Cromatografia de lichide

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gama extinsa de sisteme cromatografice care au īn comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida.

Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul ca permite si analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul ca si faza mobila participa la separare ofera posibilitati suplimentare pentru realizarea unor separari eficiente.

Cromatografia de lichide clasica a fost caracterizata de utilizarea unor coloane cu diametre mari, umplute cu particule de faza stationara de o granulatie fina si prin care faza mobila trecea sub influenta fortei gravitationale. Aceste sisteme, care se mai folosesc azi īn separarile cromatografice lichid-solid, au permis realizarea separarii unor amestecuri complexe de substante īn conditii foarte bune, īnsa viteza de separare este mica iar analiza suplimentara a compusilor separati prin metode spectroscopice este mai dificila. Aparitia cromatografiei de lichide de īnalta performanta (HPLC) a permis eliminarea acestor deficiente si chiar impunerea cromatografiei de lichide ca o metoda mai performanta de analiza decāt cromatografia de gaze. Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de īnalta performanta sunt:

Capacitate de separare ridicata

Viteza ridicata a separarii

Posibilitatea monitorizarii continue a efluentului coloanei

Realizarea unor analize repetate si reproductibile utilizānd aceeasi coloana

Automatizarea procedurii analitice si a prelucrarii datelor.

Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horvįth la Universitatea din Yale īn 1964 si a tehnica fost denumita cromatografie de lichide de īnalta presiune (HPLC). Īn continuare, termenul care s-a impus a fost cel de cromatografie de lichide de īnalta performanta. Prima separare realizata de grupul lui Horvįth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea extraordinara a acestei tehnici īn ultimii zeci de ani se datoreste īn mare masura faptului ca a permis analiza unor compusi care puteau fi separati foarte greu pe alte cai, de exemplu a biomoleculelor.

Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:

cromatografia de adsorbtie lichid-solid (LSC)

cromatografia de repartitie lichid-lichid (LLC)

cromatografia ionica (IC)

cromatografia prin excluziune (SEC)

4.1. Factorii care influenteaza separarea īn cromatografia de lichide

Pentru a putea utiliza cromatografia de lichide ca metoda de analiza īn conditii satisfacatoare, nu este necesara cunoasterea īn amanunt a teorei cromatografiei de lichide, dar este indispensabila stapānirea notiunilor de baza, mai ales pentru a se putea face selectia fazelor cromatografice īntr-o maniera corecta.

Īn ciuda complexitatii aparente a instrumentului, partea esen&# 444i86e 355;iala a analizei cromatografice este procesul de separare care are loc īn coloana, restul aparaturii avānd doar rolul auxiliar de a asigura depozitarea fazei mobile, asigurarea compozitiei sale stabilite si a presiunii de intrare īn coloana, introducerea probei, detectarea componentelor separate si procesarea datelor. Ca urmare a modului īn care este conceput designul aparatelor moderne, aceasta esenta se pierde īnsa de multe ori īn spatele complexitatii electronice sau ingineresti a īntregului sistem. Rezultatul este ca rolul important al functiunii coloanei este īnteles doar superficial si tehnica cromatografica nu este utilizata īntr-o maniera adecvata.

Īn timpul separarii cromatografice īn coloana au loc doua procese care se produc simultan, continuu si aparent independent una de alta. Prima este deplasarea fiecarui solut printr-o succesiune de echilibre de distributie īntre faza mobila si cea stationara, īn conformitate cu coeficientul sau de distributie. Al doilea proces este specific coloanei, care trebuie sa limiteze dispersia naturala a solutilor astfel īncāt la iesirea din coloana fiecare solut sa se regaseasca sub forma unei benzi de elutie cāt mai īnguste si distincte de celelalte. Primul proces, cel al retentiei componentelor, este de natura termodinamica si poate fi controlat prin alegerea corespunzatoare a naturii fazelor cromatografice. Cel de-al doilea proces este, īn esenta, de natura cinetica si depinde de proprietatile fizice ale componentelor sistemului de separare cromatografica: faza stationara si faza mobila. Pentru a putea realiza o separare optima, pentru fiecare proba va trebui gasita perechea de faze cea mai potrivita si selectata coloana corespunzatoare.

Īn cromatografia de lichide, ecuatia esentiala care permite īntelegerea procesului de retentie si identificarea parametrilor cu ajutorul carora va fi posibila optimizarea analizei este ecuatia volumului de retentie.

(60)

unde V_M este volumul mort al coloanei, K este coeficientul de distributie al solutului, iar V_S este volumul fazei stationare. Aceasta relatie este dedusa pe baza teorei talerelor a lui Martin si Synge, perfectionata apoi de alti autori. Īn cromatografia de lichide, spre deosebire de cromatografia de gaze, volumul fazei stationare din coloana nu mai poate fi definit asa de net. Īn majoritatea cazurilor, īn separare nu intervine īntregul acest volum ci numai volumul fazei stationare disponibil solutului.

Separarea a doi compusi va fi posibila daca volumele lor de retentie vor fi diferite, adica īn cazul īn care fie coeficientii de distributie ai celor doi soluti vor fi diferiti, fie volumul de faza stationara disponibil fiecarui component al amestecului analizat va fi diferit. Asadar pentru a realiza separarea dorita trebuie studiati factorii care influenteaza acesti doi parametri, coeficientul de distributie si volumul fazei stationare disponibile.

Coeficientul de distributie este raportul dintre concentratia solutului īn faza stationara si concentratia īn faza mobila, fiind o masura a interactiunilor moleculare dintre solut si cele doua faze.

4.1.1. Interactiuni moleculare care influenteaza coeficientul de distributie

Aceste interactiuni sunt consecintele fortelor ce se manifesta īntre moleculele celor doua faze cromatografice si cele ale solutului Aceste forte pot fi de patru tipuri: forte chimice, forte ionice, forte polare si forte de dispersie. Exista si alte forte, cele bazate pe legaturi de hidrogen, īnsa pentru simplificare acestea sunt considerate ca fiind o categorie de forte polare foarte puternice. Prin alegerea corespunzatoare a fazelor, toate aceste interactiuni pot fi astfel dirijate īncāt sa se realizeze retentia dorita.

Fortele chimice pot fi considerate practic ireversibile, cel putin īn cromatografie si drept consecinta coeficientul de distributie al solutului legat prin asemenea forte de faza stationara este apropiat de infinit. Un exemplu de cromatografie de lichide bazat pe asemenea interactiuni este cea de afinitate, īn care una dintre moleculele probei analizate interactioneaza chimic cu gruparea de afinitate a fazei stationare si substanta respectiva este extrasa selectiv dintre compusii prezenti īn sistem. Acest tip de cromatografie reprezinta asadar mai mult o extractie decāt o separare cromatografica, iar īn celelte tipuri de cromatografie fortele chimice nu au un rol semnificativ.

Fortele ionice se bazeaza pe sarcinile electrice care rezulta īn urma ionizarii moleculelor īn solutie. Aceste interactiuni sunt exploatate de cromatografia ionica. Daca solutul se prezinta sub forma de anioni, ca de exemplu īn cazul acizilor organici, faza stationara va trebui sa contina cationi cu sarcina pozitiva drept contraioni pentru a interactiona cu anionii respectivi si a īncetini deplasarea lor prin coloana. Īn mod corespunzator, pentru separarea compusilor cu caracter cationic prezenti īn proba analizata, faza stationara va trebui sa contina contraioni de tip anionic. Fazele stationare ionice sunt constituite īn mod obisnuit din polimeri reticulati care au fost modificati chimic pentru a li se grefa gruparile schimbatoare de ioni dorite. O alta alternativa este utilizarea unor faze chimic legate cu grupari schimbatoare de ioni, īn acest caz gruparile respective fiind legate chimic de un suport de silicagel, asemenanator ca īn cazul altor faze stationare chimic legate. A treia posibilitate este de a adsorbi compusul schimbator de ioni pe suprafata fazei stationare, acest tip de cromatografie fiind denumit cromatografie prin perechi de ioni. Compusul respectiv este introdus īn faza mobila īn concentratie redusa (īn jur de 1%), de unde se adsoarbe pe faza stationara chimic legata.

Fortele polare au la baza de asemenea sarcinile electrice ale moleculelor, īnsa īn acest caz este vorba de dipoli permanenti sau indusi. Trebuie mentionat ca o molecula polara nu poseda sarcini nete, exceptānd situatia īn care molecula respectiva este īn acelasi timp si ionizata. Exemple de substante cu dipoli permanenti sunt alcoolii, esterii, aldehidele, etc. Molecule polarizabile sunt, printre altele, hidrocarburile aromatice ca benzenul, toluenul sau xilenii. Exista compusi cu dipoli permanenti care īn acelasi timp sunt si polarizabili, ca de exemplu 2-fenil-etanolul. Pentru a separa compusii polari sau polarizabili, va trebui utilizata o faza stationara polara īn combinatie cu o faza mobila relativ nepolara. Realizarea de interactiuni moleculare diferite īn cele doua faze reprezinta o modalitate generala pentru a obtine selectivitate īn separarile cromatografice. Pentru a realiza retentia si selectivitatea necesara, trebuie ca un anumit tip de interactiuni specifice sa fie dominante īn faza stationara, iar interactiunile din faza mobila sa fie diferite fata de cele din faza stationara pentru a mentine selectivitatea fazei stationare. De exemplu pentru a separa niste hidrocarburi aromatice, care sunt compusi polarizabili, se va folosi o faza stationara puternic polara, cum este silicagelul si a faza mobila nepolara, cum este hexanul.

Fortele de dispersie sunt mult mai dificile de caracterizat. Ele sunt īn esenta electrice prin natura lor, īnsa rezulta mai mult din fluctuatiile de sarcina decāt din sarcinile electrice propriu-zise ale moleculelor. Exemple de interactiuni de dispersie sunt fortele care se manifesta īntre moleculele hidrocarburilor saturate. Acesti compusi nu au caracter ionic, nu sunt polarizabile si nu au momente dipol, totusi cele superioare nu sunt gaze ci lichide sau solide īntrucāt moleculele lor sunt tinute laolalta de fortele de dispersie. Pentru ca fenomenul de retentie sa fie bazat pe interactiuni de dispersie trebuie ca faza stationara sa nu contina grupari ionice sau polare ci numai grupari hidrofobe, asa cum este cazul fazelor stationare inverse din cromatografia HPLC. Īn plus, faza mobila trebuie sa fie puternic polara pentru ca intercatiunile de dispersie īn aceasta faza sa fie minime. Asemenea faze sunt cele de tipul amestecurilor metanol-apa sau acetonitril-apa.

Īn sistemele reale, doar īn putine cazuri este īntālnita situatia īn care distributia este determinata doar de un singur tip de interactiuni. Daca totusi se īntāmpla acest lucru, poate fi vorba numai despre interactiuni de dispersie. Interactiunile polare sunt īnsotite īntotdeauna de interactiuni ionice si de dispersie, iar cele ionice de interactiuni polare si de dispersie.

4.1.2. Factorii care influenteaza disponibilitatea fazei stationare

Asa cum rezulta din ecuatia volumului de retentie, nu numai taria interactiunii dintre solut si faza stationara va fi cea care determina retentia solutului ci si volumul fazei stationare prezente īn sistem si accesibile solutului. Volumul fazei stationare cu care componentele amestecului de analizat pot interactiona depinde de starea fizica a fazei stationare si a suportului. Daca faza stationara este un solid poros si dimensiunile porilor suportului sunt comparabile cu diametrele moleculare ale componentelor de separat, atunci faza stationara va fi selectiva pentru marimea moleculelor acestora. Moleculele anumitor soluti vor putea patrunde īn interiorul porilor si vor interactiona cu mai multa faza stationara decāt alte molecule mai mari care vor fi partial excluse de la aceste interactiuni. Asadar, separarea va fi controlata de fenomenul de excluziune bazat pe marimea moleculelor si de aceea se numeste cromatografie de excluziune. Daca faza stationara va fi chirala, cantitatea de faza stationara disponibila pentru a interactiona cu solutul va fi doar aceea care din punct de vedere steric se potriveste cu orientarea spatiala a moleculei de solut. Acest tip de cromatografie se numeste cromatografie de lichide chirala. Trebuie mentionat ca īn functie de natura fazei stationare ambele aceste tipuri, cromatografia de excluziune sau cromatografia chirala, pot sa se īncadreze fie īn categoria cromatografiei lichid-lichid fie īn a celei de tip lichid-solid.

4.1.3. Eficienta de separare a coloanei cromatografice

Īn timpul deplasarii prin coloana cromatografica nu este suficient ca benzile de elutie ale celor doi soluti sa migreze diferentiat, ci este necesar ca ele sa fie destul de īnguste pentru ca sa se separe cāt mai complet una de alta. Parametrul de eficienta care ne arata posibilitatea separarii a doi compusi pe baza selectivitatii termodinamice este coeficientul de separare α, definit pe baza raportului factorilor de capacitate a celor doi soluti.

(61)

Se observa ca coeficientul de separare coreleaza interactiunile din faza stationara si cele din faza mobila.

Asadar īn cromatografia de lichide, coeficientul de separare poate fi optimizat prin doua modalitati:

alegerea corespunzatoare a fazei stationare;

alegerea corespunzatoare a fazei mobile.

Toti factorii care modifica interactiunile moleculare sau intensitatea acestora, atāt īn faza mobila cāt si īn sau faza stationara vor determina īn acelasi timp si modificarea selectivitatii.

Īn cromatografia de lichide, faza stationara (indiferent ca este polara sau nepolara) va adsorbi īntotdeauna īn mod preferential o anumita componenta a eluentului, iar grosimea stratului de adsorbtie (d_f) depinde de natura fazei stationare si a solventului adsorbit (Figura 4.1). Cu cāt ne īndepartam de suprafata, cu atāt scade taria legaturii acestei adsorbtii si este discutabil unde trebuie plasata delimitarea dintre faza mobila adsorbita si cea neadsorbita. Daca se modifica compozitia fazei mobile acest lucru determina automat si schimbarea compozitiei stratului de faza mobila adsorbita la suprafata fazei stationare, iar drept consecinta modificarea interctiunilor dintre solut si cele doua faze.

