AMPRENTA GENETICA IN PRACTICA MEDICO-LEGALA

AMPRENTA GENETICA ÎN PRACTICA MEDICO-LEGALA

Istoria justitiei este presarata de descoperiri stiintifice care constituie tot atâtia pasi n sensul unor probe dorite a fi de nerespins, indiferent de obiectivele propuse. Cercetarea stiintifica este strabatuta de dezbateri, marcate rareori de crize privind raporturile dintre stiinta si om, ntre cercetarea constanta si legitima asupra securitatii necesare exercitiului libertatii si riscul per­manent de a submina aceste libertati.

Ca si amprentele digitale la nceputul secolului si amprenta genetica, apare azi ca aduc nd un aport crucial n serviciul politiei, justitiei si adevarului. Dar mai mult dec t amprentele digitale, amprentele genetice sunt n centrul conflictelor dintre nevoile noastre fundamentale.

n 1944 Oswald Avery a stabilit rolul componentei celulare cunoscute sub denumirea DNA (dezoxiribonucleic acid) - ADN (acidul dezoxiribonucleic) - n rom na ca vehicolul transmiterii caracterelor ereditare. n 1953 James Watson si Francis Crick au elucidat structura moleculei de ADN sub forma dublei spirale.

n stiinta, ca si n arta, forma urmeaza functiei, ntruc t adevarata explicatie a proprietatilor sale unice, presupune capaci­tatea de a se transmite cu exactitate din generatie n generatie. n 1980 David Botstein si colaboratorii au fost primii care au exploatat micile variatii gasite ntre oameni la nivel genetic, ca repere pentru constructia unei harte a genomului uman. Tipul par­ticular al variatiei, pe care ei au utilizat-o, a fost denumita "Restriction Fragment Lenghth Polymorphism" (RFLP- polimorfismul de talie).

n 1984, n timp ce studia markerii bolilor n ADN, Alee Jeffreys a descoperit unica aplicabilitate a tehnologiei RFLP n iden­tificarea persoanei. Metoda sa, denumita amprenta ADN", a fost modificata si adoptata de catre laboratoarele politiei criminale si generalizata astazi n lume. Oamenii de stiinta accepta azi ca fiind mai descriptiv si mai complet termenul de profil ADN sau profilul ADN. n 1986 termenul de "polymerase chain reactin" (PCR - reactia polimerazica inplant) a fost inventat de Kary Mullis care a si primit o parte a premiului Nobel n chimie pentru descoperirea sa. PCR, mai mult dec t orice alt progres stiintific, n afara poate de elucidarea structurii ADN a schimbat fata biologiei moleculare. Astfel tehnologia RFLP si PCR mpreuna formeaza piatra de temelie a profilului ADN.

Trebuie de notat faptul ca analiza ADN, n general are o mult mai larga arie de utilizare si un mai lung istoric, dec t exacta identificare a probelor provenind de la locul faptei. Asa cum s-a mentionat mai sus, o aplicatie initiala si continua este cercetarea genelor implicate n boli. n mare parte, gratie eforturilor depuse n proiectul deslusirii genomului uman, toate informatiile continute n codul genetic uman au nceput si continua a fi descifrate si catalogate. Astfel se ajunge la identificarea genelor impli­cate n boli ca cea a lui Huntington, a fibrozei chistice, distrofiilor musculare si variatele influente genetice n cancer. O aplicatie specifica consta n monitorizarea transplantului de maduva osoasa la bolnavii de leucemie. Aceste aplicabilitati ale profilului ADN sunt mai rapide si mai putin nclinate spre eroare, ca orice alta metoda de tipare a s ngelui. C nd s ngele bolnavului corespunde caracterului de histocompatibilitate ale donorilor, transplantul este posibil. Mai mult pentru stabilirea diagnosticului si a medicatiei se folosesc probe clinice de nlocuire a generior n unele din aceste boli.

Cercetarea filiatiei este printre primele domenii n care profilul ADN a fost folosita. Cercetarea paternitatii, care se rezolva p na acum numai prin expertiza serologica ncepe a se ndrepta catre testul ADN.

