Enzimele si reactiile chimice
Enzimele reprezinta biocatalizatorii de natura proteica specifici reactiilor chimice din organismele vii. Dezvoltarea puternica a enzimoligiei este legata de perioada ultimelor decenii, desi prima descoperire a unei enzime o datoram cercetarilor lui Payen si Persoz care īn 1833 obtin dintr-un extract apos al proteinelor din malt, prin precipitare cu alcool etilic, un principiu activ capabil sa hidrolizeze amidonul cu formare de mono si diglucide. Astazi acesta substanta este cunoscuta ca amilaza.
Conceptia asupra modului īn care are loc cataliza enzimatica a fost profound reconsiderata. Initial s-a considerat, prin analogie cu catalizatorii anorganici, ca enzimele sunt catalizatori de suprafa# 19119t1912t 5;a. Ulterior s-a demonstrate ca moleculele de enzime poseda mai multi centri activi, reactia avānd loc īntr-un punct īn care molecula enzimei are o structura ce se poate modifica specific pentru a se lega cu substratul. Astfel catre sfārsitul secolului al XIX-lea Fischer, studiind specificitatea enzimelor pentru substrat, elaboreaza cunoscuta teorie a cheii si broastei, conform careia raportul structural dintre enzima si substratul sau este similar aceluia dintre cheie si broasca.
Īn majoritatea cazurilor, centrul activ al unei enzIme nu este constituit dintr-un singur component, ci dintr-o suita de resturi de aminoacizi aranjati īntr-o configuratie care sa corespunda steric structurii chimice a substratului [Dumitru, 1974].
Principiile de baza ale catalizei si ratiunea utilizarii acesteia īn chimia organica nu sunt noi, ele se regasesc īn cercetarile lui Pasteur din a doua jumatate a secolului al XIX-lea. El a demonstrat ca obtinerea unui izomer optic activ pornindu-se de la amestecul racemic este posibila prin utilizarea unui microorganism care ataca si degradeaza doar un singur enantiomer, lasāndu-l pe celalalt nemodificat.
Īn jurul anului 1900 a fost descoperit si un alt aspect al biocatalizei, a carui importanta a fost recunoscuta doar īn ultimii zeci de ani.Este vorba de fapt ca actiunea catalitica a enzimelor hidrolitice este reversibila, īn sensul ca ele catalizeaza si reactiile inverse. Evident īnsa ca īn acea perioada proceselor biocatalitice nu li se acorda īmportanta cuvenita, īntrucāt se stia doar foarte putin despre felul īn care se desfasoara aceste procese.
Enzimele, care sunt biocatalizatori de natura proteica, actioneaza īn medii apoase neutre si la temperatura ambianta, reusind sa īntermedieze desfasurarea unor reactii de o complexitate mare. Dupa ce progresele īnregistrate īn domeniul biotehnologiei au facut posibila obtinerea unui numar mare de enzime accesibile la pret, utilizare alor a cunoscut o foarte mare dezvoltare. Procesele biocatalitice se bazeaza pe utilizarea capacitatii catalitice a enzimelor si pot fi incluse īn ramura biotehnologiilor. [Preda, 2003]
Procesele fermentative clasice constau īn cultivare unor microorganisme, care pot fi bacterii, drojdii sau ciuperci, pe medii nutritive potrivite care reprezinta substratul pentru metabolismul lor. Substrat este denumit reactantul a carei transformare chimica este cataliza de enzima. Īn functie de scopul urmarit, exista patru tipuri de asemenea procese:
procese care produc celule microbiene sau biomasa
procese care produc enzime microbiene
procese īn care se obtin metabolitii de natura microbiana
procese de transformare, care realizeaza modificarea unui compus chimic introdus īn mediul de cultura.
