la 58-65°C, se observa deformarea fibrelor de colagen si scurtarea lor cu o treime din lungime, volumul lor crescand. Se produce fenomenul de contractie, iar colagenul capata vascozitatea si elasticitatea asema­natoare cauciucului.

Cresterea elasticitatii colagenului in urma contractiei se datoreaza distrugerii unei bune parti din legaturile prin care moleculele colagenice sunt orientate in structuri polimerice – protofibrile, fibrile, sau ghem - mai stabile termodinamic. Dupa ruperea acestor legaturi, moleculele capata forma sinusoidala. In figura 1.25 se prezinta elasticitatea colagenului contractat, comparativ cu a cauciucului si a colagenului necontractat [29] .

Figura 1.25. Curbele de intindere: 1 – colagen contractat; 2 – cauciuc; 3 – colagen necontractat

La temperaturi ridicate colagenul se distruge usor si nu se poate realiza topirea sa inainte de degradare. Temperatura de topire a colagenului deshidratat se apreciaza dupa temperatura de topire a aminoacizilor care sunt cristalini, precum si dupa cea a materialelor fibroase sintetice de tipul poliamidelor. Se stie ca fibrele poliamidice se compun din catene moleculare constituite dupa schema [26]:

NH – (CH₂)_n – CO – NH – (CH₂)_n – CO – NH – CO –

Aceste catene moleculare se leaga intre ele prin legaturi de hidrogen formand fibra poliamidica; la topirea fibrelor se rup legaturile de hidrogen.

Ruperea legaturilor intermoleculare se poate realiza prin topire sau prin dizolvare. Teoria solutiilor arata ca temperatura de topire a oricarei substante poate fi redusa daca poate fi intrebuintata in calitate de solvent pentru un alt compus. Colagenul poate fi considerat un „mediu solvent” pentru apa care patrunde in el in procesul de umflare. Prin cresterea gradului de umflare al colagenului, temperatura de contractie scade, iar prin deshidratare creste. Structura complexa a colagenului face ca procesul de contractie sa fie ireversibil, spre deosebire de topirea substantelor cristaline obisnuite in care s-au dizolvat substante straine [26] .

In procesul de contractie, ruperea partiala a legaturilor dintre catenele colagenului este insotita de o absorbtie insemnata de caldura (16,8 -25 cal). Prin racirea probei de colagen contractata o parte din legaturile distruse se refac, degajandu-se o cantitate mai mica de caldura decat cea absorbita la contractie (12 -13 cal).

Proprietati mecanice

Comportarea mecanica si fizico-chimica a colagenului se datoreaza dualismului structurii sale, cristaline si amorfe, cumuland proprietatile cristalelor si gelurilor.

Colagenul este o proteina fibroasa, care in tesuturi calcifiate actioneaza ca nucleu pentru depozitarea sarii, iar in tesuturile moi actioneaza ca „schelet” care sustine tesutul si da rezistenta in confruntarea cu fortele mecanice externe.

Proprietatile sale mecanice contin elemente de elasticitate, vascozitate si plasticitate. De asemenea el reactioneaza la diferite necesitati functionale, fapt demonstrat cu exactitate pe tractul reproductiv feminin in timpul sarcinii si in faza “recuperatorie” postnatala.

In derma pielii reteaua de colagen este mai densa si mai complicata decat cea din membranele bazale; este o tesatura compacta tridimensionala. Zona de limitare fata de tesutul subcutanat nu este o linie ferma, fibrele continuandu-se in tot tesutul, astfel incat aranjamentul fibrelor devine din ce in ce mai lax. Directia predominanta a fibrei este paralela cu suprafata, dar manunchiurile de fibre perpendiculare sunt destul de frecvente si tind sa creasca cantitativ, cu cat pielea este mai groasa. Elasticitatea pielii este favorizata si de continutul de 4% elastina [32].