Resturile biologice spre exemplu pot, de asemenea, fi identificate prin profilul ADN, si put nd fi uneori folosite si dupa moarte n determinarea probabilitatii sau a unei str nse relatii genetice cu cei n viata. Copiii abandonati ar putea reveni la adevaratii parinti aplic nd testul ADN. Tot prin acest test, laboratoarele de identifeiare ale fortelor armate americane au identificat resturile umane a 15 veterani ai razboiului din Vietnam la cei 20 ani dupa moartea acestora.

Afost initiat recent un program de rutina pentru colectarea de probe de la toti membrii fortelor armate americane. Resturi din corpul uman pot folosi la identificare n cazul catastrofelor de tot felul, cum ar fi cazul de la Balotesti.

Exemplele de identificare prin testul ADN ncep sa fie din ce n ce mai numeroase n cazuri foarte complicate, ramase fara raspuns p na acum. Unul din cazurile cele mai des citate de aplicare a testului ADN este cel prin care n Marea Britanie a fost identificat Colin Pitchfork ca responsabil pentru moartea a doua fete, dupa ce initial, pe baza aceluiasi test, a fost acuzat un inocent. Noutatea acestui caz consta n faptul ca fiecare barbat ntre 13 si 34 ani (aproape 4000) domiciliati n trei sate apropi­ate au fost chemati sa dea spre analiza probe de s nge, ceea ce a dus la descoperirea adevaratului autor.

n Statele Unite at t FBI c t si companii private acreditate, utilizeaza testul ADN n medicina judiciara. Astfel, de la introducerea testului n anul 1986 n SUAel a fost folosit n peste 24.000 de cazuri. Este de remarcat ca mai mult de 1/3 din suspectii de viol au fost eliberati, fiind exclusi prin testul ADN. Excluderea unui suspect prin testul ADN este absoluta, nefiind n nici un caz vorba de o probabilitate statistica n SUA se continua aplicarea testului la cei acuzati pe baza unor probe incerte, iar rezultatele obtinute nu au putut fi contestate din punct de vedere stiintific.

Asadar, testul ADN permite astazi de a se gasi semnatura crimei n codul genetic al autorului.

Privit ntr-o maniera generala, aplicabilitatea testului ADN se refera la 4 domenii importante:

1. Identificarea suspectilor;

2. Descoperirea crimelor sau delictelor;

3. Cercetarea paternitatii;

4. Idenficiarea victimelor catastrofelor.

Este important de subliniat ca utilizarea ADN n practica judiciara desi constituie un element probant al anchetei, nu trebuie sa i se substituie ci s-o ntareasca. Introducerea acestei probe, necesita neaparat o modificare a practicii anchetatorilor pe teren, cum ar fi tehnicile de prelevare a probelor, absenta ideilor preconcepute, etc, ceea ce de fapt semnifica o noua organizare a anchetei.

Merita subliniat nsa faptul ca n numeroase tari acest mare progres al stiintei nu este nsotit de clarificari pe plan juridic; unul dintre pericole ar fi practicarea testului fara stirea persoanei. Astfel se pune problema consimtam ntului n virtutea principiului inviolabilitatii persoanei, aspect nereglementat nca legal. Apoi, o data prelevate, ce devin esantioanele? Cum sa te pui la ada­post de o utilizare necontrolata? lata tot at tea probleme care-si asteapta nca un raspuns.

Aplicatiile stiintei n arena justitiei este fundamental una de reconstructie adica ncercarea de a ajuta n a se stabili ce s-a nt mplat, c nd s-a nt mplat, unde s-a nt mplat si cine este implicat Cit ndu-I pe Conan Doyle care spunea "c nd nicio­data nu ai exclus imposibilul, ram ne ceva care desi improbabil, poate fi adevarat", ntelegem de ce atunci c nd stiinta este apli­cata n acest domeniu este obligatoriu implicata medicina legala, chemata astfel sa ajute justitia n stabilirea at t n penal, c t si n civil a unor elemente concrete biofizice. Legea defineste elementele infractiunii; stiinta contribuie prin informatii n a determi­na daca un element exista sau nu.

n medicina judiciara si criminalistica exista doua principale concepte prin care se fac asocierile dintre probleme: acestea sunt cunoscute sub denumirile de "identificare" si "individualizare".