Figura 4.1. Formarea stratului de faza mobila adsorbita pe suprafata fazei stationare

Valoarea calculata a coeficientului de separare depinde de timpul mort al coloanei respective īn conditiile de lucru. Determinarea acestui timp mort nu este īnsa asa de simpla ca īn cromatografia de gaze, deoarece īntr-o coloana cromatografica de gaze volumul mort poate fi net delimitat, īn timp ce īntr-una de lichide aceasta delimitare depinde de grosimea filmului de faza mobila adsorbita la suprafata fazei stationare.

O alta problema īn cromatografia de lichide este ca majoritatea adsorbentilor (fazelor stationare) utilizati fiind porosi, īntr-o parte a porilor faza mobila va stagna si aici compozitia fazei mobile poate fi diferita de cea din zonele unde ea se gaseste īn miscare. Pentru a avea valori reproductibile ale timpului mort (t_M=L/v), acesta ar trebui determinat folosind un compus care nu interactioneaza cu faza mobila adsorbita. Īn realitate un asemenea compus nu exista, de aceea īntotdeauna trebuie precizat cu ce substanta s-a facut determinarea timpului sau volumului mort. Aceasta relativitate īn determinarea timpului mort are influenta si asupra valorilor parametrilor de retentie, mai ales a factorului de capacitate.

Cromatografia de lichide este capabila de rezolvarea unor probleme de separare foarte complexe īn buna parte datorita faptului ca prin modificarea sistematica a compozitiei eluentului se pot obtine valori ale coeficientului de separare īntr-un interval destul de larg.

Realizarea unui coeficient de separare diferit de 1 este o conditie necesara, nu īnsa si suficienta pentru o separare corespunzatoare, deoarece la aceeasi valoare a acestui coeficient putem avea o separare foarte buna, dar si total nesatisfacatoare a componetelor respective (Figura 4.2).

Figura 4.2. Influenta abaterii standard asupra separarii cromatografice

Pentru separarea sa fie corespunzatoare, trebuie ca selectivitatea termodinamica sa fie asociata cu o eficienta cinetica corespunzatoare, adica cu o viteza mare de transfer a moleculelor de solut din faza mobila īn faza stationara si invers. Masura acestei eficiente cinetice este latimea picului, respectiv abatarea standard σ. Aceasta abatere standard se poate masura pe baza curbei Gauss care caracterizeaza picul respectiv. Dispersia picului, respectiv cresterea abaterii standard depinde īnsa nu numai de eficienta cinetica a coloanei ci si de distanta parcursa de solut īn coloana, adica de lungimea coloanei. Pentru a se putea face o comparatie īntre diferite coloane, trebuie utilizata o valoare relativa a dispersiei solutului (si implicit a largirii picului), ceea ce se face cu ajutorul unui parametru de numit numar de talere teoretice N. Valoarea acestuia se calculeaza cu relatia:

(62)

unde σ_t si σ_L reprezinta abaterea standard exprimata īn unitati de timp, respectiv īn unitati de lungime. Numarul de talere teoretice depinde īnsa si el de lungimea coloanei, de aceea pentru eliminarea acestor diferente se utilizeaza lungimea de coloana echivalenta unui taler teoretic. Acesta poarta numele de īnaltimea echivalenta a talerului teoretic (H) si se calculeaza prin raportarea lungimii coloanei la numarul de talere teoretice. Cu cāt aceasta īnaltime este mai mica, eficienta cinetica de separare a coloanei va fi mai mare.

Parametrii N si H (ca si cei efectivi N_ef si H_ef, care se refera la dispersia picului īn faza stationara) se pot utiliza pentru a compara eficienta de separare a diferitelor coloane. Ele sunt deduse pe baza teoriei talerelor īn cromatografie, īnsa nu ne dau nici un fel de informatii despre fenomenele care se produc īn coloana si parametrii care infuenteaza aceste fenomene. Pentru a explica aceste fenomene, īn special rolul proceselor difuzionale īn cromatografie, a fost elaborata o alta teorie, teoria cinetica. Teoria cinetica explica dispersia picurilor cromatografice īn timpul deplasarii prin coloana, considerāndu-le drept rezultatul a trei procese:

- difuzia turbulenta

- difuzia moleculara

- rezistenta la transferul de masa

Corelarea acestor procese este data de ecuatia lui Van Deemter, care a fost dedusa pentru cromatografia de gaze, īnainte ca cromatografia de lichide sa fi fost raspāndita pe scara larga. Aceasta ecuatie ne da corespondenta dintre īnaltimea echivalenta a talerului teoretic si viteza fazei mobile si poate fi scrisa īn forma restrānsa astfel:

(63)

Cei trei termeni ai ecuatiei reprezinta contributia la īnaltimea echivalenta a talerului si implicit la largirea picului cromatografic a celor trei factori mentionati: difuzia turbulenta, difuzia moleculara si rezistenta la transferul de masa. Aceasta relatie este valabila īn principiu pentru toate sistemele cromatografice. Īn cromatografia de lichide, rolul principal īn dispersia zonei īi revine rezistentei la transferul de masa si termenul de rezistenta la transferul de masa contine doua asemenea rezistente, una in faza mobila si una īn faza stationara. Asadar fata de cromatografia de gaze apare īn plus termenul de rezistenta la transferul de masa īn faza mobila, care are un rol foarte important īn dispersia zonei cromatografice. Ecuatia Van Deemter pentru cromatografia de lichide se scrie īn forma generala astfel:

unde C_S si C_M repezinta coeficientul de rezistenta la transferul de masa īn faza stationara, respectiv īn faza mobila.

La deplasarea fazei mobile īn coloana avem mai multe cauze care determina diferente īn ce priveste rezistenta la transferul de masa din faza mobila pe faza stationara si invers. Majoritatea fazei mobile este īn miscare, īnsa exista zone stagnante care se gasesc fie adsorbite pe suprafata granulelor de faza stationara fie īn interiorul porilor (Figura 4.3).

Figura 4.3. Rezistenta la transferul de masa īn umpluturi poroase

Solutul ajunge la suprafata fazei stationare trecānd prin filmul de faza mobila care stagneaza. Relatia matematica ce reda componenta de rezistenta la transferul de masa pentru acest proces de difuzie īn interiorul particulei este complicata, esential fiind īnsa faptul ca contine termenul d_p².

(65)

sau mai simplu:  (66)

unde θ este o constanta care depinde de structura poroasa a particulei, k₀ este raportul dintre volumul interior al particulei si volumul liber dintre particule, ν_e este viteza de curgere a fazei mobile īn spatiul dintre particule, iar D_m este coeficientul de difuziune īn faza mobila.

Asadar rezistenta la transferul de masa si deci contributia la largirea zonei este proportionala cu patratul diametrului particulei. Pentru a avea eficienta cinetica ridicata īn procesele cromatografice de lichide, este neaparat necesara folosirea unor umpluturi cu diametre mici de particule. Īn acelasi timp, aceasta componenta difuzionala este invers proportionala cu coeficientul de difuziune īn faza mobila, ceea ce īnseamna ca va fi avantajoasa folosirea unor solventi cu vāscozitate cāt mai mica.

Influenta diametrului particulei asupra īnaltimii echivalente a talerului teoretic se poate observa si din Figura 4.4, care reda graficul ecuatiei Van Deemter pentru diferite dimensiuni de particule. Cu cāt d_p este mai mic si īn consecinta H mai mic, cu atāt eficienta de separarea a coloanei va fi mai ridicata si sansele de a separa compusi avānd proprietati fizico-chimice asemanatoare vor fi mai mari.

Figura 4.4. Influenta diametrului particulelor asupra ecuatiei Van Deemter

Diferenta de eficienta dintre coloanele cu diametre diferite ale particulelor este importanta atunci cānd valoarea lui H este determinata īn cea mai mare parte de termenii A si C, adica la viteze mari ale fazei mobile. Asadar din punct de vedere analitic ar fi indicata folosirea unei umpluturi cu diametru mic la viteze mari ale fazei mobile, cānd influenta teremului C·v este determinanta, īnsa posibilitatea modificarii acestora este limitata din cauza pierderilor de presiune pe coloana cromatografica.

Pierderea de presiune pe coloana este data de urmatoarea relatie:

(67)

unde φ reprezinta rezistenta coloanei la curgere, iar η este vāscozitatea eluentului. Asadar pierderea de presiune este direct proportionala cu lungimea coloanei, vāscozitatea eluentului si viteza fazei mobile si invers proportionala cu patratul diametrului particulelor de umplutura.

Daca se utilizeaza coloane de lungimi mici, pierderea de presiune poate fi redusa, īnsa si reducerea lungimii coloanei se poate face doar pāna la o anumita limita (ea influenteaza nefavorabil eficienta coloanei exprimata prin numarul de talere teoretice). O alta problema este ca, lucrāndu-se cu umpluturi cu diametre mici de particule la debite mari, apare un gradient termic atāt pe lungimea cāt si pe sectiunea coloanei. Cresterea de temperatura pe lungimea coloanei poate fi foarte importanta ajungānd la 20-30ŗC, ceea ce modifica vāscozitatea eluentului si poate crea o serie de alte probleme, cum ar fi largirea picurilor sau asimetria acestora. Pe baza acestor considerente, se poate afirma ca īn conditiile tehnice actuale diametrul de 2 μm al particulelor de umplutura reprezinta acea limita la care se atinge eficienta cinetica maxima, fara a afecta functionalitatea coloanei.

O alta posibilitate de a mari eficienta de separare a coloanei ar fi cresterea lungimii coloanei, tinānd cont de faptul ca numarul de talere teoretice este proportional cu patratul lungimii coloanei. Folosirea unor coloane mai lungi de 30 cm este īnsa limitata de faptul ca umplerea uniforma a unei coloane lungi este dificila de realizat din punct de vedere practic, iar o umplutura neuniforma va avea o eficienta mai scazuta datorita cresterii termenului difuzional A din ecuatia Van Deemter. Pe de alta parte, s-a vazut ca si pierderea de presiune īn coloana creste odata cu cresterea lungimii acesteia. S-a constatat īnsa ca la legarea mai multor coloane cu umplutura de dimensiuni mici īn serie, īn anumite cazuri s-a obtinut o īnsumare a numarului de talere teoretice, dar numai cānd coloanele au fost foarte asemanatoare, pentru ca proprietatile de curgere prin aceste coloane sa nu fie diferite.

Un alt parametru de eficienta a separarii este rezolutia R_S. Relatia de calcul a rezolutiei, care coreleaza toate tipurile de interactiuni care influenteaza separarea, este:

(68)

Īn aceasta relatie, atāt numarul de talere teoretice cāt si factorul de capacitate sunt calculate pentru componenta cu timp de retentie mai mare. Primul termen al acestei relatii ne arata dependenta rezolutiei de factorii cinetici (dispersia picului cromatografic), cel de-al doilea termen de factorii termodinamici (exprimati prin coeficientul de separare) iar cel de-al treilea termen de factorii care determina retentia componentei. Pentru ca o separare sa fie corespunzatoare trebuie ca:

α > 1,05

1< k' < 10 (optim 2 < k' 5)

N > 12000

Īn aceste conditii, rezolutia minima a doua componente trebuie sa fie de cel putin 1 (preferabil 1,5). Īn cromatografia de lichide se realizeaza eficiente īnalte de separare ale coloanelor, mai ales daca diametrul particulelor de umplutura este mic, ajungāndu-se curent la un numar de talere de 100.000 sau chiar mai mult. Aceasta īnseamna ca se pot atinge si rezolutii ridicate ale separarilor.

4.2. Analiza calitativa īn cromatografia de lichide

Primul parametru care a fost utilizat pentru identificare īn cromatografia de lichide a fost volumul de retentie ajustat V_R'. Exista īnsa o problema majora privind utilizarea acestui parametru, aceea legata de determinarea volumului mort. Volumul de retentie ajustat este diferenta dintre volumul de retentie si volumul mort, īnsa volumul mort (V_M) ar trebui sa fie doar volumul fazei mobile din coloana si nu volumul total de lichid care se gaseste īntre injector si detector. Volumul mort total (V_Mt) va include si volumele aferente injectorului, tubulaturii de conectare īntre injector, detector si coloana si celulei de masura. El se poate determinat doar utilizānd un solut care nu se adsoarbe pe faza stationara si care are aceeasi marime moleculara cu cea a solutului analizat pentru a avea aceleasi interactiuni de excluziune. Daca īnsa volumul de retentie ajustat este mult mai mare decāt volumul mort total, atunci orice solut care nu se adsoarbe poate fi utilizat pentru determinarea volumului mort si īn acest caz volumul de retentie ajustat poate fi utilizat drept parametru calitativ. Aceasta utilizare este īnsa limitata de dependenta volumului de retentie ajustat de conditiile de analiza, mai ales de lungimea coloanei si debitul fazei mobile.

Factorul de capacitate poate fi de asemenea utilizat pentru scopuri de identificare, īnsa si el depinde de volumul mort, fiind īn realitate exprimat īn functie de volumul mort total īntrucāt acesta este cel determinat experimental. Este mai potrivit pentru analiza calitativa decāt volumul de retentie ajustat, īnsa are dezavantajul ca depinde de raportul fazelor, care difera de la coloana la coloana.