Trebuie remarcat ca īn toate aceste procese se produce īntr-o prima faza dezvoltarea microorganismului respectiv pe substratul organic si abia dupa aceea are loc conversia propriu-zisa a acestuia. Cel mai simplu si clasic exemplu este dat de fermentatia glucozei la etanol cu Saccharomyces cerevisiae. O alta caracteristica a proceselor fermentative este aceea ca īn general exista mai multe etape catalitice īntre substrat si produs si deci mai multe enzime implicate īn realizarea lor. Acest tip de procese prezinta īnsa si doua dezavantaje importante:
procesul este īnsotit īn toate cazurile de obtinerea unor cantitati īnsemnate de biomasa si drept urmare concentratia produsului util mediu de fermentatie este redusa, iar separarea ei este dificila si costisitoare;
īn general, microorganismele produc o deversitate mare de enzime, chiar īn conditii de cultra controlate, ceea ce poate duce la aparitia unor produse secundare nedorite.
Interesul pentru utilizare enzimelor drep biocatalizatori a crescut foarte mult īn ultimii ani. Reactiile chimice obisnuite, pentru a putea fi realizate īn mod eficient, necesita adeseori temperaturi sau presiuni īnalte.
1. Enzime
1.1 Clasificarea enzimelor
Desi au existat o multime de īncercari de clasificare a enzimelor pāna īn 1955 nu s-a gasit o solutie satisfacatoare. De aceea s-a īnfiintat la initiativa Uniunii Internationale de Biochimie, Comisia de Enzimologie cu misiunea de a elabora o clasificare si o nomenclatura unica a enzimelor si coenzimelor, de a stabili si defini unitatile īn care se poate exprima activitatea unei enzime, precum si de a recomanda simboluri unice pentru cinetica enzimatica.
Astfel enzimele sunt clasificate īn clase dupa natura similara a procesului catalitic, īn subclase, īn functie de unele detalii privind gruparile chimice supuse transformarii si natura cofactorilor implicati īn reactie.
Fiecare enzima este desemnata printr-un cod format din patru cifre care contine informatii despre enzima respectiva (lactat dehidrogenaza are codul EC 1.1.1.27, EC reprezinta prescurtarea de la Enzyme Comission).
Īn functie de reactia pe care o catalizeaza avem sase mari clase:
oxidoreductaze: catalizeaza diferite reactii redox
transferaze: catalizeaza reactii de transfer a unor grupari chimice
hidrolaze: catalizeaza scindarea hidrolitica a diferitelor legaturi sau grupari
liaze: catalizeaza reactii de eliminare a unor grupari din molecula substratului cu formarea unei duble legaturi
izomeraze: catalizeaza reactii de izomerizare D-L, cis-trans etc.
ligaze sau sintetaze: catalizeaza reactii de condensare a doua molecule, cuplate cu scindarea unei legaturi macroergice din ATP sau dintr-un trifosfat similar
A doua cifra a codului indica subclasa:
pentru oxidoreductaze a doua cifra indica donorul de fidrogen: grupari CH-OH, grupari aldehidice sau cetonice, grupari CH-CH, grupari CH-NH2 etc.
pentru transferaze a doua cifra indica gruparea care este transferata: grupari cu un atom de carbon, resturi de aldehide sau cetone, resturi acil, grupari glicozil, grupari alchil, etc.
Pentru hidrolaze a doua cifra indica compusii sau legaturile asupra carora actioneaza enzimele: legaturi esterice, compusi glicozil, legaturi peptidice, etc
A treia cifra a codului indica sub-subclasa. Pentru oxidoreductaze, a treia cifra indica acceptorul de hidrogen, care poate fi NAD+ sau NADP+, un citocrom, oxigenul molecular, etc. Pentru transferaze a treia cifra da indicatii asupra tipului de grupare transferata, metil, hidroximetil si formil, carboxil si carbamoil, etc.
A patra cifra este numarul de ordine a enzimei din sub-subclasa de care apartine. [Dumitru, 1974]
1.2 Hidrolazele
Clasa hidrolazelor este o clasa ce cuprinde toate enzime care catalizeaza reactii de transfer īn care acceptorul principal este apa [Dumitru, 1974].