Un subiect este identificat atunci c nd el poate fi distins dintr-un grup de subiecti av nd caracteristici similare. Un subiect nsa poate fi individualizat numai atunci c nd descrierea lui difera de orice alt subiect existent n lume. Individualizarea rezida deci n cunoasterea unor caractere foarte rare si care, binecunoscute si controlate prin studii populationale, permit diferentierea de alti subiecti cu caractere similare.

stiinta medico-legala si criminalistica au clasificat un numar de probleme cu care s-au confruntat n mod obisnuit n investi­gatiile criminale si a dezvolt nd teste bazate pe acele caracteristici care s-au dovedit utile n identificare, precum si probleme care apartin unei anumite categorii de situatii. Spre exemplu, parul este n mod obisnuit gasit n cazul unor crime si acte de vio­lenta. Analistii au gasit ca examin nd anumite caracteristici microscopice, l vom putea identifica fie drept par fie ca o fibra oare­care, caractere care de asemenea pot servi n a-l plasa n categoria parului uman si nu animal.

Un element cheie ce trebuie luat n seama atunci c nd determinam daca o caracteristica apartine unei categorii sau este o caracteristica individuala, este originea acelei caracteristici. Acele caracteristici descrise n cadrul unui proces controlat devin caracteristicile unei categorii. Exemplul include specificitatea ghinturilor unei arme, caracteristicile urmei unui obiect de ncaltaminte, cocaina din planta, sau grupa sanguina a unei persoane. Primele doua exemple rezulta din procesul repetitiv al fabricarii, n timp ce urmatoarele doua exemple sunt produse biologice sub control genetic. Asadar, c nd obiecte sau substante sunt produsul unui proces repetitiv supus controlului, rezulta caracteristicile unei anumite categorii. Caracteristicile uneianumite categorii pot sa cuprinda milioane de subiecte identice sau numai doua

Trasaturile individuale sunt cele create de procese nt mplatoare si prin aceasta neprevizibile si necontrolabile. Amprentele digitale sunt rezultatul unui proces nt mplator ce are loc ntr-un anumit moment al gestatiei. Datorita numarului diferitelor com­binatii posibile de trasaturi sau combinatii spatiale ale degetului, se accepta ca nu exista doua amprente digitale identice.

Valoarea unei metode de identificare rezida n abilitatea expertului de a compara urmele lasate la locul faptei cu cele gasite pe alte materiale. Daca urmele sunt gasite similare, atunci sunt individualizate caracteristicile net diferite dintre cele doua urme.

Referindu-ne la amprentele digitale este de notat ca ntruc t toata lumea s-a obisnuit cu ideea ca ele reprezinta caracter­istici individuale s-a extrapolat aceasta notiune si la ADN cu toate ca n fond denumirea este inadecvata. Metoda amprentei genetice dezvoltata de Alee Jeffreys examineaza mai multe locusuri ale ADN dintr-un genom o singura data; rezultatul a fost modele de benzi a caror complexitate a sugerat amprenta digitala si ea este probabil specifica si unica pentru fiecare individ. Din cauza complexitatii sistemului totusi s-a decis ca examinarea, unui singur profil genetic sa permita obtinerea unui rezultat mai usor de nteles si arata mai bine printr-o apreciere numerica semnificatia modelelor genetice similare. Aceasta metoda numita profilul ADN este de asemenea mai adecvata examinarii unor probe amestecate, si de atunci un numar de 1-2 benzi obtinute de la o persoana devin concludente.

ADN-ul poate fi izolat gratie tehnicilor chimice simple. Aceasta etapa poate deveni foarte delicata n criminalistica datorita calitatii probelor prelevate, conservarii acestora si suportului pe care ele se gasesc.

ADN poate fi extras n cadrul unei spete judiciare fie din:

- s nge prelevat pe anticoagulant;

- urme de s nge gasite la locul faptei;

- celule epiteliale (bucale, vaginale) sau sperma prelevate pe tampon sau din pete;

- celule ale radacinii parului sau chiar din par;

- celule osoase;

- celule ale pulpei dentare.