Utilizarea coficientului de separare α are avantajul ca elimina efectul erorilor de identificare datorate rapoartelor de faze diferite si debitelor de faza mobila diferite care pot apare la trecerea de la o coloana la alta. Īn cromatografia de lichide, coficientul de separare se poate exprima si ca raportul volumelor de retentie ajustate a doi soluti prin relatia:

(69)

Daca ignoram efectele de excluziune si consideram ca marimile moleculelor celor doi soluti sunt apropiate, rezulta ca coeficientul de separare va fi egal cu raportul coeficientilor de distributie, adica va fi independent de raportul fazelor si de debitul fazei mobile. Pentru a usura obtinerea unor valori mai reproductibile care sa fie utilizate īn scopul identificarii calitative, de multe ori īn sistem se introduce o substanta standard si coeficientul de separare al tuturor componentelor probei de analizat este exprimat fata de acest standard. Valorile astfel calculate reprezinta de fapt retentiile relative (r) fata de standardul ales.

Trebuie īnsa precizat ca nici una dintre metodele prezentate bazate pe retentie nu poate duce la identificari calitative certe si lipsite de ambiguitati. Pentru aceasta este nevoie si īn cazul cromatografiei de lichide de utilizarea unor metode auxiliare de identificare, dintre care cele mai bune sunt cele spectrometrice: IR, RMN, masa. Exista la ora actuala sisteme LC-MS sau LC-IR care permit o analiza calitativa lipsita de erori. De multe ori este foarte utila si confirmarea omogenitatii picului cromatografic, adica a faptului ca picul respectiv reprezinta semnalul doar a unei singure componente. Acest lucru poate fi realizat prin folosirea unui detector cu sir de diode.

4.3. Tehnici ale cromatografiei de lichide

4.3.1. Cromatografia de adsorbtie lichid-solid

Cromatografia lichid-solid (LSC), numita si cromatografie de adsorbtie, utilizeaza o faza mobila lichida si o faza stationara solida formata dintr-o pulbere poroasa avānd capacitate mare de adsorbtie si o suprafata specifica ce variaza īntr-un domeniu foarte larg, īntre 50-1000 m²/g. Acest tip de cromatografie se bazeaza pe interactiunea moleculelor solutului cu centrii activi aflati pe suprafata unui adsorbent solid care reprezinta faza stationara. Adsorbentul se poate gasi fie īntr-o coloana (īn cazul cromatografiei pe coloana) fie pe suprafata unei placi (īn cazul cromatografiei īn strat subtire). Granulatia umpluturii variaza pe un domeniu larg, de la 5 μm īn cazul celor folositi īn HPLC si pīna la mai mult de 100 μm īn cazul celor folositi īn cromatografia pe coloane clasice.

Cromatografia lichid-solid poate fi utilizata cu rezultate bune atāt pentru separarea compusilor polari cāt si a celor nepolari si este folosita cu precadere īn separarile cantitative ale amestecurilor de substante organice, atunci cānd aceste amestecuri nu sunt foarte complexe. Īn general, compusii care se pot separa cel mai bine prin tehnica LSC sunt cei care au caracter neionic si sunt solubili īn solventi organici. Compusii neionici solubili īn apa se separa mai bine prin cromatografie de lichide pe faza inversa sau cromatografie cu faze chimic legate.

Din punct de vedere istoric, a fost prima tehnica cromatografica utilizata (Ţvet).

4.3.1.1. Teoria echilibrului de adsorbtie

Teoria echilibrului de adsorbtie īn cazul LSC se bazeaza īn cea mai mare parte pe izotermele de adsorbtie de tip Langmuir. Aceste izoterme sunt presupuse a fi specifice adsorbtiei moleculelor plane sau orizontale, aria necesara adsorbtiei unei molecule īn acest caz fiind mai mare decāt la adsorbtia īn configuratie verticala. Acest lucru influenteaza cantitatea de proba necesara a fi adsorbita pentru formarea unui strat monomolecular.

Expresia matematica a izotermei Langmuir pentru adsorbtia din faza lichida este de forma:

(70)

unde θ este fractia molara de acoperire a suprafetei adsorbentului de catre componenta adsorbita, K⁰ este constanta termodinamica a procesului de adsorbtie, iar x_i(M) este fractia molara a componentei respective īn faza mobila.

Īn majoritatea cazurilor, suprafata adsorbentului este complet acoperita de un strat monomolecular format din moleculele componentei i si moleculele solventului S. La adsorbtia lichid-solid, exista īntotdeauna o competitie īntre moleculele probei si moleculele solventului pentru ocuparea unui loc de pe suprafata adsorbentului.

Daca se considera stratul monomolecular de solvent drept o faza lichida distincta adiacenta la suprafata adsorbentului, atunci echilibrul de adsorbtie se va putea scrie ca o simpla repartitie a componentei i īntre cele doua faze lichide:

unde indicii (M) si (a) reprezinta starea neadsorbita si respectiv adsorbita.

Constanta de echilibru a acestei distributii reprezinta coeficientul de repatitie si este dat de:

(71)

x reprezentānd fractia molara a componentei i īn faza adsorbita, respectiv faza mobila.

Constanta termodinamica de distributie īnte cele doua faze este data de relatia:

(72)

a_i(a) si a_i(M) fiind activitatile respective.

La concentratii mici se poate considera ca K_x = K⁰. Din punct de vedere practic este īnsa mai comod sa definim un alt coeficient de repartitie bazat pe concentratii molare, conform relatiei :

(73)

unde:

n_i(a) reprezinta numarul de moli de compus i adsorbit, raportat la cantitatea de adsorbent W (grame)

n_i(M) reprezinta numarul de moli de compus din faza mobila, raportat la volumul fazei mobile V_M (ml).

Volumul de retentie V_R si migrarea relativa R_f se exprima īn cromatografia de adsorbtie cu ajutorul relatiilor:

(74)

(75)

Valoarea factorului de capacitate k' va fi īn acest caz:

(76)

4.3.1.2. Faze stationare utilizate īn cromatografia lichid-solid

Īn cromatografia LSC se folosesc drept faze stationare o serie de materiale pulverulente, dintre care cele mai utilizate sunt alumina si silicagelul. Īn masura mai mica se folosesc silicatul de magneziu, pamāntul de diatomee, cāt si o serie de alti adsorbenti: amidon, inulina, fosfat de calciu, carbonat de calciu, hidroxid de calciu. Acestea din urma se utilizeaza numai pentru cazuri speciale si deoarece se prezinta sub forma de pulberi fine trebuie amestecate cu pamānt de diatomee pentru a permite trecerea fazei mobile.

Un anumit adsorbent poate manifesta variatii mari ale suprafetei specifice si ale energiei superficiale īn functie de metoda de preparare, modul de activare si gradul final de dezactivare. Aceste diferente se vor regasi si īn valorile parametrilor de retentie cromatografici. Suprafata acestor adsorbenti este īn general eterogena, prezentānd activitati diferite. Suprimarea pozitiilor active (mai ales īn ce priveste formarea legaturilor de hidrogen, dar si a centrilor acizi sau bazici) sau dezactivarea prin acoperirea selectiva a acestora duce la cresterea capacitatii liniare de adsorbtie. Īn cele mai multe cazuri pentru dezactivare se foloseste apa, deoarece s-a constatat ca cele mai bune rezultate se obtin cānd apa acopera īn monostrat 50-100% din suprafata solidului, ceea ce īnseamna 0,04 g apa la 100 m² suprafata (sau 4-15% apa fata de cantitatea de adsorbent). Ca dezactivator se mai pot folosi alti compusi puternic polari ca etilenglicolul sau glicerina.

Pentru obtinerea unui adsorbent de o anumita activitate reproductibila trebuie sa fie parcurse urmatoarele etape:

alegerea tipului de adsorbent;

īndepartarea apei prin īncalzire timp de 8-16 ore la aer (125-250ŗC pentru silicagel, 200-400ŗC pentru alumina);

adaugarea unei anumite cantitati de apa dupa racire, cu care se lasa timp de 8-16 ore pentru echilibrare.

Adsorbentii utilizati īn cromatografia LSC se pot prezenta sub doua forme:

granule poroase neregulate, numite faze stationare poroase. Ele au suprafete specifice cuprinse īntre 100-400 m²/g si au o capacitate de īncarcare cu proba de 0,5-1 mg/g.

sfere solide compacte acoperite cu un strat de adsorbent poros, care se numesc faze stationare superficial poroase sau peliculare. Ele au suprafete specifice mult mai mici decāt adsorbentii porosi, cuprinse īntre 5-15 m²/g si pot fi īncarcate cu proba la un raport de 0,1 mg/g adsorbent, deci cantitatea de proba pe care o pot separa va fi mult mai mica. Eficienta de separare a adsorbentilor superficial porosi este īnsa mult mai mare.

Alumina se poate obtine īn functie de temperatura de preparare si activare īn mai multe forme. Daca activarea se face la temperatura mai mica de 700ŗC se obtine alumina γ, īn amestec cu alte forme. Daca activarea se face la o temperatura mai mare decāt 1000ŗC, se obtine alumina α inactiva. Sorturile de alumina cromatografica au īn general suprafete specifice cuprinse intre 100-200 m²/g. Diametrul particulelor sortimentelor comerciale de alumina este cuprins īntre 50-200 μm (70-290 mesh). Aceste dimensiuni permit o asezare uniforma a umpluturii īn coloana, atingerea unui debit rezonabil de faza mobila sub influenta doar a gravitatii si atingerea rapida a echilibrelor de distributie ale solutilor īntre adsorbent si faza mobila.

Alumina normala contine si diferite cantitati de apa, fie provenita din forma hidratata a aluminei, fie sub forma de apa adsorbita. Īn ce priveste structura poroasa, s-a observat ca ea contine un sistem de macropori de forma cilindrica avānd un diametru de 27 Å, la care se adauga pori neregulati cu diametre mai mari.

Activitatea de adsorbtie a aluminei depinde se sortimentul realizat. Exista trei forme de baza de alumina, bazica (pH 10), neutra (pH 7) si acida (pH 4) si este importanta folosirea tipului corect īntr-o anumita aplicatie din cauza unui posibil efect catalitic. Astfel, alumina bazica poate cataliza hidroliza unor esteri, iar cea acida dehidrogenarea unor alcooli, īn special a celor tertiari. Activitatea tuturor celor trei forme de alumina este clasificata īn cinci grade (scala Brockmann), pe baza continutului de apa. Gradul I, cel mai activ, se obtine prin activare la 300-400ŗC timp de mai multe ore, iar celelalte grade prin adaugare de diverse proportii de apa, dupa racire: 3-4% (gradul II), 5-7% (gradul III), 9-11% (gradul IV), respectiv 15-19% (gradul V). Faptul ca gradul I este cel mai activ īnseamna ca va retine cel mai puternic compusii polari.

Silicagelul reprezinta adsorbentul cel mai mult utilizat. Ca structura chimica, este un produs de policondensare al acidului ortosilicic. Silicagelul cromatografic se obtine la pH 7, adica īn forma neutra. si acest adsorbent se poate obtine īn diferite grade, īn conformitate cu continutul sau de apa. Gradul I se obtine prin īncalzire la 250ŗC timp de mai multe ore, iar celelalte prin adaugarea unor cantitati diferite de apa dupa racire: 5% (gradul II), 15% (gradul III), 25% (gradul IV) si 38% (gradul V). Īn cazul sortimentelor cu continut ridicat de apa se formeaza un film consistent de apa la suprafata adsorbentului, deci aceste separari pot fi considerate mai curānd pe baza de repartitie decāt de adsorbtie.

Pe suprafata silicagelului se gasesc o serie de grupari silanolice Si-OH. O parte dintre acestea se pot transforma īn grupari siloxanice prin eliminarea apei.

Suprafata specifica a silicagelului este cuprinsa īntre 200-800 m²/g. Se considera ca singurele centre de adsorbtie pe care le contine silicagelul sunt gruparile hidroxil de la suprafata. Īntre aceste grupari si moleculele componentelor adsorbite se stabilesc legaturi de hidrogen, moleculele adsorbite avānd rol de donori de electroni. Exista trei tipuri de grupari silanolice superficiale: vicinale dar nelegate prin legaturi de hidrogen, legate si izolate (Figura 4.5). De asemenea, mai pot exista la suprafata silicagelului grupari silanolice hidratate. Daca temperatura de uscare depaseste 400ŗC, se produce o sinterizare a particulelor, determinānd reducerea activitatii specifice si a capacitatii de adsorbtie.

Figura 4.5. Tipuri de grupari silanolice superficiale

Asadar mecanismul adsorbtiei este diferit īn cazul silicagelului fata de alumina, unde activitatea de adsorbtie nu se datoreste gruparilor hidroxilice superficiale ci unor interactiuni de natura electrostatica. Acest lucru s-a confirmat prin faptul ca īn urma īncalzirii la temperatura ridicata, cānd are loc pierderea gruparilor hidroxilice superficiale, activitatea silicagelului scade iar cea a aluminei creste.

Silicatul de magneziu si Florisilul. Silicatul de magneziu are o activitate de adsorbtie mai mare decāt alumina, fiind utilizata pentru separarea unor anumite clase de substante, cum ar fi lipidele. Florisilul este un silicat de magneziu si sodiu cu suprafata specifica de 300 m²/g, iar ca activitate de adsorbtie se situeaza īntre silicagel si alumina. Prezinta īnsa si fenomen de chemosorbtie, motiv pentru care utilizarea sa este mai limitata.

Carbunele a reprezentat cel mai popular adsorbent la īnceputurile cromatografiei, īnsa la ora aceasta nu prea mai este utilizat.

Dezvoltarea cromatografiei de īnalta performanta a determinat realizarea unor adsorbenti cu particule avānd diametre mai mici de 30μm. Au existat īn aceasta directie doua tendinte:

obtinerea unor adsorbenti porosi cu diametrul īn jur de 5 μm;

obtinerea unor adsorbenti superficial porosi cu diametrul īn jur de 30 μm si avānd un strat superficial poros cu grosimea de 1-2 μm.

La ora actuala adsorbentii porosi sunt utilizati cu precadere. Īn cromatografia lichid-solid clasica diametrul particulelor este de pāna la 100 μm, īn timp ce īn cromatografia īn strat subtire clasica, granulatia suportului este cuprinsa īntre 10-40 μm, utilizāndu-se ca suport īn general silicagel si alumina.

