Parte experimentala

Parte experimentala

Metode de analizǎ si protocoale de lucru

Determinarea activitǎtii proteolitice prin metoda Anson modificatǎ pentru cazeinǎ

Principiul metodei

În urma hidrolizei cazeinei în prezenta enzimelor proteolitice se elibereaza în mediul de reactie produsi de hidroliza care se determina colorimetric cu reactivul Folin-Ciocâlteu ca tirozina [Anson, 1939

Reactivi

Solutia de cazeina 2%: se dizolva 2 g cazeina Hammerstein în 70 mL apa distilata adusa în prealabil la pH 10 cu NaOH. Dupa dizolvare se ajusteaza pH-ul la 8,0 cu HCl si se aduce la 100 mL cu apa distilata.

Solutie NaOH 0,5 M.

Solutie acid tricloracetic (TCA) 5% (greutate/greutate).

Reactiv Folin-Ciocâlteu diluat cu apa distilata în raport de volum 1:2 imediat înainte de folo 12412h77m sire. Într-un balon de refluxare se introduc pe rând: 100 g Na₂WO₄·2H₂O + 25 g Na₂MoO₄·2H₂O care se dizolva în cca. 700 mL apa distilata, dupa care se adauga 50 mL H₃PO₄ 85% si 100 mL HCl conc. si se încalzeste la reflux timp de 10 ore. Apoi se adauga 150 g LiSO₄ dizolvat partial în 50 mL apa distilata si câteva picaturi de brom. Amestecul se fierbe fara refrigerent pâna nu se mai degaja brom, se raceste, se dilueaza la 1 litru si se filtreaza. Reactivul de culoare galbena trebuie tinut într-o sticla bruna la 4șC.

Solutie tampon fosfat 0,05 M, pH 8: se dizolva 36,57 mg NaH₂PO₄·H₂O si 1,6959 g Na₂HPO₄·12H₂O în apa distilata si se aduce la balon cotat de 100 mL.

Solutie HCl 0,2 N.

Solutie L(-)-tirozina 1 mM: se dizolva 181,19 mg tirozina în apa distilata si se aduce la balon cotat de 1000 mL.

Aparatura

Spectrofotometru UV - VIS tip PG Instruments T 60U.

Curba de etalonare pentru tirozina

Se pipeteaza în 11 eprubete 0; 40; 80; 120; 160; 200; 240; 320; 360 si 400 ”l solutie L(-) - tirozina. Se completeaza la 2,00 mL cu HCl 0,2 N. Se adauga câte 4 mL NaOH 0,5 N si sub agitare puternica 1,2 mL reactiv Folin-Ciocâlteu. Se lasa la temperatura camerei 30 minute, apoi se citeste absorbanta la 578 nm fata de apa distilata. Se scade absorbanta martorului. Se construieste un grafic cu E578 pe ordonata si ”moli L(-) - tirozina pe abscisa (tabelul 4.1 si figura 4.1).

Reactia enzimatica

Se lucreaza cu 2 probe si 2 martori în paralel.

Se termosteaza la 37°C în eprubete:

2 mL solutie substrat (cazeina)

0,8 mL solutie tampon fosfat 0,05 M pH 8,0

La timpul zero se adauga 0,2 mL solutie enzimatica. Reactia se stopeaza dupa 10 minute, prin adaugare sub agitare, a 4 mL solutie TCA 5%. Martorul se realizeaza în aceleasi conditii, dar solutia de TCA se adauga înaintea cazeinei. Adaugarea TCA se face sub agitare puternica. Probele se lasa la temperatura camerei 30 minute, apoi se filtreaza pe hârtie de filtru.

Reactia de culoare

Din filtrat se iau probe pentru reactia de culoare si anume se pipeteaza în ordine:

1 mL filtrat

1 mL HCl 0,2 N

4 mL solutie NaOH 0,5 N

1,2 mL reactiv Folin-Ciocâlteu diluat 1:2

Dupa adaugarea fiecarui reactiv probele se agita. Se lasa sa stea 30 minute la temperatura camerei pentru perfectarea culorii, apoi se citeste extinctia la 578 nm fata de apa distilata. Din curba de etalonare se determina ”moli tirozina corespunzator la extinctia masurata.

Tabel 4.1.