Partea superioara a dermei, asa numitul strat papilar, cuprinde mai multe celule si este mai vascularizat decat partea lui principala, stratul reticular, care consta dintr-o retea tridimensionala de fibrile colagenice asa cum s-a observat prin microscopia electronica (Figura 1.26 si 1.27).

Comportarea la forfecare a fost studiata pentru a determina anumite proprietati mecanice legate de functia de protectie a pielii. Acest fapt poate fi demonstrat intepand pielea cu un ac ascutit, rotund si gros. Rezultatul nu este o gaura rotunda, ci o crapatura a carei directii poate varia in functie de regiunea de piele aleasa. Acelasi fenomen este prezent cand se produc incizii, marginile celor taiate in unghi drept cu directia despicaturii tinzand sa se traga inapoi mai mult decat cele taiate paralel cu ea.

Conceptul de baza morfologica pentru capacitatea de intindere a pielii se bazeaza pe comportare tip foarfeca, asa cum este ilustrata in figura 1.28, care confera o capacitate de intindere remarcabila in comparatie cu structurile cu fibre paralele (mai mult de 50% fata de 10-15%). Capacitatea de intindere a pielii, studiata in vitro, variaza considerabil in functie de locul si directia de aplicare a tensiunii si de varsta tesutului. De exemplu, s-au raportat valori de 30-47% pentru pielea de pe abdomenul uman al europenilor si valori de 100% pentru acelasi punct la japonezi [32].

Figura 1.28. Comportarea tip foarfeca a unei tesaturi din nylon sau o retea colagenica bidimensionala

Un fenomen aparte descris de catre Craik si McNail a fost descoperirea faptului ca fibrele de colagen din piele vopsite in tricromie (Mallory) in timpul tensionarii se fac rosii in loc de albastru [51, 52]. In timpul tensionarii, fibrele de colagen se reorienteaza prin intindere, conform imaginilor microscopice din figurile 1.26 si 1.27. Indepartarea elastinei prin tratare cu elastaza modifica comportarea mecanica prin aparitia unei deformari plastice marite, ceea ce arata ca fibrele de elastina joaca un rol important in refacerea aranjamentului initial al fibrelor dupa inlaturarea deteriorarii mecanice.

Existenta unei tensiuni in vivo in stare de repaus (adica o pretensionare) a constituit obiectul a numeroase studii efectuate pe mai multe structuri cu tesut conjunctiv.

S-au efectuat studii privind corelarea proprietatilor mecanice ale diverselor tipuri de tesut conjunctiv cu proprietatile functionale stabilindu-se importanta aranjamentului geometric al fibrelor colagenice. De exemplu, caracterul ondulat al manunchiurilor de fibre colagenice din tendon vazute la microscop pe proba in stare de repaus, dispare in momentul in care incepe partea de “varf” a curbei tensiune-alungire, perioada in care manunchiurile de fibre se lungesc treptat. La microscopul electronic lungimea benzilor de striatii specifice fibrelor de colagen este de aproximativ 680 Å la mostra relaxata si creste atunci cand mostra este intinsa mecanic, fapt observat si in studiile de difractii cu raze X. In comportarea mecanica a tesutului colagenic sunt incluse elemente de elasticitate, vascozitate si plasticitate, care pot fi in oarecare masura corelate cu aspectul morfologic. Substanta de baza are influenta asupra vascozitatii si plasticitatii, nu insa si asupra rezistentei la rupere a tesutului.

Colagenul nu este o proteina inerta si imobila chiar si in forma matura si “insolubila”. El reactioneaza la diferiti stimuli, in special la organismele tinere, inca in crestere. Colagenul reactioneaza la trauma si tensionare nu numai in locul traumatizat sau tensionat, ci in intreg organismul, chiar si la indivizii in varsta, atat din punct de vedere chimic (schimbare de entropie), cat si din punctul de vedere al proprietatilor mecanice [53].