Cāteva exemple de adsorbenti pe baza de silicagel poros accesibili comercial, utilizati īn mod curent īn LSC sunt: Lichrospher (Merck), Porasil (Waters).

4.3.1.3. Faze mobile utilizate īn cromatografia lichid-solid

Īn cromatografia LSC se utilizeaza un mare numar de faze mobile lichide, cāt si amestecuri ale acestora de compozitie fixa sau compozitie variabila īn timp. Īn cromatografia de lichide, faza mobila poarta numele de eluent, iar procesul de antrenare a solutului prin coloana de catre faza mobila se numeste elutie. Pentru o separare buna, īn special īn cazul componentelor cu polaritati mult diferite, trebuie utilizata o faza mobila a carei putere de elutie creste. Aceasta putere de elutie este influentata de trei factori:

interactiunile dintre moleculele eluentului si moleculele solutului;

interactiunile dintre moleculele fazei mobile adsorbite si moleculele de solut aflate īn faza mobila adsorbita;

interactiunile dintre moleculele de faza mobila adsorbite si adsorbent.

Rolul solventilor īn LSC este foarte important, deoarece ei sunt īn competitie cu moleculele solutului pentru centrii activi polari ai adsorbentului. Cu cāt interactiunile dintre faza mobila si faza stationara sunt mai puternice, cu atāt adsorbtia solutului va fi mai slaba si invers. Chiar de la īnceputurile cromatografiei de adsorbtie s-a constatat ca īn cazul adsorbentilor polari solventii nepolari (de exemplu hidrocarburile alifatice saturate sau halogenate) sunt eluenti slabi īn comparatie cu solventii polari (alcooli, acizi).

Puritatea solventilor este un aspect foarte important īn LSC, deoarece prezenta apei sau a altor compusi polari poate afecta mult performantele coloanei, iar eventuala prezenta a unor compusi care absorb īn UV este nedorita atunci cānd se folosesc detectoare īn UV.

Marimea caracteristica pe baza careia se poate stabili faza mobila care trebuie utilizata pentru o anumita separare īn conditiile unui adsorbent dat este taria eluentului, care se defineste ca fiind energia de adsorbtie a moleculelor eluentului pe unitatea de suprafata a adsorbentului. Tariile relative, notate cu ε⁰, au fost determinate pentru o serie de solventi pe diferiti adsorbenti, considerānd ca referinta pentanul. Īn cazul unor amestecuri de eluenti, tariile acestora se pot calcula īn functie de fractiile molare si tariile solventilor ce constituie amestecul.

Clasificarea solventilor īn functie de taria legaturii lor cu adsorbentul se face īn serii eluotrope, care pot fi utilizate pentru gasirea unui eluent cu o tarie potrivita pentru realizarea unei anumite separari. Este īnsa indicat sa se faca si o testare a eluentului ales si acest lucru se poate face mai rapid prin cromatografie in strat subtire decāt prin cromatografie pe coloana. Seria eluotropa reprezinta o serie de solventi cu putere de elutie crescatoare. Īn cazul adsorbentilor nepolari, taria eluentului se datoreste existentei unor interactiuni nespecifice de tip Van der Waals si creste aproximativ cu masa moleculara a eluentului. Astfel, pentru carbune activ, seria eluotropa īn ordinea cresterii puterii de elutie este: apa, metanol, etanol, acetona, propanol, eter etilic, butanol, acetat de etil, hexan. Īn cazul adsorbentilor polari, taria eluentului creste odata cu polaritatea solventului, deci aproximativ invers decāt la adsorbentii nepolari. Astfel, īn cazul aluminei, seria eluotropa este data īn Tabelul 4.1.

Tabelul 4.1. Seria eluotropa a tariilor relative de solventi pe alumina

Exista serii eluotrope formate din amestecuri de mai multi solventi de polaritati diferite, care pot fi folosite pentru a realiza serii de eluenti de o anumita tarie. Asemenea serii au fost propuse de Snyder si un exemplu, pe silicagel, este dat īn Tabelul 4.2.

Tabelul 4.2. Serii eluotrope din amestecuri de solventi, pe silicagel

Se poate observa ca amestecurile de 21% clorura de izopropil/pentan, 14% clorura de metile/pentan si 26% benzen/pentan au aceeasi putere de elutie pe silicagel (egala cu 0,15), de aceea se numesc echieluotropice. Putem avea cazuri de separari cānd, desi factorii de capacitate au valori potrivite, separarea componentelor, reflectata de valorile coeficientului de separare α, este necorespunzatoare. Īn asemenea situatii pentru cresterea coeficientului de separare este suficienta de multe ori doar modificarea eluentului prin īnlocuirea componentei mai polare, fara a modifica taria eluentului. Acest lucru se poate face folosind un eluent echieluotrop cu primul.

Pot exista si anumite anomalii īn comportarea unor solventi, acestea datorāndu-se unor efecte secundare care nu au legatura cu procesul de adsorbtie, de exemplu formarea unor legaturi de hidrogen īntre moleculele solutului si eluentului.

Īn mod uzual, īn cromatografia lichid-solid se foloseste un adsorbent polar si elutia se realizeaza la īnceput cu un eluent nepolar, apoi cu tarie crescatoare a fazei mobile, fie prin tehnica elutiei īn trepte fie prin cea cu gradient. Nu se recomanda utilizarea unui amestec de solventi īn care o componenta foarte polara sa fie prezenta īn cantitate prea mica, deorece acesta se va adsorbi preferential si separarea va fi necorespunzatoare. Se poate lucra si cu faze inverse, cānd se folosesc adsorbenti nepolari cum sunt carbunele activ sau silicagelul cu suprafata silanizata. Īn aceste situatii, eluentul este constituit dintr-un amestec de apa si un solvent organic miscibil cu apa, iar cresterea tariei eluentului se realizeaza prin cresterea proportiei de solvent organic īn acest amestec.

4.3.1.4. Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloana

Cromatografia de adsorbtie este potrivita mai ales pentru separarea compusilor cu mase moleculare medii, polari si nepolari dar fara sarcini electrice.

Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile:

cromatografie lichid-solid clasica, pe coloana;

cromatografie īn strat subtire;

cromatografie lichid-solid de īnalta performanta.

Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloana se utilizeaza practic numai īn scopuri preparative, īn timp ce cea de īnalta performanta se utilizeaza mai ales īn scop analitic, dar si preparativ.

Pentru a testa posibilitatea separarii unui amestec de compusi prin cromatografie lichid-solid este indicata cromatografia īn strat subtire. Īn acest scop se foloseste adsorbentul care se preconizeaza a se utiliza īn separarea LSC (alumina sau silicagel īn majoritatea cazurilor) si prin TLC se poate stabili eluentul sau sistemul de eluenti cel mai potrivit. Pentru realizarea unei separari corespunzatoare sunt importante natura adsorbentului, dimensiunile sale, dimensiunile coloanei si viteza de elutie.

Coloanele utilizate īn LSC sunt confectionate īn general din sticla, avānd lungimea cuprinsa īntre 10-90 cm si diametrul interior īntre 1-5 cm. Raportul dintre lungimea si diametrul coloanei trebuie sa fie in intervalul 10-20. Aceste coloane pot fi prevazute cu slifuri la ambele capete, pentru a permite atasarea unei pālnii de separare pe post de rezervor de solvent īn partea superioara, respectiv a unui vas de tip Büchner īn partea inferioara pentru colectarea fractiunilor eluate (Figura 4.6).

Figura 4.6. Coloana utilizata pentru cromatografia lichid-solid

Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale:

umplerea si pregatirea coloanei;

īncarcarea probei;

elutia componentelor probei.

Umplerea coloanei se poate face prin doua tehnici: uscata si umeda. Tehnica umplerii uscate se utilizeaza mai putin, deoarece necesita cantitati mai mari de adsorbent. Pentru a realiza separari cu o coloana umpluta prin tehnica umeda, este necesara o cantitate de adsorbent de 20-50 de ori mai mare fata de cantitatea de proba care va fi supusa separarii. Daca componentele separate au polaritate apropiata, acest raport trebuie marit la 100-200. Diametrul particulelor de adsorbent utilizate īn separarile LSC este cuprins īntre 0,05-0,5 mm. Particule mai mici duc la o viteza de curgere mult prea redusa prin coloana, īn timp ce particule mai mari determina o separare necorespunzatoare. Viteza optima de elutie depinde de multi factori, cum este natura si diametrul particulelor de adsorbent, lungimea coloanei si natura compusilor care trebuie separati. Pentru a realiza umplerea prin tehnica umeda, se realizeaza o suspensie de o parte adsorbent la cinci parti faza mobila si aceasta suspensie este introdusa īn coloana. Coloana trebuie sa fie uscata si sa aiba īn partea inferioara un opritor din sticla sinterizata, vata de sticla sau nisip, cāt si un robinet pentru se a putea regla debitul de elutie. Īn timpul umplerii coloana trebuie sa se gaseasca īn pozitie verticala, iar introducerea suspensiei este dirijata cu ajutorul unei baghete de sticla pentru ca asezarea ei īn coloana sa fie uniforma. Dupa introducerea primei portiuni de suspensie, se deschide robinetul pentru evacuarea solventului cu viteza mica si numai dupa aceea se adauga urmatoare portiune. Aceasta adaugare trebuie efectuata īnainte ca portiunea precedenta sa se fi asezat complet, altfel umplutura se va aseza īn straturi. De asemenea, nu este permis ca nivelul lichidului sa scada sub nivelul stratului de adorbent, acesta trebuind sa se gaseasca permanent īn lichid. Dupa umplere, coloana nu are voie sa prezinte goluri, canale, crapaturi sau alte neuniformitati. Dupa terminarea umplerii, peste partea superioara a stratului de adsorbent se pune īn general un disc de hātrie de filtru cu diametrul egal cu diametrul interior al coloanei sau un strat de nisip de 0,5 cm grosime, pentru a preveni dislocarea sa īn momentul introducerii probei. Apoi se scurge solventul din coloana pāna cānd nivelul lichidului ajunge chiar deasupra nivelului umpluturii. Īn acest moment coloana este pregatita pentru utilizare.

Introducerea probei (Figura 4.7) se face prin aplicarea ei īn partea superioara a coloanei, cel mai bine cu ajutorul unei pipete Pasteur. Proba trebuie sa se gaseasca īntr-un volum minim de solvent, de preferinta acelasi cu cel folosit pentru eluare. Pentru o coloana de 40 cm lungime si 2 cm diametru volumul ideal de solutie de proba este de 1-2 ml. Dupa aplicarea probei se deschide robinetul de la partea inferioara a coloanei si proba este lasata sa intre complet īn adsorbent. Apoi cu un volum cāt mai mic de solvent se spala peretii coloanei si aceasta portiune de solvent este de asemenea lasata sa intre īn adsorbent. Intrarea completa a probei īn stratul de adsorbent īnainte de īnceperea elutiei este necesara pentru a preveni diluarea probei. Apoi coloana se umple complet cu eluent si īn partea sa superioara se ataseaza rezervorul de eluent. Dupa īnceperea eluarii, fluxul de solvent prin coloana nu mai este permis sa fie oprit, deoarece ar duce la dispersia excesiva a componentelor.

Figura 4.7. Introducerea probei īn coloana LSC: (a) nivelul solventului se gaseste chiar deasupra nivelului umpluturii; (b) aplicarea probei; (c) intrarea probei īn adsorbent; (d) spalarea peretilor coloanei cu solvent; (e) intrarea acestei solutii īn adsorbent; (f) umplerea coloanei cu eluent.

Uneori proba nu este complet solubila īn solventul sau amestecul de solventi folosit pentru eluare, dar se dizolva īntr-un solvent mai polar. Nu este permisa introducerea unei probe incomplet dizolvate, dar nici dizolvate īntr-un alt solvent mai polar, deoarece ar duce la separari necorespunzatoare. Īn aceste situatii se recomanda dizolvarea probei īn solventul mai polar, adaugarea la aceasta solutie a unei cantitati de adsorbent de 2-10 ori mai mare decāt greutatea probei si evaporarea solventului (la un evaporator rotativ) astfel ca proba sa ramāna adsorbita. Acest material se introduce apoi īn partea superioara a coloanei si va fi desorbita īn timpul trecerii eluentului.

Elutia componentelor se poate realiza īn trei moduri:

Elutie izocratica, cu un singur eluent sau cu un amestec de eluenti de compozitie constanta;

Elutie īn trepte, utilizānd o serie eluotropa de solventi cu putere de elutie crescatoare sau o serie eluotropa de amestecuri de doi solventi, avānd īn general valori ε⁰ apropiate, pentru separari mai fine.

Elutie cu gradient, utilizānd un amestec de doi solventi a carui compozitie este modificata continuu īn timpul elutiei.

Īn cazul īn care adsorbentul este polar, alumina sau silicagel, componentele nepolare vor avea o interctiune mai slaba cu adsorbentul si vor elua primele. Elutia izocratica este recomandata mai ales atunci cānd se urmareste separarea unei componente nepolare dintr-un amestec cu altele mai polare. Īn acest caz se foloseste un eluent cu polaritate apropiata de cea a componentei urmarite, care va elua doar compusul respectiv, ceilalti compusi, mai polari, ramānānd adsorbiti īn partea superioara a coloanei.

Daca dupa eluarea componentei sau componentelor mai putin polare vrem sa eluam si componentele mai polare, avem nevoie de un eluent cu tarie mai mare. O asemenea elutie se poate face īn trepte, folosind o serie eluotropa de polaritate crescatoare. Nu se recomanda o variatie prea brusca a compozitiei fazei mobile, mai ales daca se face o trecere de la solventi aprotici la solventi protici. Astfel, daca se face trecerea de la pentan la toluen, aceasta se face secvential cu amestecuri de 10%, 50% si 70% toluen īn pentan, iar īn cazul trecerii de la acetona la metanol numarul treptelor trebuie sa fie mai mare, de exemplu 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 70 si īn final 100% metanol.