Curba de etalonare pentru proteaze cu L-Tyr

”moli tirozina

Figura 4.1. Curba de etalonare pentru proteaze cu L - Tyr

moliTyr = [E_med - E_martor + 0,02604]/1,21188

Calculul rezultatelor

Metoda Anson defineste o unitate enzimatica drept cantitatea de enzima care elibereaza în mediu, prin hidroliza hemoglobinei, 1 mM tirozina per minut la 37°C. Pentru usurinta calculelor raportul s-a facut la 1 ”mol tirozina. Metoda a fost adaptata pentru cazeina (solutia fiind mai ieftina si mai usor de preparat).

Activitatea enzimatica se calculeaza cu formula:

A = (U/mg)

unde:

= volumul solutiei enzimatice luat la incubare, mL;

1 = volumul filtratului luat în lucru, mL;

7 = volumul total la incubare, mL;

= timpul de incubare, minute;

g = concentratia solutiei enzimatice, mg/mL.

Metoda Summner de dozare a activitatii amilazice cu

acid 3,5-dinitrosalicilic

Principiul metodei

În urma actiunii enzimelor amilolitice asupra amidonului se formeaza zaharuri reducatoare (maltoza, glucoza). Gruparea aldehidica din zaharurile reducatoare, în mediu puternic alcalin si la fierbere, reduce gruparea nitro din acidul 3,5-dinitrosalicilic (DNS), rezultând un compus colorat rosu (acidul 3-amino-5-nitrosalicilic), care se spectrofotometreaza la 540 nm. Concentratia zaharurilor reducatoare se determina prin comparatie cu solutii etalon de glucoza sau maltozǎ [Preda, 2003].

acid 3,5-dinitrosalicilic acid 3-amino-5-nitrosalicilic

Reactivi si solutii

Solutie de amidon 1%: se cântaresc 0,5 g amidon solubil (uscat în prealabil la greutate constantǎ si pǎstrat în exicator) si se ampasteaza cu putina apa. Se aduc la fierbere aproximativ 25 mL de apa distilata si se toarna peste pasta de amidon. Solutia obtinutǎ se fierbe 3-5 minute, apoi se raceste si se aduce la semn în balon cotat de 50 mL cu apa ditilata;

Solutie tampon citrat-fosfat 0,15 M, pH 4,6 care se preparǎ astfel

Solutie A: solutie acid citric 0,1 M, 21,01g/l;

Solutie B: solutie Na₂HPO₄ ·2H₂O, 135,61g/l;

Prepararea tamponului: 53,8 mL solutie A + 46,2 mL solutie B;

Solutie de maltoza: 0,0758 g monohidrat de maltoza se dizolva si se aduc la semn în balon cotat de 50 mL cu apa distilata;

Solutie de acid 3,5-dinitrosalicilic: 0,25 g DNS se dizolva într-un amestec de 5 mL NaOH 2N si 12 mL apa distilata. Se adauga 7,5 g tartrat de sodiu si potasiu, se dizolva si se dilueaza la 25 mL cu apa distilata;

Solutie NaOH 2 N (8 g NaOH se dizolvǎ în apǎ distilatǎ si se aduce la volum final de 100 mL);

Solutii enzimatice: a-amilaza si glucoamilaza.

Aparaturǎ

Termostat

Baie de apa

Spectrofotometru UV-VIS PG Instruments T 60U.

Mod de lucru

Modul de lucru schematic este prezentat în tabelul 3.5. Se pipeteaza în eprubete, în ordine, primele 2 solutii. La timpul 0 se adauga solutia de enzima si se incubeaza exact 5 minute. Apoi se adauga solutia de DNS si se fierbe 10 minute pe baia de apa.

Tabelul 4.2.

Modul de lucru schematic de determinare a activitatii amilazice

Proba, martorul si standardul de maltoza se spectrofotometreaza la 540 nm fata de blanc.

Calculul rezultatelor

Activitatea amilazica fata de maltoza se calculeaza cu formula:

(A_P-A_M) · C_M · 10 μmol_maltozǎ

A = --------- , ------

A_SM · t mL_enzimǎ · min.

unde:

C_M - cantitatea de maltoza din standard (2 ”moli);

A_P - absorbanta probei;

A_M - absorbanta martorului;

A_SM - absorbanta standardului de glucoza;

t - timpul de incubare (5 minute);

1U - mol maltoza/mL enzima·minut la 25 C.