Cu varsta, colagenul sufera schimbari succesive foarte asemanatore de la individ la individ si de la o specie de mamifere la alta. Schimbarile cuprind o crestere succesiva de colagen care devine mai strict organizat prin contributia legaturilor inter- si intramoleculare. La majoritatea speciilor aceasta dezvoltare este considerabil incetinita dupa ce se atinge maturitatea scheletului si cea sexuala.

Pretensionarea diferitelor elemente colagenice este prezenta la anumite tesuturi asa cum sunt pielea, tendonul, cartilajul din discul intervertebral. In cazul pielii, comportarea mecanica este mai complicata datorita geometriei 3D specifice arhitecturii colagenului.

2. SUPORTURI PE BAZA DE COLAGEN. PIEI SI BLANURI

Morfo-histologic, pielea este un organ tristratificat (epiderma, derma si hipoderma) fiecare strat avand rol fiziologic, structura, compozitie, reactivitate si comportament reologic bine definite.

Prin prelucrarea pieilor si blanurilor se urmareste obtinerea unor produse cu aspect, structura si proprietati specifice unor utilizari indelungate, astfel unele din structurile specifice acestora devin improprii si se impune eliminarea sau modificarea lor. Aceasta este practic sarcina tehnologiilor de prelucrare a pieilor si blanurilor , ea realizandu-se printr-o insiruire logica a operatiilor fizico-chimice si mecanice.

Din punct de vedere al prelucrarilor chimice, intereseaza in special derma pielii, care reprezinta un material fibros, proteic. Fibrele dermice au preponderent natura colagenica asociate cu mici cantitati de structuri proteice, elastinice si reticulinice.

Ca biopolimer proteic, colagenul este alcatuit din L-a-aminoacizi incatenati prin legaturi peptidice.

Matricea fibroasa reprezinta aproximativ 15-20% din greutatea dermei vii (aproximativ 75% din cea a dermei uscate si degresate) din care:

89% colagen

10% elastina

1% reticulina si altele

3. POSIBILITATI DE FUNCTIONALIZARE A COLAGENULUI PRIN PROCESE TEHNOLOGICE DE PRELUCRARE A PIEILOR SI BLANURILOR. MATERIALE CHIMICE AUXILIARE. TEHNOLOGII DE PRELUCRARE.

3.1 TEHNOLOGII DE PRELUCRARE

Trecerea pieilor si blanurilor crude si/sau brute (piei crude conservate prin diferite tehnici: sarare, uscare, congelare sau alte tratamente) in semifabricate de piele se face aplicand o tehnologie de prelucrare ce consta in efectuarea in etape a unor operatii succesive corelate, care modifica unele proprietati ale materiei prime si ii cofera altele cu totul noi regasite in general sau doar in mod specific in semifabricate.

La modul general, prelucrarea pieilor se face in trei etape distincte dupa scop.

1. Prima etapa urmareste transformarea compozitionala si structurala a materiei prime prin eliminarea unor componente care nu sunt necesare sau chiar impiedica prelucrarea ulterioara. Aceste operatii au drept consecinta afanarea structurii fibroase a pielii si modificarea reactivitatii chimice a acesteia.

Operatiile implicate in aceste modificari sunt:

a) INMUIEREA PIEILOR - urmareste rehidratarea acesteia pana la un nivel comparabil cu cel al pieilor proaspat jupuite, indepartarea agentului de conservare, a impuritatilor precum si a substantelor interfibrilare solubile in apa.

b) DESCARNAREA (STRECUIREA) - consta in indepartarea prin efect mecanic a aderentelor de pe ambele fete ale pielii, indeosebi resturile de hipoderma.

c) DEPARAREA-CENUSARIREA - urmareste inlaturarea epidermei si productiilor sale madificand totodata si structurile dermice si componentii necolagenici.

d) SERUIREA - elimina structurile si aderentele hipodermice labilizate in urma operatiilor anterioare.

e) DECALCIFICAREA - solubilizeaza si indeparteaza agentii alcalini utilizati la operatia anterioara.

f) SAMALUIREA - actioneaza enzimatic asupra structurii fibroase a dermei, relaxand-o si eliberand-o practic de structurile necolagenice.

g) PICLAREA – reprezinta un tratament acid care opreste actiunea enzimelor de samaluire si pregateste derma pentru operatia de tabacire.