Eluarea cu gradient este utilizata atunci cānd se urmareste schimbarea compozitiei eluentului īntr-o maniera constanta si uniforma, nu abrupta decāt īn cazul elutiei īn trepte. Acest tip de elutie se poate realiza utilizānd doua rezervoare, unul continānd solventul mai polar iar celalalt pe cel nepolar (Figura 4.8). Solventul mai polar trece, cu debitul F₁, īntr-o camera de amestecare īn care se gaseste solventul mai putin polar. Din aceasta camera, are loc trecerea amestecului de solventi īn coloana, cu debitul F₂. Se pot genera diferiti gradienti prin variatia celor doua debite. Prin utilizare elutiei cu gradient, se pot separa īntr-o singura analiza compusi cu polaritati mult diferite.

Regula cea mai importanta īn cromatografia de adsorbtie lichid-solid este ca polaritatea (taria) fazei mobile este fie mentinuta constanta īn timpul analizei (īn cazul elutiei izocratice) fie este crescatoare, dar niciodata ea nu este descrescatoare.

Figura 4.8. Realizarea gradientului de faza mobila

Detectarea componentelor separate īn coloana se poate face prin diferite metode. Pentru aceasta, se colecteaza īn general fractiuni de volume egale, manual sau utilizānd un colector de fractiuni. Aceste fractiuni se analizeaza prin cromatografie īn strat subtire, cromatografie de gaze sau spectrofotometrie īn UV, apoi fractiunile cu compozitie identica se reunesc si se supun evaporarii pentru indepartarea solventului. Aceasta evaporare se face īn general la un evaporator rotativ de vid. Exista si posibilitatea utilizarii unor detectoare UV-VIS automate care se conecteaza la iesirea din coloana si permit monitorizarea componentelor eluate, cu conditia ca acestea sa absoarba īn domeniul UV sau vizibil, iar eluentul utilizat sa nu aiba absorbtie (Figura 4.9).

Figura 4.9. Detectarea si colectarea fractiunilor eluate

4.3.2. Cromatografia de repartitie lichid-lichid

Cromatografia lichid-lichid (LLC) are acelasi principiu ca si extractia, adica se bazeaza pe distributia moleculelor solutului īntre doua faze lichide nemiscibile, īn conformitate cu solubilitatea acestora īn cele doua faze. Mediul care realizeaza separarea consta dintr-un suport inert (silicagel, kieselguhr) pe care este depus un strat de faza stationara lichida, iar separarea se realizeaza prin trecerea unui flux de faza mobila ce contine proba analizata peste faza stationara. Faza stationara se poate gasi īmpachetata īntr-o coloana sau dispusa īn strat subtire pe o placa de sticla sau folie de aluminiu.

4.3.2.1. Faze stationare. Faze stationare legate chimic

Cromatografia lichid-lichid se clasifica īn functie de polaritatea relativa a fazei stationare si fazei mobile īn doua categorii:

Cromatografie lichid-lichid pe faze normale, īn care faza stationara este polara iar faza mobila nepolara;

Cromatografie lichid-lichid pe faze inverse, īn care faza stationara este nepolara iar faza mobila polara.

Īn cazul cromatografiei pe faze normale, ordinea de elutie este bazata pe principiul ca componentii nepolari vor avea o preferinta pentru faza mobila si vor elua mai repede, īn timp ce componentii mai polari vor avea o afinitate mai mare fata de faza stationara si vor elua mai tārziu. Īn cazul cromatografiei pe faze inverse, ordinea de elutie va fi inversata, īn sensul ca primii vor elua componentii mai polari. Utilizarea pe scara foarte larga a cromatografiei pe faze inverse (RPC) la ora actuala se bazeaza pe faptul ca majoritatea compusilor organici au īn structura lor regiuni hidrofobe si īn consecinta vor putea interactiona cu fazele stationare nepolare. Īntrucāt faza mobila īn cazul RPC contine īn mod uzual apa, aceasta metoda este foarte buna pentru si pentru separarea substantelor polare care sunt fie insolubile īn solventi organici, fie se leaga prea puternic de adsorbentii polari pentru a putea fi separate prin cromatografie lichid-solid. Un alt avantaj important al cromatografie pe faze inverse este ca solventii utilizati nu trebuie anhidrificati.

Cāteva faze stationare tipice si faze mobile utilizate īn cromatografia de lichide pe faze normale si faze inverse sunt prezentate īn tabelul 4.3.

Tabelul 4.3. Faze mobile si faze stationare īn cromatografia lichid-lichid

Desi faza stationara si cea mobila sunt astfel alese īncāt miscibilitatea lor sa fie minima, chiar si o solubilitate foarte mica a fazei stationare īn faza mobila duce la antrenarea ei īn timpul curgerii fazei mobile prin coloana. Din acest motiv, faza mobila trebuie sa fie saturata cu faza stationara respectiva īnainte de a intra īn coloana. Acest lucru se realizeaza īn general prin utilizarea unei precoloane (coloane de protectie) situate īnaintea coloanei cromatografice. Aceasta trebuie sa contina o umplutura cu granulatie mare (silicagel de 30-60 mesh, de exemplu) pe care sa fie depusa o concentratie ridicata (30-40%) din aceeasi faza stationara care se gaseste si īn coloana de analiza.

Suportul fazei stationare este constituit dintr-un material relativ inert, ca de exemplu: alumina, polimeri sintetici (polimetacrilat, copolimer stiren-divinilbenzen), sticla si mai ales silicagel, care are avantajul ca poate fi usor modificat chimic. Este important ca suportul sa nu interactioneze cu solutul, astfel ca mecanismul retentiei sa nu fie unul mixt, de repartitie si adsorbtie ci numai de repartitie. Din acest motiv, atunci cānd se folosesc adsorbenti porosi drept suport este necesar sa se realizeze o īncarcare avansata a suportului cu faza stationara, pentru a acoperi toti centrii activi. Suporturile pot sa fie de doua tipuri: poroase sau superficial poroase. Cele poroase pot fi īncarcate cu o cantitate mai mare de faza stationara (īntre 10-30%), dar eficienta lor de separare este mai scazuta. Suporturile superficial poroase se pot īncarca numai cu 0,5-1,5% faza stationara, īnsa au o eficienta de separare mai mare. Eficienta de separare depinde foarte mult de dimensiunile particulelor de suport, fiind cu atāt mai mare cu cāt aceste dimensiuni sunt mai mici. La ora actuala īn cromatografia de lichide de īnalta performanta se utilizeaza suporturi de silicagel total poros cu dimensiuni uniforme, īntre 3 si 10 μm, de forma neregulata sau sferica. Cele mai eficiente sunt cele sferice (Figura 4.10)

Figura 4.10. Imaginea la microscopul electronic a unui suport cromatografic de silicagel poros

Pentru a elimina problemele legate de pierderea fazei stationare de pe suport īn timpul elutiei, se utilizeaza legarea chimica a fazei stationare de materialul suportului. Acest tip de cromatografie de lichide se numeste cromatografie cu faze chimic legate (BPC). Reactiile cele mai mult utilizate pentru obtinerea acestui tip de faze stationare sunt cele de sililare. Ele constau īn reactia gruparilor silanolice de la suprafata silicagelului cu clorsilani substituiti. Un exemplu īn acest sens este reactia cu un alchil-dimetilclorsilan, īn urma careia ia nastere o faza chimic legata monomerica, īntrucāt fiecare molecula de agent de sililare poate reactiona doar cu o singura grupa silanolica.

Daca se utilizeaza di- sau triclorsilani īn prezenta de umiditate se va forma un strat polimeric pe suprafata silicagelului, adica o faza chimic legata polimerica.

Gruparile silanolice Si-OH vor fi capabile sa adsoarba compusii polari si deci vor afecta proprietatile fazei chimic legate, īn general īn mod nedorit. Aceste deficiente pot fi eliminate prin inactivarea gruparilor silanolice reziduale prin reactie cu trimetilclorsilan sau hexametildisilazan.

Modul de interactiune al fazei stationare chimic legate cu solutii va depinde de natura gruparii functionale R, cele mai utilizate faze fiind cele nepolare, la care gruparea R este octadecil C-18. Acestea vor fi asadar faze stationare inverse. Alte grupari R de tip nepolar care se folosesc īn cazul suporturilor chimic legate sunt cele de tip octil sau ciclohexil. Se utilizeaza si faze stationare chimic legate care au grupari polarizabile, de tip fenil, sau polare, de tip aminopropil, cianopropil sau diol. Cele cu grupari polare vor fi faze stationare normale, utilizate pentru separarea compusilor polari.

O proprietate importanta a fazelor stationare siloxanice este stabilitatea lor ridicata īn conditiile de analiza. Ele sunt atacate doar īn conditii puternic acide (pH < 2) sau puternic bazice (pH > 9). Un mare numar de asemenea faze stationare destinate analizelor HPLC sunt comercializate sub diverse denumiri.

4.3.2.2. Faza mobila

Īn cromatografia de lichide, alegerea naturii si compozitiei fazei mobile are o importanta cruciala pentru a obtine o separare eficienta. Puritatea solventilor utilizati este esentiala. Ele nu pot contine alte materiale decāt īn urme. Īn cazul utilizarii de detectoare īn UV, solventii trebuie sa fie lipsiti chiar si de urme de substante care sa absoarba īn UV. De asemenea, prezenta unor particule solide in faza mobila poate determina distrugerea pompei sau injectorului sau īnfundarea coloanei. Din aceste motive, solventii cromatografici sunt scumpi si costul lor reprezinta cea mai mare parte a costului unei analize cromatografice. Au aparut sisteme cromatografice care realizeaza recircularea solventului īn cazul īn care acesta nu contine un solut detectabil, pentru a reduce costurile.

Proprietatea cea mai importanta a solventilor utilizati īn cromatografia de lichide este polaritatea. Puterea de elutie a unei faze mobile depinde de polaritatea sa totala, polaritatea fazei stationare si natura componentilor analizati. Īn cazul separarilor pe faze normale, puterea de elutie creste odata cu cresterea polaritatii solventului, iar īn cazul separarilor pe faze inverse ea scade cu cresterea polaritatii solventului. Popularitatea cromatografiei pe faze inverse este determinata īn mare parte de avantajele utilizarii unor faze mobile polare ca apa si metanolul: ele sunt mai ieftine, īn general mai pure si mai putin toxice decāt solventii nepolari.

Desi nu exista o metoda care sa permita determinarea exacta a valorii polaritatii, cea mai raspāndita este utilizarea indicelui de polaritate P care reprezinta coeficientul de repartitie al substantei respective īntre octanol si apa si a fost introdus de Snyder. Acesti indici au fost determinati pe baza unor date gaz-cromatografice si ele sunt accesibile pentru un numar de 81 de solventi. Pe baza indicelui de polaritate solventii se clasifica īn 8 categorii. Se considera ca utilizarea indicelui de polaritate este mai adecvata decāt varianta mai veche care clasifica solventii īn serii eluotrope pe baza tariei relative de elutie a solventului ε⁰. Indicele de polaritate ia valori īntre -2 si 10,2 si practic orice valoare īn cadrul acestui interval poate fi obtinuta prin amestecarea a doi sau mai multi solventi. Valorile indicelui de polaritate si tariei de elutie pentru cātiva solventi uzuali sunt date īn Tabelul 4.4.

Tabelul 4.4. Proprietatile unor solventi utilizati īn cromatografia de lichide.

Exista si o serie de alte proprietati ale solventilor īn afara de polaritate care au importanta īn cromatografia de lichide: temperatura de fierbere, vāscozitatea, inflamabilitatea, toxicitatea.

Solventul trebuie īntotdeauna filtrat īnainte de a fi introdus īn rezervorul de solvent al cromatografului. Este foarte importanta de asemenea eliminarea aerului dizolvat sau sub forma de bule din solvent, ceea ce se face prin degazare īn vid, prin barbotare de heliu, prin īncalzire sau ultrasonare, primele doua metode fiind cele uzuale.

Elutia īn cromatografia de lichide de īnalta performanta se poate face īn doua variante:

elutie izocratica

elutie cu gradient

Elutia cu gradient se utilizeaza mai ales īn cromatografia de lichide cu faze chimic legate si īn special īn cea cu faze inverse. Cele mai mult folosite sisteme binare pentru elutia cu gradient sunt metanol-apa si acetonitril-apa. Dintre acestea, sistemul metanol-apa se foloseste pentru eluarea compusilor mai polari. Daca polaritatea compusilor analizati este foarte asemanatoare, de multe ori este nevoie de folosirea unui sitem ternar de elutie pentru a ajusta mai fin polaritatea fazei mobile. Cel de-al treilea solvent folosit este de multe ori tetrahidrofuranul.

Optimizarea compozitiei fazei mobile

Modificarea compozitiei fazei mobile reprezinta cea mai simpla metoda pentru a influenta rezolutia componentilor īn cromatografia de lichide. Pentru separari relativ simple, este posibil ca analiza sa fie efectuata cu un singur amestec de solventi, adica īn sistem izocratic. Totusi, gasirea amestecului optim nu este usoara tinānd cont de faptul ca īn general este vorba despre un amestec de doi (binar) pāna la patru (cuaternar) solventi. Exista o serie de metode pentru determinarea acestui punct optim bazate pe secvente de analize care permit ajustarea compozitiei pāna la atingerea celei optime, pe baza unor algoritmuri de tip simplex. Dezavantajul unei asemenea metode este ca necesita un numar mare de determinari cromatografice. Cea mai buna metoda de determinare a compozitiei optime consta īn folosirea unui triunghi (īn cazul sistemelor ternare) respectiv a unui tetraedru (īn cazul sistemelor cuaternare), compozitia optima fiind data de un punct īn interiorul acesti triunghi sau tetraedru (Figura 4.11).