4.1.3. Metoda Lowry de determinare a proteinelor

Principiul metodei

Dozarea proteinelor (domeniu 25 - 500 ”g) se bazeaza pe pe reducerea fosfomolibdatilor si fosfowolframatilor din reactivul Folin-Ciocâlteu de catre compusii fenolici din proteina (tirozina) Lowry, 1959

Reactivi

Solutie enzimatica.

Solutie alcalina A. Se dizolva 4 g NaOH, 10 g Na₂CO_3, 0,2 g tartrat dublu de sodiu si potasiu în apa distilata si se aduce la 1 litru în balon cotat.

Solutie B. Solutie CuSO₄ 0,5%.

Reactiv alcalin de cupru. Înainte de folosire se amesteca 50 mL solutie alcalina A cu 1 mL solutie CuSO4 0,5% B.

Reactiv Folin-Ciocâlteu diluat cu apa 1:2 înainte de utilizare.

Solutie etalon de albumina serica bovina (BSA) în apa distilata (1 mg/mL).

Aparatura

Spectrofotometru UV - VIS PG Instruments T 60U.

Trasarea curbei de etalonare

Se iau cote parte din solutia etalon de BSA si se completeaza cu apa distilata la 0,2 mL. Se adauga în ordine 5 mL reactiv alcalin de cupru si 0,5 mL reactiv Folin. Se lasa la temperatura camerei 30 minute, apoi se citeste extinctia în functie de un martor obtinut în aceleasi conditii, dar cu înlocuirea solutiei de BSA cu apa distilata. Pentru siguranta determinarii se fac doua probe în paralel. Tabelul 4.3 si figura 4.2 contin datele obtinute la etalonarea solutiei de BSA prin metoda Lowry.

Reactia de culoare

Se pipeteaza în ordine:

0,1 mL proba (solutie enzimatica);

0,1 mL apa distilata;

5 mL sol A+B;

0,5 mL reactiv Folin-Ciocâlteu (1:2).

Se realizeaza un martor, înlocuind solutia enzimatica cu apa distilata. Se lasa 30 de minute la temperatura camerei si se citeste extinctia la 660 nm fata de martor.

Tabel 4.3.

Curba de etalonare a solutiei de BSA prin metoda Lowry

Figura 4.2. Etalonarea solutiei de BSA prin metoda Lowry

E_med - E_martor = -0,021 + 2,23455 mg BSA

Calculul rezultatelor

Din curba etalon se determina mg proteina în functie de extinctia probelor. Continutul în proteine se determina cu formula:

p = c · f [mg proteina/mL]

4.1.4. Metoda generala de imobilizare a enzimelor în geluri de silice

Gelul de silice utilizat în imobilizari a fost obtinut prin tehnica sol-gel. S-au utilizat ca precursori doi tetraalcoxisilani, si anume tetraetoxisilanul (TEOS) si tetrametoxisilanul (TMOS). Tehnica sol-gel utilizeaza doua variante experimentale [Brinker, 1990

metoda într-o singura etapa: obtinerea solului si gelului în cataliza bazica;

metoda în doua etape: sinteza solului în cataliza acida, cu diversi catalizatori (HF, HCl, HNO_3­, H₂SO₄, NH₄OH) si sinteza gelului în cataliza bazica (NH₃).

În experimente s-a folosit tehnica sol-gel în doua etape. Deoarece amestecul tetraalcoxisilan -apa este nemiscibil, se utilizeaza un solvent organic, cel mai comun fiind etanolul. Au loc reactii de hidroliza si condensare a legaturilor Si-OR si Si-OH sau Si-OH si Si-OH sau Si-OR si Si-OR, cu formarea legaturilor Si-O-Si . În cataliz acida, aceste reactii au loc doar partial, obtinându-se solul. În cataliza bazica, reactiile decurg în continuare pâna se obtine un gel, cu o retea tridimensionala în care se poate realiza entraparea de diverse specii, inclusiv biologice:

hidroliza

Si-OR + H₂O  Si-OH + ROH

esterificare

condensare

Si-OR + HO-Si Si-O-Si + ROH 

alcooliza

condensare

Si-OH + HO-Si Si-O-Si + H₂O

hidroliza

Modul de lucru a fost urmatorul:

obtinerea solului în cataliza acida - se obtine un sol din tetraalcoxisilan în solutie apos-etanolica (1:1) prin hidroliza /condensare la pH 3,5-4 în prezenta de acid clorhidric 1N sub agitare magnetica.