Reactia generala catalizata de hidrolaze este:
Clasificarea hidrolazelor
3. Hidrolaze
3.1 actioneaza asupra legaturilor esterice
3.1.1 hidrolazele esterilor carboxilici
3.1.2 hidrolazele tiolesterilor
3.1.3 hidrolazele monoesterilor fosforici
3.1.4 hidrolazele diesterilor fosforici
3.1.5 hidrolazele monoesterilor trifosforici
3.1.6 hidrolazele esterilor sulfurici
3.2 actioneaza asupra compusilor glicozil
3.2.1 glicozid hidrolaze
3.2.2 hidrolazele compusilor N-glicozil
3.2.3 hidrolazele compusilor S-glicozil
3.3 actioneaza asupra legaturilor eterice
3.3.1 tioeter hidrolaze
3.4 actioneaza asupra legaturilor peptidice
3.4.1 α-amino-acil-peptid hidrolaze
3.4.2 peptidil-aminoacid hidrolaze
3.4.3 dipeptid hidrolaze
3.4.4 peptidil-peptid hidrolaze
3.5 actioneaza asupra unor legaturi C-N altele decāt cele peptidice
3.5.1 din amide lineare
3.5.2 din amide ciclice
3.5.3 din amidine lineare
3.5.4 din amidine ciclice
3.5.5 din cianuri
3.5.99 din alti compusi
3.6 actioneaza asupra legaturilor anhidrice din acizi
3.6.1 din fosforil anhidride
3.7 actioneaza asupra legaturilor C-C
3.7.1 din substante cetonice
3.8 actioneaza asupra legaturilor īn care sunt implicati halogenii
3.8.1 din compusi C-halogen
3.8.2 din compusi P-halogen
3.9 actioneaza asupra legaturilor P-N
1.2.1 Amilazele (EC 3.2.1)
Fac parte din subgrupa glicozidazelor, enzime ce catalizeaza hidroliza compusilor īn a caror constitutie intra grupari glicozil
Sunt hidrolaze care catalizeaza hidroliza legaturilor -1,4-glucan din polizaharide (amidon, glicogen, oligo si polizaharide īnrudite)
Amilazele apar sub doua forme distincte:
-amilazele - scindeaza specific legaturi glicozidice situate īn mijlocul lantului polizaharidic care contine mai mult de trei unitati de D-glucoza -1,4-legate (endo-amilaze), cu denumirea sistemica -1,4-glucan 4-glucanohidrolaza
-amilazele - actioneaza la capatul nereducator al lantului polizaharidic scindānd resturi de maltoza (exo-amilaze), cu denumirea sistemica -1,4-glucan maltohidrolaza
Amidonul nu este o substanta unitara, ci un amestec de doua tipuri de polizaharide: amiloza si amilopectina. Amiloza este formata din polizaharide ce contin resturi de glucoza unite numai prin legaturi 1,4-α-glucozidice cu un grad de polimerizare īntre 100 si 2000. amilopectina spre deosebire de amiloza este ramificata prin legaturi 1,6-α-glucozidice. α-amilaza hidrolizeaza amidonul la un procent de 80% zahar reducator si 20% dextrine.
Prin folosirea concentratiilor mari de α-amilaza, amiloza este hidrolizata complet la un amestec de 13% glucoza si 87% maltoza. Amilopectina īn aceleasi conditii este hidrolizata complet la un amestec de 19% glucoza, 72% maltoza si 8-9% izomaltoza, care contine toate legaturile 1,6-α-glicozidice din ramificatii.
Amilazele din regnul animal apartin α-amilazelor. Pāna īn prezent nu s-au identificat β-amilaze le animale.