Figura 4.11. Optimizarea compozitiei fazei mobile

Aceste optimizari īncep realizarea unor analize cu gradient de elutie de la 0 la 100% pentru perechile de solventi, care duc la stabilirea unei drepte (pentru sistemele ternare) respectiv a unui plan (pentru sistemele cuaternare) īn interiorul caruia se determina apoi compozitia optima.

Se pot folosi si metode care sa necesite un numar mai mic de experimente, pe baza unor programe de calculator care sunt accesibile comercial. Asemenea optimizari se practica mai ales īn cazul cromatografiei cu faza inversa si ele permit īnlocuirea elutiei cu gradient de solvent cu elutia izocratica. Avantajul elutiei izocratice sunt ca este mai rapida, ceea ce este avantajos mai ales īn cazul analizelor īn serie si ca nu necesita reechilibrarea (revenirea la compozitia initiala) dupa fiecare analiza, ceea ce duce la reducerea timpului de analiza.

4.3.2.3. Aparatura utilizata īn cromatografia lichid-lichid

Asa cum s-a aratat, cromatografia de lichide de īnalta performanta s-a dezvoltat dupa ce teoria separarilor cromatografice a demonstrat ca pentru obtinerea unei eficiente de separare ridicate, comparabila cu cea realizata īn cromatografia de gaze, este nevoie de utilizarea unor umpluturi cu granulatie fina, de ordinul a 5-10 μm. Pentru a avea īnsa viteze de elutie corespunzatoare, īn aceste situatii se impune folosirea unor presiuni ridicate la intrarea eluentului īn coloana. Pe de alta parte, folosirea unor coloane scurte a dus la scaderea importanta a capacitatii de īncarcare cu proba, ceea ce a necesitat construirea unor detectoare de mare sensibilitate.

Schema de principiu a unui cromatograf de lichide de īnalta performanta este data īn Figura 4.12:

Figura 4.12. Schema unui cromatograf de lichide de īnalta performanta (HPLC)

Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt:

- sistemul de alimentare cu faza mobila

- dispozitivul pentru introducerea probei

- una sau doua pompe

- coloana

- detectorul

- sistemul de prelucrare a datelor

4.3.2.3.1. Sistemul de alimentare cu faza mobila

Cuprinde urmatoarele dispozitive, care pot fi asamblate īn diferite configuratii:

rezervoarele de solventi (Figura 4.13);

dispozitivul pentru degazarea solventilor;

dispozitivul pentru realizarea gradientului de solventi.

Dispozitivul pentru degazare este necesar pentru īndepartarea din solventi a gazelor dizolvate, mai ales a oxigenului, care īn timpul trecerii prin coloana ar putea reactiona cu faza stationara, sau ar putea forma bule de gaz cu influenta nefavorabila atāt asupra separarii cāt mai ales a detectiei, tinānd cont de volumul foarte mic al celulelor detectoarelor moderne. Degazarea se realizeaza īn doua moduri:

prin barbotare de heliu īn rezervorul de solvent;

prin trecerea solventului printr-o unitate de degazare cu vid, unitate prevazuta cu o tubulatura de teflon care permite difuzarea prin pereti a gazelor prezente īn solvent, dar nu si a moleculelor solventului (Figura 4.14).

Figura 4.13. Rezervor de solvent utilizat īn cromatografia HPLC

Figura 4.14. Dispozitiv de degazare a solventilor cu vid

Dispozitivul pentru alimentarea cu solventi poate fi foarte diferit ca si complexitate, de la un simplu rezervor de solventi īn cazul elutiei izocratice pāna la un programator de eluent pentru doi sau trei solventi.

Prin elutia cu gradient de solvent se poate realiza separarea componentelor care nu se separa prin elutie izocratica. Este foarte eficienta mai ales daca polaritatea componentelor analizate difera foarte mult.

Exista doua tipuri de sisteme de elutie cu gradient de solvent:

Sistemul cu gradient de joasa presiune, īn care solventii se preiau din rezervoare diferite īntr-o camera de amestecare, apoi amestecul de solventi este pompat prin coloana (Figura 4.15). Cromatografele moderne poseda electrovalve de proportionare pentru solventi, comandate de un microprocesor. Īn acest mod creste rezolutia, se reduce timpul de analiza si creste si sensibilitatea analizei.

Figura 4.15. Formarea gradientului de solventi cu ajutorul sistemului cu

valva de proportionare

Multe cromatografe de lichide moderne poseda sisteme pentru vehicularea solventilor care pot amesteca doi sau mai multi solventi, progresiv, īntr-un raport cuprins īntre 0 si 100% pentru oricare solvent. Se obtine o diagrama de compozitie īn functie de timp care poate avea forma liniara, convexa sau concava. Programerea compozitiei eluentului īndeplineste acelasi rol in cromatografia de lichide ca programarea de temperatura īn cromatografia de gaze, permitānd separarea picurilor neseparate corespunzator, fara a afecta rezolutia celorlalte picuri. Gasirea programului optim necesita timp si elutia cu gradient poate avea si anumite inconveniente. De exemplu, este nevoie de un timp la sfārsitul fiecarei analize pentru a reveni la compozitia initiala a eluentului, iar daca unul din solventi are un semnal mai puternic īn detector decāt ceilalti, se va īnregistra o deriva a liniei de baza (drift). Din acest motiv, pentru separarea unor amestecuri mai simple, se prefera elutia izocratica desi timpul de analiza este mai mare, īnsa nu se mai consuma timp pentru gasirea programului ideal pentru elutia cu gradient.

Avantajul acestui sistem de gradient este ca se foloseste o singura pompa, desi pāna la urma sistemul de programare cu ventile de proportionare este aproape tot asa de complicat si de scump ca si utilizarea unei a doua pompe.

Sistemul cu gradient de īnalta presiune, care opereaza cu cāte o pompa pentru fiecare solvent. Īn general, aceste pompe sunt deservite de motoare pas cu pas, iar debitul pompei este controlat de frecventa de alimentare a motorului respectiv. Acest sistem este mai scump decāt celalat, īnsa reproductibilitatea rezultatelor este mai buna.

4.3.2.3.2. Dispozitive pentru introducerea probei

Introducerea probelor poate fi realizata īn doua moduri: prin injectie cu ajutorul unei seringi sau prin folosirea unei valve (robinet) de injectie cu mai multe canale (Figura 4.16). Injectia cu seringi se aplica mult mai putin decāt īn cromatografia de gaze pentru ca ea necesita seringi rezistente la presiune ridicata si un septum construit dintr-un material care sa nu permita extragerea unor compusi de catre faza mobila, care sa dea nastere unor picuri-fantoma.

Valvele de injectie permit introducerea reproductibila a probelor īn coloanele cromatografice aflate sub presiune, fara īntreruperea curgerii fazei mobile. Proba este incarcata la presiune atmosferica īntr-o bucla exterioara a valvei de injectie si este apoi introdusa īn faza mobila printr-o simpla rotire a valvei. Volumul de proba introdusa variaza īntre 2μl si mai mult de 100 μl si poate fi modificat prin schimbarea buclei de injectie sau folosind valve speciale cu volum variabil de proba. Pentru analize īn serie se recomanda folosirea unor dispozitive de introducere automata a probelor.

Figura 4.16. Dispozitiv pentru introducerea probei cu bucla de proba cu volum determinat

4.3.2.3.3. Coloana cromatografica

Īn mod obisnuit, coloanele cromatografice utilizate īn analizele HPLC sunt confectionate din otel inoxidabil, au lungimea cuprinsa īntre 10-30 cm si diametrul interior de 4 sau 5 mm. Pentru retinerea fazei stationare īn coloana, la capetele acesteia se gasesc doua frite din otel inoxidabil cu ochiuri de 2 μm sau mai putin.

Umpluturile folosite in cromatografia de lichide moderna au dimensiuni mici, sunt rigide si uniforme. Ele pot fi clasificate īn urmatoarele categorii:

Particule polimerice pe baza de copolimer stiren-divinilbenzen. Acestea se folosesc pentru cromatografia de schimb ionic si cromatografia de excluziune sterica, īnsa au fost īnlocuite pentru o serie de aplicatii de umpluturi pe baza de silicagel care sunt mai eficiente si mai stabile mecanic.

Particule superficial poroase (peliculare), cu diametrul cuprins īntre 30-55 μm, care constau dintr-un īnvelis subtire (1-3 μm) de silicagel, dispus pe un nucleu dintr-un material inert, de exemplu granule sferice de sticla. Asemenea umpluturi peliculare se mai folosesc īn anumite aplicatii de cromatografie de schimb ionic, īnsa utilizarea lor a īnregistrat un puternic regres odata cu dezvoltarea umputurilor total poroase.

Particule total poroase de silicagel, cu diametre mai mici decāt 10 μm care sunt cele mai folosite la ora actuala pentru coloanele analitice HPLC. Comparativ cu umpluturile peliculare, ele ofera o serie de avantaje īn ce priveste eficienta coloanei, capacitatea de īncarcare cu proba si viteza analizei.

Dezvoltarea fazelor stationare chimic legate a avut de asemenea o mare importanta pentru pentru cromatografia lichid-lichid pe coloane de silicagel.

Procedura aleasa pentru umplerea coloanei depinde īn mare masura de caracteristicile mecanice ale umpluturii. Īn cazul umpluturilor cu particule de diametre mai mari de 20 μm se poate folosi tehnica de umplere uscata, īn timp ce īn cazul celor cu diametre mai mici de 20 μm se face umplere umeda, adica particulele se suspenda īntr-un solvent si suspensia rezultata se introduce īn coloana, sub presiune. Īn general se prefera achizitionarea unor coloane gata umplute de la firmele de specialitate, avānd caracteristici definite īn cataloagele acestor firme. Lungimea coloanelor este standardizata, fiind de 300, 250, 150, 100 si 75 mm. Coloanele mai lungi vor avea un numar mai mare de talere teoretice, ele fiind considerate standard. Coloanele mai scurte au avantajul unei viteze de separare mai mari si a unui timp de analiza mai redus.

Diametrul standard al umpluturilor folosite īn HPLC este de 5 μm. Umpluturile mai fine sunt mai eficiente (reducerea la jumatate a diametrului particulelor determina dublarea eficientei de separare), īnsa mai scumpe.

Se fabrica o gama larga de coloane analitice, avānd diametrele interioare cuprinse īn intervalul de la 4,6 mm la mai putin de 0,2 mm. Coloanele preparative au diametrul mai mare de 50 mm. Īn principiu, cu cāt diametrul coloanei este mai mare, īncarcarea cu proba va fi mai mare, deci se va putea injecta o cantitate mai mare de proba. Pe de alta parte, exista o serie de elemente care fac coloanele mai īnguste mai atractive pentru separarile analitice. Astfel, coloanele mai īnguste vor necesita un consum mai mic de solvent, determinānd economii importante. Un alt avantaj important este ca picul solutului va elua īntr-un volum mai mic si īntrucāt raspunsul majoritatii detectoarelor depinde de concentratie rezulta ca īnaltimea picului va fi mai mare iar limita de detectie va fi redusa. Aceste avantaje au dus la dezvoltarea unor coloane capilare cu diametrul interior redus pāna la 0,1 mm, īnsa folosirea acestora creeaza o serie de alte probleme, cum ar fi cele generate de necesitatea de a lucra cu debite foarte mici de faza mobila sau de a reduce foarte mult volumele moarte, de exemplu cele care apar la conexiunea dintre diferitele componente ale aparatului.

Īn general, pentru coloanele īnguste cu diametre īntre 2 si 0,5 mm se foloseste termenul "microbore", īn timp ce coloanele cu diametre mai mici decāt 0,5 mm sunt denumite microcoloane. Microcolanele, la rāndul lor, se subīmpart īn coloane capilare umplute (diametre īntre 0,04-0,3 mm) si coloane capilare deschise, cu diametre īntre 3-50 μm. Acestea din urma sunt construite din sticla speciala si din punct de vedere constructiv sunt similare cu coloanele capilare folosite īn cromatografia de gaze. Desi folosirea lor necesita o aparatura speciala īn ce priveste constructia pompei si a detectorului, care sa opereze la debite de faza mobila foarte mici, de pāna la 1μl/min, ele permit realizarea unor separari cu o eficienta mai mare de 100.000 talere teoretice īntr-un timp de analiza mai mic de 30 de minute, cu un consum foarte scazut de faza mobila.

Pentru cresterea duratei de utilizare a unei coloane de analiza HPLC se recomanda introducerea unei coloane de protectie (precoloana, guard column). Aceasta este o coloana mica ce se amplaseaza īntre injector si coloana analitica si previne pierderea eficientei coloanei analitice datorita prezentei anumitor impuritati prezente īn proba sau solvent, de exemplu a celor care se adsorb foarte puternic. Un alt rol posibil al acestei coloane este de a satura solventul cu faza stationara si a preveni astfel antrenarea fazei stationare din coloana analitica. Coloanele de protectie sunt umplute cu faza stationara microporoasa sau peliculara. Cele peliculare sunt mai usoare de manipulat la umplere īnsa trebuie schimbate mai frecvent deoarece capacitatea lor de retinere este mai scazuta.

4.3.2.3.4. Pompe utilizate īn cromatografia de lichide

La ora actuala exista un mare numar de pompe care pot fi utilizate īn cromatografia de lichide, dintre care unele sunt destinate numai unor aplicatii specifice.

Aceste pompe sunt de doua tipuri:

pompe pneumatice, care sunt pompe cu presiune constanta;

pompe mecanice, care sunt pompe cu debit constant.