obtinerea gelului cu enzima entrapata - entraparea s-a realizat într-un amestec care a continut solul obtinut anterior, care s-a diluat 1:3 cu solutie apos-alcoolica 1:1 si în care s-au adaugat o solutie de amoniac 25% 1:1 si apoi solutia enzimatica. Gelifierea s-a realizat în 1-5 minute. Gelurile s-au pastrat 24 de ore la temperatura camerei pentru maturare apoi au fost spalate sub agitare magnetica cu apa distilata, filtrate la vid, spalate pe filtru cu acetona si uscate la temperatura camerei. S-a obtinut prin mojarare o pulbere solida alb-galbuie denumita xerogel, care a fost analizata în ceea ce priveste activitatea ezimatica si continutul în proteine (conform 4.1.1, 4.1.2 si 4.1.3).

Imobilizarea proteazelor prin tehnica sol-gel

Conform literaturii de specialitate, cele mai utilizate microorganisme pentru obtinerea de proteaze sunt microorganismele de tipul bacteriilor si fungilor, iar dintre acestea microorganismele apartinând speciilor Bacillus si respectiv Aspergillus. Prin fermentatia microorganismelor se obtin amestecuri de enzime proteolitice care difera între ele atât în ceea ce priveste pH-ul optim cât si specificitatea de actiune. Din acest motiv, pentru fiecare microorganism în parte se specifica tipul de proteaze produs cu preponderenta. Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus sunt amestecuri de proteaze alcaline (proteaze serinice EC 3.4.21) si proteaze neutre (metaloproteaze EC 3.4.24) [Jurcoane, 2000]

Pentru obtinerea unor preparate enzimatice imobilizate cât mai usor accesibile si ieftine s-au cautat surse locale de proteaze si în acest scop au fost testate o serie de tulpini microbiene de Bacillus licheniformis (tabel 4.4). S-a determinat activitatea proteolitica a acestor preparate folosind metoda Anson pe substrat de cazeina, iar continutul în proteine s-a determinat prin metoda Lowry (conform 4.1.1 si 4.1.3).

Tabelul 4.4.

Testarea unor tulpini de Bacillus licheniformis producatoare de proteaze

Se observa ca dintre toate tulpinile bacteriene testate activitate proteolitica cea mai buna s-a obtinut în cazul tulpinii de Bacillus licheniformis CMIT 1.33 si de aceea ea a fost utilizata în studiile de imobilizare ulterioare.

Dinamica activitatii proteolitice si continutul în proteine determinate în timpul fermentatiei culturii de Bacillus licheniformis CMIT 1.33 este redata în tabelul 4.5 Activitatea proteolitica cea mai mare se obtine între 56 si 64 ore de cultura.

Preparatul enzimatic utilizat în imobilizare (tabel 4.4), precum si cele din testarile pentru alegerea tulpinii producatoare s-au obtinut prin fermentatie în mediu submers discontinuu, fermentatia realizându-se în flacoane agitate si aerate, la 37șC, timp de 72 de ore. Mediul de cultura a continut ca sursa de energie, carbon si azot, srot de soia si faina de porumb, saruri ca surse de fosfor si oligoelemente (sulfat de magneziu si fosfat dipotasic).

Tabelul 4.5.

Dinamica producerii de proteaze si proteine în fermentatia de

Bacillus licheniformis CMIT 1.33

Proteazele obtinute prin fermentatia celulelor de Bacillus licheniformis CMIT 1.33 (activitate proteolitica 0,62 U/mL, continut în proteine 3,88 mg_BSA/mL) au fost entrapate direct, fara separare prealabila, în gel de silice prin tehnica sol - gel în doua etape, conform schemei generale de lucru prezentate (cap. 4.1.4). Gelul obtinut se pastreaza 24 de ore la temperatura camerei pentru maturare, se usuca, se spala pentru îndepartarea enzimei legate fizic si neentrapate în reteaua tridimensionala a gelului, se filtreaza la vid si se usuca la temperatura camerei pâna la greutate constanta. Se determina continutul în proteine si activitatea proteolitica în solidele uscate. Rezultatele obtinute sunt prezentate în tabelul 4.6 si figura 4.3.

Tabelul 4.6.

Continutul în proteina si activitatea proteolitica a preparatelor enzimatice imobilizate

^aRandamentul de imobilizare = A_f·100/A_i, unde A_i este activitatea totala initiala iar A_f este activitatea totala din solidele uscate.