2. A doua etapa decide practic ansamblul si nivelul proprietatilor de intrebuintare ale semifabricatului de piele. Ea consta in aplicarea unor tratamente chimice numite generic tabacire. Scopul tabacirii este acela de a conferii pielii stabilitatea compozitionala si dimensionala la solicitari hidrotermice si hidrolitice.

3. A treia etapa denumita generic finisare are preponderent drept scop definirea sortimentala si orientarea estetica. Prin finisare semifabricatul de piele capata o forma finala si niste caracteristici impuse sau dorite.

3.2 MATERIALE CHIMICE AUXILIARE

Auxiliarii de tratare preliminara si pregatire pentru tabacire sunt specii chimice care intervin mai ales asupra proteinelor nestructurate, glucidelor si lipidelor din piele. Aceste substante pot denatura, hidroliza, neutraliza, pot inhiba sau induce disocierea, scinda, solubiliza si emulsiona componentele pielii sau impuritatile de orice natura aderente la aceasta.

Aceste materiale pot apartine unei largi game de clase si specii chimice cum ar fi: enzimele, sarurile, acizii si bazele organice si anorganice, compusii tensioactivi etc.

Auxiliarii specifici tabacirii sunt caracterizati de faptul ca se pot lega chimic sau asocia fizic cu componentele proteice ale dermei astfel incat sa conduca la o stabilizare structurala si compozitionala a acesteia.

Din larga gama de auxiliari chimici amintim sarurile anorganice (de crom, aluminiu, zirconiu, fier), grasimi, compusi cu sulf, tananti vegetali, compusi organici etc.

Auxiliarii de finisare au rolul de a se lega sau depune pe structurile proteice ale pielii tabacite sau de a adera la suprafata acesteia, schimbandu-i unele caracteristici.

Dintre auxiliarii uzuali din aceasta clasa se pot enumera colorantii si pigmentii, grasimi naturale si sintetice, compusi inerti saruri, acizi, baze si nu in ultimul rand cateva clase de polimeri.

3.3 POSIBILITATI DE FUNCTIONALIZARE A COLAGENULUI PRIN PROCESE TEHNOLOGICE DE PRELUCRARE A PIEILOR SI BLANURILOR

4. POSIBILITATI DE TRATARE A PIEILOR SI BLANURILOR PENTRU UZ COTIDIAN SI MEDICAL

5. NANOMATERIALE UTILIZATE PENTRU FUNCTIONALIZAREA COLAGENULUI

II. PREZENTAREA TEMEI DE CERCETARE

Proiectul de cercetare stiintifica urmareste ……………..

Elementul de noutate este ……………….

METODE DE ANALIZE EXPERIMENTALE

1. Metode de analiza chimica

- materii volatile (%)

- continut de substante grase (%)

- continut de substante minerale totale (%)

- determinarea continutului de oxizi metalici in cenusa (%)

- substante extractibile (%)

- oxidul de crom (%)

- substanta dermica (%)

- pH-ul extractului apos

…………….

2. Metode de analiza microscopica

- microscopie optica: - de suprafata

- de sectiune

- microscopie cu transmisie de electroni (TEM)

- microscopie electronica (SEM)

- microscopie atomica (AFM)

3. Metode de analiza fizico-mecanice

- alungire la rupere (%)

- rezistenta la sfasiere (N)

- rezistenta la frecare uscata (note de la 1…..5)

- indice de contractie (%)

- temperatura de contractie ( C)

- rezistenta la cusatura (…)

………………….

4. Metode de analiza spectrala

- spectroscopie in reflexie

- spectroscopie IR

- spectroscopie UV-VIS

- spectroscopie de raze X (XPS)

- spectroscopie de fluorescenta

5.

III. BIBLIOGRAFIE