Pompele pneumatice sunt actionate sub influenta presiunii aerului. Avantajele lor sunt constructia simpla, costul redus si posibilitatea realizarii unor presiuni foarte mari. Pe ansamblu īnsa ele sunt inferioare pompelor mecanice, dezavantajul major fiind acela ca viteza de curgere se modifica la schimbarea vāscozitatii eluentului, ceea ce le face neoperabile īn cazul sistemelor de elutie cu gradient. Pompele pneumatice se folosesc la ora actuala pentru umplerea coloanelor cu faza stationara prin metoda umeda si, īn anumite cazuri, pentru realizarea debitelor mari necesare pentru cromatografia preparativa.

Pompele mecanice sunt utilizate īn majoritatea aplicatiilor. Ele sunt pompe cu piston, care elibereaza solventul īn mod constant, fara a necesita oprire pentru reīncarcare ca pompele pneumatice. Debitul lor ramāne constant chiar īn conditiile modificarii unor caracteristici ale eluentului ca vāscozitatea sau temperatura si de aceea pot fi folosite īn combinatie cu detectoarele de mare sensibilitate, īntrucāt nu duc la modificari ale zgomotului de fond al acestora. Dezavantajul lor principal este ca orice defectiune care afecteaza curgerea eluentului duce la cresterea brusca a presiunii īn sistem. Pentru evitarea accidentelor, aceste pompe sunt prevazute cu limitatoare de presiune, care opresc pompa daca se atinge o presiune maxima stabilita.

Cel mai simplu, mai ieftin si drept urmare mai folosit tip de pompa este pompa cu un singur piston (cu miscare alternativa - "reciprocating"). Aceasta a fost prima pompa de presiune īnalta folosita pentru coloane cu particule de dimensiuni mici. Schema acestei pompe este prezentata īn Figura 4.17.

Figura4.17. Pompa de īnalta presiune cu un singur piston

Aceasta pompa consta dintr-un piston confectionat din safir, īn mod uzual avānd diametru de 3-4 mm si lungime de aproximativ 4 cm care se gaseste īntr-un cilindru din otel inoxidabil. Miscarea pistonului este comandata de un rotor excentric care are un profil special ce permite ca miscarea de refulare sa fie liniara si uniforma iar cea de aspiratie neliniara si rapida. Īntoarcerea pistonului pentru cursa de aspiratie este determinata de un arc de īntoarcere. Intrarea si iesirea solventului din pompa sunt reglate cu ajutorul a doua robinete cu o singura cale, care nu permit deplasarea sa decāt īntr-o singura directie. Volumul de solvent pompat la o cursa a pistonului este īn mod uzual īn jur de 250 μl, dar poate fi redus pāna la 2-5 μl daca se utilizeaza coloane īnguste.

Acest tip de pompa este de uz general si potrivita pentru majoritatea aplicatiilor LC. Din cauza faptului ca īn timpul realimentarii cilindrului fluxul de lichid este oprit pentru o scurta perioada, se creeaza niste pulsatii ale debitului de faza mobila. Aceste pulsatii nu influenteaza negativ separarea īn majoritatea cazurilor, deoarece coloana contine suficienta faza mobila pentru a atenua pulsatiile. Se poate folosi si un atenuator de pulsatii. Pulsatiile de debit pot determina cresterea zgomotului de fond pentru anumite detectoare, care nu mai pot fi īn aceste conditii folosite la sensibilitatea lor maxima. Totusi, īn majoritatea cazurilor ele nu reprezinta o problema reala si nu justifica achizitionarea unor pompe lipsite de pulsatii, care sunt mult mai scumpe.

Exista doua variante de asemenea pompe lipsite de pulsatii. Prima este pompa cu doua capete si dublu efect, care a fost realizata prima oara de firma Waters si consta īn utilizarea a doua pompe cuplate astfel īncāt atunci cānd una este īn faza de umplere cealalta sa fie īn faza de refulare (Figura 4.18). Acest lucru este asigurat prin proiectarea corespunzatoare a rotorului excentric, care comanda miscarea ambelor pistoane.

Figura 4.18. Reprezentarea schematica a unei pompe cu dublu efect si doua capete

1- piston; 2- rotor excentric; 3- arc; 4- corpul (cilindrul) pompei.

Acest tip constituie una dintre cele mai populare si mai trainice pompe care se fabrica la ora actuala.

Cea de-a doua varianta de pompa fara pulsatii este pompa cu realimentare rapida. Aceasta foloseste de asemenea doi cilindri si un singur piston comun. Diferenta este ca cea de-a doua pompa este folosita numai pentru realimentarea rapida a primei pompe, care realizeaza pomparea fazei mobile in coloana. Aceasta realimentare are loc de aproximativ 100 de ori mai repede decāt refularea, motiv pentru care pulsatiile pompei sunt reduse la minim.

Exista si un alt tip de pompa cu piston care se foloseste īn cromatografia de lichide, pompa cu membrana. Īn acest caz, pistonul nu mai este īn contact direct cu faza mobila ci doar cu un fluid numit fluid de actionare (driving fluid). Din acest motiv cerintele de etanseitate īntre piston si corpul pompei nu mai sunt atāt de stricte. Schema de functionare a unui asemenea pompe este prezentata īn Figura 4.19.

Īn urma miscarii aspiratoare si respingatoare a pistonului, fluidul de actionare determina o oscilatie alternativa a diafragmei, care se transmite asupra solventului aflat de cealalta parte. Īn felul acesta, solventul este aspirat din rezervor si trimis īn coloana. Suprafata diafragmei este relativ mare, ceea ce face ca miscarea diafragmei sa nu fie ampla si pompa poate fi exploatata la frecventa suficient de ridicata. Pulsatiile cu frecventa ridicata sunt atenuate mai usor de coloana. Cu toate acestea, trebuie mentionat ca pompele cu membrana nu sunt complet lipsite de pulsatii.

Figura 4.19. Pompa cu diafragma

Utilizarea pompelor trebuie facuta cu multa atentie, nefiind voie ca ele sa functioneze īn gol, fara solvent. Utilizarea ca solventi a acizilor clorhidric si bromhidric trebuie evitata deoarece acestia corodeaza chair si otelurile inoxidabile. De asemenea, daca se folosesc ca faze mobile solutii tampon, īn special cele care contin cloruri, acestea nu trebuie sa ramāna īn pompa dupa terminarea analizei, deoarece pot cauza coroziune.

4.3.2.3.5. Detectoare utilizate īn cromatografia de lichide

Functia detectorului este de a monitoriza faza mobila pe masura ce ea iese din coloana. Detectia prezinta mai multe probleme īn cromatografia de lichide decāt īn cea de gaze, neexistānd detectoare universale de tipul detectorului cu ionizare īn flacara.

Clasificarea detectoarelor se poate face īn doua categorii:

Detectoare care masoara modificarea unei proprietati fizice a efluentului coloanei. Asemenea detectoare īnregistreaza modificarea unei proprietati fizice a fazei lichide constituite din eluent si componenta separata īn coloana comparativ cu eluentul, de exemplu detectoarele de indice de refractie sau de conductivitate. Desi ele au o aplicabilitate destul de larga, au sensibilitate scazuta si sunt afectate de schimbarea compozitiei fazei mobile, deci nu pot fi folosite daca elutia se face cu gradient.

Detectoare care masoara modificarea unei proprietati a solutului. Din aceasta categorie fac parte detectoarele spectrofotometrice, cu fluorescenta si electrochimice. Ele raspund la o proprietate fizica caracteristica numai solutului si īn principiu sunt independente de eluent. Au sensibilitate ridicata si un domeniu larg de raspuns liniar, dar datorita specificitatii lor īn general este nevoie de mai mult decāt un detector pentru a realiza o analiza mai complexa. Exista asemenea unitati care contin mai multe detectoare situate īn serie, de exemplu de UV, fluorescenta si conductivitate.

Principalele cerinte pe care trebuie sa le īndeplineasca un detector sunt īn buna masura identice cu cerintele pentru detectoarele folosite īn cromatografia de gaze:

Sensibilitate ridicata

Domeniu de raspuns liniar cāt mai extins

Raspunsul detectorului sa depinda cāt mai putin de conditiile de lucru: temperatura si debitul fazei mobile.

La ora actuala exista un mare numar de detectoare folosite īn cromatografia de lichide. Cele mai importante, īmpreuna cu caracteristicile lor, sunt prezentate īn tabelul 4.5.

Tabelul 4.5. Principalele detectoare folosite īn cromatografia de lichide

Exista peste 30 de tipuri de detectoare, cele mai numeroase fiind cele spectrofotometrice, urmate de cele electrochimice si de detectoarele pentru anumite aplicatii specifice. Un aspect important la alegerea detectoarelor este compatibilatatea lor cu colanele īnguste sau cele capilare, deorece acestea impun anumite conditii pentru utilizarea detectoarelor.

Detectorul spectrofotometric īn UV-VIS

Se bazeaza pe masurarea transmitantei celulei de masura atunci cānd aceasta este strabatuta de eluentul care contine componentele separate īn coloana cromatografica. Conditia necesara este ca aceste componente sa aiba absorbtie suficient de mare īn domeniul spectral īn care functioneaza detectorul, iar eluentul sa fie transparent īn domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice īn UV-VIS se pot utiliza pentru analiza compusilor aromatici si a celor care poseda legaturi p conjugate: olefine, compusi carbonilici, dervati azoici, nitroderivati, dar si a proteinelor, enzimelor, acizilor nucleici si steroizilor. Ele se pot folosi īn elutia cu gradient si sunt aproape insensibile la variatiile de flux date de pulsatiile provocate de pompe. Dezavantajul lor major, alaturi de acela ca substantele analizate trebuie sa absoarba īn UV sau vizibil, este ca solventii utilizati trebuie sa fie de puritate deosebita, pentru ca absorbtia lor īn UV sa fie nula. Lipsa de absorbtie a solventului este o conditie esentiala mai ales īn cazul elutiei cu gradient, deorece nerespectarea acestei conditii ar duce la o deviere continua a liniei de baza. Īn aceste circumstante, detectorul spectrofotometric poate fi considerat un detector cu raspuns la modificarea proprietatilor solutului. Marimea absorbtiei unei componente este data de cunoscuta lege Lambert-Beer:

(77)

unde I₀ este intensitatea luminii incidente, I este intensitatea luminii transmise, A este absorbanta, ε este coeficientul molar de extinctie (īn l/mol·cm), l este lungimea parcursa de raza luminoasa īn solutie (īn cm), iar c este concentratia componentei īn solutie (īn mol/l).

Detectorul spectrofotometric īn UV-VIS este caracterizat de sensibilitate ridicata, limita detectie fiind 1·10^-9 g/ml pentru compusii cu absorbtie puternica si este relativ putin sensibil la variatiile de temperatura si debit ale fazei mobile.

Trebuie mentionat faptul ca aceste detectoare se pot utiliza si īn cazul substantelor care nu prezinta absorbtie sau au absorbtie slaba īn domeniul de lungimi de unda al detectorului, daca ele se pot transforma īn derivati care sa aiba o asemenea absorbtie. Acest lucru se face prin procedeul numit derivatizare postcoloana, īn care efluentului coloanei i se adauga un reactiv corespunzator si reactia de derivatizare are loc īnainte ca efluentul sa ajunga īn detector. Astfel unii aminoacizi, care nu prezinta decāt o absorbtie slaba īn UV datorata gruparii carbonilice, se pot detecta mult mai usor dupa transformarea īn derivati colorati prin reactie cu ninhidrina.

Exista trei tipuri de detectoare īn UV-VIS:

Detectorul cu lungime de unda fixa

Detectorul cu lungime de unda variabila

Detectorul cu sir de diode.

Detectorul cu lungime de unda fixa poate fi realizat īn varianta cu un singur fascicul sau cu doua fascicule. Detectorul cu doua fascicule este prezentat schematic īn Figura 4.20.

Figura 4.20. Schema detectorului UV-VIS cu dublu fascicul

Lumina provenita de la o sursa de radiatii (īn general o lampa de mercur) este focalizata cu ajutorul unui sistem de lentile pe cele doua celule, celula de masura si celule de referinta, apoi ajunge pe doua celule fotolelectrice. Semnalul acestor fotocelule este modificat electronic si apoi reprezinta semnalul de intrare pentru sistemul de achizitii de date al unui calculator sau integrator. Volumul celulei trebuie sa fie cāt mai mic cu putinta pentru a reduce dispersia picurilor si a asigura o separare corespunzatoare. Coloanele moderne sunt capabile sa reduca volumul īn care elueaza un pic la cātiva μl si daca volumul celulei este prea mare īn celula va intra mai mult decāt un pic, ceea ce va face imposibila rezolutia picurilor respective. Volumul celulei de masura la un detector modern nu are voie sa fie mai mare decāt 5 μl si este recomandat sa fie mai putin de 2 μl. Deoarece absorbanta este proportionala cu lungimea celulei, rezulta ca pentru a avea o celula cu sensibilitate mare ar fi indicata marirea lungimii acesteia. Cresterea lungimii celulei este īnsa limitata de necesitatea ca volumul celulei sa fie cāt mai mic. Pentru a avea o lungime cāt mai mare corespunzatoare unui volum cāt mai mic, rezulta ca ar trebui redus diametrul celulei, īnsa si aceasta reducere este limitata pentru ca se reduce concomitent si energia luminoasa care ajunge pe fotocelula si creste zgomotul de fond al detectorului. Celulele detectoarelor moderne au lungimi cuprinse īntre 1 si 10 mm si diametre interioare de 1 mm sau mai putin.

Detectorul cu lungime de unda variabila utilizeaza drept sursa o lampa care emite o radiatie pe un spectru larg de lungimi de unda (de exemplu o lampa de deuteriu) si prin utilizarea unui monocromator se poate selecta o radiatie cu o anumita lungime de unda dorita, īn intervalul 190-350 nm. La unele dintre aceste detectoare, exista si posibilitatea de a opri fluxul de faza mobila, de a retine componenta respectiva īn celula si de a-i face spectrul complet īn ultraviolet. Uneori aceste spectre pot fi utilizate pentru identificarea calitativa a componentelor respective, desi utilizarea spectrelor īn UV īn acest scop este limitata. Un alt avantaj al acestui tip de detector este ca pentru fiecare componenta se poate selecta lungimea de unda la care aceasta are absorbanta maxima si astfel de a creste sensibilitatea analizei.