Preparatul enzimatic entrapat in gel de silice obtinut folosind ca precursor TEOS se obtine cu un randament de imobilizare 7,4%, si prezinta o activitate proteolitica de 0.31 μmol·min^-1·g^-1. Activitatea proteolitica a preparatului enzimatic entrapat in matricea obtinuta din precursorul TMOS este mai mica, fiind de 0.27 μmol·min^-1·g^-1, dar randamentul de imobilizare este de 2.3 ori mai mare. Aceasta activitate enzimatica mai mica, probabil se datoreaza lungimii mai reduse a lantului alchil din TMOS, care duce la obtinerea unui gel cu porozitati reduse si care limiteaza difuzia substratului la centrul activ al enzimei.

Figura 4.3. Activitatea proteolitica a preparatelor enzimatice imobilizate

S-a observat ca reteaua tridimensionala a gelului are un efect constrictor asupra moleculei de enzim , mai ales în faza de uscare a gelului. Utilizarea unor molecule organice în procesul de formare al gelului si care pot influenta dimensiunile porilor care iau nastere reprezinta o cale de marire a activitatii enzimelor imobilizate [Wei, 2000]. În astfel de silicageluri mezo sau macroporoase, difuzia moleculelor de substrat este mult usurata, ceea ce explica cresterea activitatii enzimatice. O astfel de substanta este D-glucoza si ea a fost utilizata în concentratie de 0.04 g_D-glucoz /mL_sol.

Rezultatele arata ca toate preparatele enzimatice obtinute în prezenta agentului formator de pori prezinta o activitate marita de 2.6 pânǎ la 4 ori. Cele mai bune rezultate s-au obtinut de asemenea în cazul utilizarii TEOS precursor.

Entraparea în matrici polimere are un dezavantaj inerent si anume problema limitarilor difuzionale impuse de reteaua tridimensionala. Pentru a reduce acest dezavantaj, am încercat o metoda combinata de imobilizare, entraparea enzimei în gel de silice urmata de depunerea acestuia într-un strat relativ subtire, pe un suport anorganic. Ca suport anorganic de depunere a fost utilizata o ceramica autohtona.

Se observǎ cǎ în cazul în care se porneste de la precursorul TEOS se obtin activitǎti proteolitice de 1.5 ori mai mari decât în cazul entrapǎrii în absenta glucozei, la cantitǎti de enzimǎ similare. Tetrametoxisilanul (TMOS), dupa entrapare-depunere a dus la obtinerea unor preparate enzimatice cu activitate proteolitica si randamente de imobilizare inferioare celor rezultate dupa entrapare în absenta glucozei.

Imobilizarea amilazelor prin tehnica sol-gel

Respectând metoda generala de imobilizare a fost entrapat în gel de silice si preparatul enzimatic cu activitate amilazica obtinut din fermentatia, în mediu submers, a celulelor de Bacillus globigi. Pentru biosinteza amilazelor s-a folosit un mediu compus din srot soia 3,5g, faina de porumb 2,5g, CaCl₂ 0,1g. Dupa inocularea a câte 50 ml din mediile de cultura de mai sus cu celule Bacillus, flacoanele au fost incubate pe un agitator timp de 72 de ore. Selectia preparatului enzimatic cu activitate amilazica utilizat în imobilizare s-a realizat în urma testari tulpinilor microbiene din specia Bacillus aflate în colectia Laboratorului de Microbiologie (tabelul 4.7).

Tabelul 4.7.

Testarea unor tulpini de Bacillus producatoare de amilaze

Preparatul enzimatic de Bacillus globigi cu activitate amilazica de 2.36 U/mL si continut în proteine de 2.45 mg_BSA/mL a fost entrapat în gel de silice utilizând, precursorii TEOS si TMOS, prin metoda sol-gel în doua etape (tabelul 4.8).

Tabelul 4.8.

Continutul în proteina si activitatea amilazica a preparatului enzimatic imobilizat

^aRandamentul de imobilizare = A_f·100/A_i, unde A_i este activitatea totala initiala iar A_f este activitatea totala din solidele uscate.

Ca si în cazul entraparii preparatului cu activitate proteolitica, cele mai bune rezultate se obtin la utilizarea precursorului TEOS. Activitatea amilazica a preparatelor entrapate în matericea de silice obtinuta din precursorii TEOS si TMOS a fost de 1,63 μmol·min^-1·g^-1 si respectiv 1,56 μmol·min^-1·g^-1, iar randamentele de imobilizare de 31,63%, respectiv de 29,22%.