α-amilazele se gasesc īn:
- boabe de cereale germinate. Se presupune ca ele exista si īn cele negerminate sub forma de precursori inactivi care sunt activati īn timpul germinarii prin enzimele proteolitice
- culturi de mucegaiuri de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
- culturi bacteriene de Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymyxta si Clostridium acetobutylicum
- animale īn pancreasul de porc, pancreas sau saliva umana
β-amilazele se gasesc numai īn plantele superioare, cereale germinate si negerminate, cartofi dulci, boabe de soia.
Proprietatile amilazelor de diferite origini difera prin conditiile optime de mediu si prin proprietatile lor fizico-chimice (amilaza umana este mai activa decāt cea de origina suina).
α-amilazele sunt proteine pure fara grupa prostetica. Limitele de pH la care este stabila se īncadreaza īn intervalul 4.5-11, cu un optim de 6,9 ( mai acid la amilazele de origine microbiana: 5.5-5.9). Activitatea creste cu temperatura pāna la 400C, apoi descreste [Vasilescu, 1978].
1.2.2 Peptidazele (EC 3.4)
Cunoscute si ca enzime proteolitice sau proteze sunt enzime care catalizeaza hidroliza lanturilor polipeptidice care alcatuiesc moleculele substantelor proteice.
Se diferentiaza:
- peptidaze care actioneaza preferential asupra legaturilor peptidice situate la capatul N-terminal al proteinei sau peptidei (leucin aminopeptidaza EC 3.4.1.1)
- peptidaze ce scindeaza legaturi C-N de la capatul C-terminal al peptidei (carboxipeptidaza A - EC 3.4.2.1, scindeaza aminoacidul C-terminal daca acesta nu este prolina sau un aminoacid bazic; carboxipeptidaza B - EC 3.4.2.2, scindeaza aminoacidul C-terminal daca acesta este lizina sau arginina)
- dipeptidaze ce hidrolizeaza legaturile C-N din diferite dipeptide, necesitānd o grupa amino si o grupa carboxil libera (glicilglicin-dipeptidaze, hidrolizeaza glicilglicina la glicocol; glicil-L-leucin-dipeptidaze, hidrolizeaza glicil-L-leucina la glicocol si L-leucina)
- peptidpeptidohidrolaze (3.4.4), care includ principalele enzime digestive [Dumitru, 1974].
Pepsina hidrolizeaza legaturile peptidice din vecinatatea L-aminoacizilor aromatici sau dicarboxilici. Se gaseste īn sucul gastric, hidrolizeaza cca. 30% din legaturile peptidice existente īn substantele proteice; produsii de reactie sunt albumoze, peptone si cantitati mici de aminoacizi.
Este produsa īn stomac īn stare inactiva sub forma de pepsinogen. Activarea sa este autocatalitica la contactul cu acidul clorhidric din sucul gastric. pH-ul optim variaza īn functie de natura substratului, dar se situeaza īn general īn jurul lui 2. pepsina īsi mentine stabilitatea la valori de pH cuprinse īntre 1 si 6.
Tripsina hidrolizeaza peptide, amide, esteri, scindānd legaturile ce implica gruparile carbonil ale L-argininei sau L-lizinei. Nu poate ataca proteine īn stare nativa, numai dupa o denaturare termica sau pe alta cale.
Este produsa īn pancreas īn stare inactiva sub forma de tripsinogen. Activarea are loc la contactul cu enterochinaza din mucoasa intestinala la valori ale pH-ului cuprinse īntre 7 si 9. pH-ul optim este 8.
Renina hidrolizeaza hemoglobina la pH = 3,7 si coaguleaza cazeina din lapte īn prezenta ionilor de calciu. Este produsa īn stomacul glandular al viteilor īn stare inactiva sub forma de prorenina. Activarea are loc la pH = 5,3 si mai mici sub actiunea ionilor de hidrogen
Papaina catalizeaza hidroliza peptidelor, amidelor, si esterilor ce implica resturi ale unor aminoacizi bazici, ale leucinei sau glicinei. Se gaseste īn latexul de Carica papaya [Vasilescu, 1978].
|