Detectorul cu sir de diode utilizeaza o lampa de deuteriu sau de xenon care emite pe tot domeniul spectrului de UV. Lumina acestei lampi este focalizata cu ajutorul unui sistem de lentile prin celula de masura si apoi ajunge pe o retea de difractie (Figura 4.21). Lumina dispersata de aceasta retea cade pe un sir de diode. Fiecare dioda masoara cāte o banda īngusta a spectrului (aproximativ 2 nm), iar masuratoarea are loc īntr-un timp extrem de scurt (mai putin de 10 milisecunde). Astfel, practic la interval de milisecunde se obtine cāte un spectru UV. Utilizarea acestui detector are urmatoarele avantaje importante:

Se obtin spectrele tuturor componentelor separate, care pot fi utilizate pentru identificarea calitativa a acestora.

Prin alegerea unei anumite lungimi de unda se obtine cromatograma īn care apar doar compusii care absorb la lungimea de unda respectiva.

Rezultatele unei asemenea analize pot fi prezentate sub forma unor grafice tridimensionale absorbanta-timp-lungime de unda (Figura 4.22). Sensibilitatea detectoarelor cu sir de diode ajunge la 1,5·10^-7 g/ml.

Figura 4.21. Schema detectorului UV-VIS cu sir de diode

Figura 4.22. Cromatograma tridimensionala care prezinta absorbanta īn functie de timp si lungimea de unda, realizata cu un detector UV-VIS cu sir de diode

Detectorul cu fluorescenta

Este probabil cel mai sensibil detector folosit in cromatografia de lichide, cantitatea minima detectabila fiind de pāna la 100 de ori mai mica decāt īn cazul detectoarelor UV-VIS. El poate detecta compusii care prezinta fluorescenta sau pe aceia care pot fi transformati īn compusi flourescenti.

Prin fluorescenta se īntelege proprietatea unor molecule de a emite o radiatie īn momentul īn care au atins o stare electronica excitata īn urma absorbtiei unei radiatii. Un proces de fluorescenta cuprinde doua etape. Īn prima etapa, absorbtia unui foton determina trecerea moleculei respective īntr-o stare electronica excitata. Revenirea īntr-o stare energetica stabila are loc de asemenea prin emisia unui foton, adica prin ceea ce este numit fluorescenta. Energiile fotonilor absorbiti, respectiv emisi pot varia īn functie de nivelele energetice īntre care are loc tranzitia. Īn general, emisia se face la lungimi de unda mai mari (adica energii mai mici) decāt excitatia. Intensitatea fluoprescentei este proportionala cu concentratia compusului respectiv.

Numarul compusilor care manifesta proprietatea de fluorescenta naturala este destul de redus, īn aceasta categorie īntrānd compusii aromatici, mai ales cei polinucleari condensati. O serie de compusi care nu manifesta fluorescenta naturala pot fi īnsa transformati īn derivati fluorescenti. Aceasta transformare se poate face īnaintea separarii cromatografice, numindu-se derivatizare precoloana, sau dupa separarea cromatografica, adica prin derivatizare postcoloana. Derivatizarea precoloana prezinta avantajele ca se pot alege conditiile de reactie pentru derivatizare fara a se tine cont de sistemul de eluent, se poate elimina fara probleme excesul de reactiv de derivatizare, iar īn unele cazuri selectivitatea separarii cromatografice pentru compusul derivatizat este mai mare decāt pentru cel nederivatizat. De asemenea, nu reprezinta un impediment daca reactia de derivatizare are loc mai lent. Avantajul principal al derivatizarii postcoloana este ca se poate realiza automat, prin dozarea reactivului de derivatizare īn efluentul coloanei, fara a fi necesara efectuarea acestei reactii īn afara sistemului cromatografic.

Reactivul de derivatizare cel mai mult folosit este clorura de dansil (5-dimetil-amino-naftalin-1-sulfoclorura). Acest reactiv se poate utiliza si īn cromatografia īn strat subtire, de exemplu pentru analiza aminoacizilor, sau īn cromatografia HPLC pentru analiza compusilor farmaceutici. Un alt reactiv de fluorescenta utilizat este dansilhidrazina, care s-a utilizat cu succes pentru analiza aldehidelor si cetonelor.

Un model simplu de detector cu fluorescenta este prezentat īn Figura 4.23:

Lampa de UV care emite radiatia de excitatie este īn general o lampa de mercur de presiune redusa care emite la 253,4 nm. O serie de substante fluorescente sunt excitate de lumina emisa la aceasta lungime de unda. Radiatia este dirijata cu ajutorul unor lentile prin celula de masura, iar radiatia fluorescenta emisa este focalizata cu ajutorul altor lentile pe o fotocelula.

Exista detectoare de constructie mai complexa, care permit detectarea selectiva a radiatiei fluorescente de o anumita lungime de unda, sau chiar obtinerea unui spectru de fluorescenta al substantei respective.

Figura 4.23. Detectorul cu fluorescenta

Detectorul refractometric diferential

Este un detector universal, cu buna stabilitate dar mai putin sensibil, care masoara variatia indicelui de refractie īn prezenta componentelor separate īn coloana cromatografica. Are si dezavantajul ca este foarte sensibil la schimbarile de temperatura, deci trebuie termostatat cu mare precizie ( 0,001ŗC pentru a putea fi utilizat la sensibilitatea maxima). De asemenea, nu poate fi utilizat īn cazul īn care elutia se face cu gradient si nu se pot folosi decāt solventi care au indice de refractie mult diferit de cel al compusilor analizati. Cu toate aceste limitari, detectorul de indice de refractie este extrem de util pentru analiza compusilor neionici, care nu absorb īn UV si nu prezinta fluorescenta.

Exista doua tipuri de detectoare refractometrice: cu deflectie si cu reflexie sub unghi limita (de tip Fresnel). Schema de principiu a unui refractometru cu deflectie este prezentata īn Figura 4.24.

Figura 4.24. Detectorul refractometric diferential

Raza de lumina incidenta, provenita de la un bec cu incandescenta, īn general o lampa cu filament de wolfram, trece printr-o lentila de focalizare si este dirijata pe celula detectorului. La trecerea din celula de referinta īn cea de masura, raza va fi deviata cu un unghi proportional cu diferenta dintre indicii de refractie ai lichidelor care se gasesc īn cele doua celule. Raza reflectata de oglinda trece din nou prin cele doua celule, dupa care este focalizata de o alta lentila pe o celula fotoelectrica. Cānd raza de lumina īsi schimba pozitia pe celula, semnalul pe care acesta īl emite se va modifica, iar diferenta fata de semnalul de baza este amplificata si constituie de fapt raspunsul detectorului, fiind proportionala cu concentratia componentei īn celula refractometrului.

Sensibilitatea acestui detector ajunge pāna la 10^-6 g/ml (deci de ordinul ppm). Este utilizat cu rezultate bune pentru analiza hidratilor de carbon si a unor polimeri.

4.3.3. Cromatografia ionica

Cromatografia ionica (IC) reprezinta de fapt versiunea de īnalta performanta a cromatografiei de schimb ionic clasice. Poate fi realizata atāt utilizānd echipamente HPLC uzuale cāt si cromatografe construite special pentru aceasta tehnica. Se pot separa atāt cationi cāt si anioni, folosind rasini schimbatoare de ioni corespunzatoare, īnsa schimbatorii coventionali au creat probleme pentru separarile HPLC datorita vitezei mici de difuzie prin masa de rasina si datorita compresibilitatii materialului. Aceste probleme au fost rezolvate prin legarea rasinii pe suprafata unor particule sferice de sticla cu diametre cuprinse īntre 30-50 μm, realizānd o umplutura peliculara, sau prin legare de suprafata unor microparticule rigide, realizānd o umplutura de tip faza inversa. Asemenea faze stationare pot fi folosite pentru separarea cu rezolutii ridicate atāt ale unor amestecuri continānd cationi cāt si a celor care contin anioni. Eluarea se face cu o faza mobila tamponata si cu tarie ionica crescatoare.

Detectoarele conventionale utilizate īn HPLC, cum ar fi cele de UV, pot fi utilizate pentru detectarea ionilor organici, dar nu si a celor anorganici care au necesitat dezvoltarea unor sisteme noi de detectie, printre care s-a impus detectorul de conductivitate electrica. O alta posibilitate este utilizarea detectiei indirecte īn UV, cānd solventul de elutie contine o concentratie constanta dintr-o substanta cu absorbtie mare, de exemple biftalat de potasiu sau benzoat de sodiu, care da un semnal puternic īn detectorul de UV. Aparitia īn detector a unei alte componente care nu absoarbe īn UV va determina scaderea absorbantei si aparitia unui pic negativ īn forma originala, care īnsa prin inversarea polaritatii īnregistratorului se poate transforma usor īntr-un pic obisnuit.

4.3.4. Cromatografia prin excluziune

Cromatografia prin excluziune (SEC) se bazeaza pe separarea moleculelor de solut īn conformitate cu marimea lor. Tehnica separarii compusilor solubili īn apa si care are loc īn solutii apoase este denumita cromatografie prin gel-filtrare si este utilizata de exemplu pentru purificarea proteinelor. Separarile care au loc īn solutii neapoase sunt cunoscute sub numele de cromatografie de permeatie prin gel. Īn ambele cazuri mecanismul separarii este identic si se bazeaza doar pe marimea relativa a porilor fazei stationare comparativ cu marimea moleculelor de solut, neavānd loc interactiuni īntre solut si faza stationara.

Fazele stationare utilizate īn acest tip de cromatografie sunt materiale porase cu porozitate strict controlata, iar mecanismul retentiei consta īn penetrarea diferita a moleculelor de solut īn interiorul particulelor de gel. Moleculele mari nu vor putea patrunde īn interiorul gelului si vor fi antrenate de faza mobila prin spatiile dintre particulele retelei de gel. Moleculele mici vor putea patrunde īn interiorul gelului, īn functie de dimensiunile lor si dimensiunile porilor si deci vor fi retinute mai puternic.

Īn cromatografia de excluziune sterica clasica, drept materiale pentru faza stationara s-au utilizat dextrani reticulati (Sephadex) sau geluri de poliacrilamida (Bio-Gel). Aceste geluri semirigide nu pot fi īnsa folosite īn conditiile presiunilor ridicate utilizate īn tehnicile HPLC, de aceea fazele stationare moderne sunt realizate pe baza de microparticule din copolimer stiren-divinilbenzen (Ultrastyragel), silice, sau sticla poroasa.

Cromatografia prin excluziune are aplicatii analitice atāt pentru separarea compusilor organici cāt si a celor anorganici. Desi exista asemenea aplicatii si pentru separarea moleculelor simple, ea este utilizata cu precadere pentru separarea biomoleculelor si a altor compusi cu grad ridicat de polimerizare.

Volumul total V_t al unei coloane de excluziune este constituit din trei parti:

Volumul ocupat de particulele solide ale umpluturii, care constituie aproximativ 20% din volumul total.

Volumul porilor V_p, care reprezinta aproximativ 40% din volumul total. Moleculele mici si moleculele de solvent pot trece prin acesti pori īn timp ce strabat coloana.

Volumul mort V_m, care reprezinta restul de 40% si este volumul spatiilor dintre particulele de umplutura. Moleculele mari, care nu pot sa intre īn pori, vor trece doar prin aceste spatii.

Rezulta de aici ca volumul de elutie util (īn care se gasesc componentele separate) este aproximativ jumatate din volumul total al coloanei. O alta observatie importanta este ca o umplutura de anumita porozitate va putea separa efectiv doar moleculele pe un interval de diferenta de masa de 1,5-2,5 ordine de marime. Umpluturile comerciale au marimile porilor cuprinse īntre 50 Å si 10 Å. Aceste marimi ale porilor nu īnseamna dimensiunile efective ale porilor umpluturii din coloana ci dimensiunea minima a standardului de polietilena care nu este retinut, adica limita de excluziune a umpluturii respective.

Īn cromatografia de excluziune este uzual sa se cupleze mai multe coloane pentru a īmbunatati separarea. Daca se cupleaza doua sau mai multe coloane cu aceeasi limita de excluziune se urmareste cresterea numarului de talere, adica rezolutia, fara a modifica domeniul de masa al compusilor care pot fi separati. Daca se cupleaza doua sau mai multe coloane cu porozitati diferite, se urmareste extinderea domeniului de masa al compusilor care pot fi separati. O serie de coloane comerciale sunt umplute utilizānd un anumit solvent si ele trebuie pastrate sub acelasi solvent. Eluentii cei mai utilizati sunt toluenul, tetrahidrofuranul, diclormetanul, cloroformul, dimetilformamida si dimetilsulfoxidul.

4.4. Alegerea tipului de cromatografie de lichide pentru o anumita separare

Pentru alegerea tipului de cromatografie pentru o anumita separare este necesara cunoasterea caracteristicilor fizice ale amestecului respectiv. La mase moleculare mai mari de 2000, metoda de separare este cromatografia prin gel-filtrare sau permeatia prin gel. Īn cazul separarii compusilor cu mase moleculare mai mici de 2000, alegerea metodei celei mai potrivite se poate face conform schemei prezentate īn Figura 4.25.

Figura 4.25. Alegerea sistemului cromatografic: IC = cromatografie ionica; LSC = cromatografie lichid-solid; BPC = cromatografie cu faze chimic legate; RPC = cromatografie cu faze inverse.

Trebuie īnsa mentionat ca o anticipare corecta a metodei cromatografice potrivite nu se poate face cu certitudine si ea trebuie confirmata de experimente, iar īn cazul amestecurilor complexe de multe ori este necesara o combinare a mai multor tehnici.