S-a stabilit cu exactitate cantitatea de ADN continuta n fiecare prelevat. De asemenea, se stie astazi ca sunt necesare apro­ximativ 100 celule pentru a putea realiza o amprenta genetica

n cazul parului fara bulb sau a oaselor vechi este preferabil sa fie studiat ADN-ul mitocondrial, caci el exista ntr-un mai mare numar de copii dar el este exclusiv de origine materna

Valoarea prelevarilor de la locul faptei pentru cercetarea ADN depinde de pregatirea expertilor, tin nd seama ca

- orice proba prelevata poate fi pierduta

- orice proba defectuos prelevata poate fi contaminata

Evident ca principala limita a analizei ADN este absenta prelevarilor. Prin urmare, n toate tarile se insista asupra unei pregatiri adecvate a personalului nsarcinat cu prelevarea probelor de la locul faptei n vederea analizei ADN si n multe tari unor astfel de specialisti li se elibereaza chiar o diploma dupa un examen de specialitate.

Este de notat ca aceasta formare profesionala trebuie sa fie continuata, dat fiind evolutia rapida a metodelor de prelevare corespunzatoare diferitelor probe. Precautiile ce se iau sunt extrem de stricte. Astfel, scena crimei este nconjurata de un cor­don prin care nu se poate trece. n acest perimetru nu patrunde dec t personalul specializat si câtiva reprezentanti ai aparatu­lui de justitie av nd haine de protectie si nsotiti de persoane calificate. Criminalistii, ei nsisi, vor avea haine de protectie speciale, caschete, manusi si masca, (manusile se schimba dupa fiecare proba prelevata). Aceste masuri se nscriu pe linia grijii perma­nente de a nu polua zona contaminata inclusiv necontaminarea virala

Atunci c nd tehnicianul expert ajunge la locul faptei, nu trebuie sa aiba idei preconcepute, sa fie ermetic oricarui comentariu, sa preleveze nediscriminatoriu sau prioritar orice urma din zona sau de pe persoanele care sunt sau au trecut prin zona, sa observe at t urmele vizibile c t si cele invizibile, sa nu accepte dupa aparente originea urmelor (spre exemplu o pata rosie nu trebuie neaparat catalogata drept s nge etc). Cercetarea locului faptei reclama multe ore de lucru.

Conservarea probelor prelevate este de asemenea esentiala. Urmele biologice vor trebui uscate, plasate n pungi speciale si conservate la rece. Aducerea probelor la laborator trebuie realizata n minimum de timp.

Se poate afirma ca succesul si calitatea unor analize biologice depinde de calitatea probelor prelevate, lucru binecunoscut n medicina legala. Referindu-ne la molecula de ADN trebuie spus ca ea este foarte stabila, rezist nd spre exemplu la tempera­turi extreme. Pentru a denatura molecula de ADN n dublu helix, adica a sparge legatura dintre bazele purinice si pnmidinice este necesara mentinerea la 100 grade celsius in vitro mai multe minute. Daca este lasata sa se raceasca lent cele doua lanturi com­plementare se re mperecheaza. Invers, ea rezista la temperaturi foarte joase. Este posibil sa fie extras ADN din insecte ncas­trate n chihlimbar, din mumii dar n general probele biologice obtinute de la locul crimei nu scapa de degradarea bacteriana, de actiunea razelor ultraviolete sau a anumitor substante chimice.

Este deci important ca anchetatorii, magistratii sau medicii legisti sa fie informati cu privire la masurile de precautie ce trebuie avute n vedere la locul infractiunilor. Spre exemplu, o pata de sperma pe un suport textil uscat si la adapost de lumina va putea furniza un profil genetic timp de c teva luni si chiar mai mult, n timp ce un prelevat vaginal pe tampon va trebui imediat refrigerat pentru a se evita degradarea rapida datorita prezentei florei miprobiene. S ngele va fi prelevat pe anticoagulant (EDTA) care va nt rzia degradarea enzimatica. Celulele bucale si parul vor fi congelate.

Trebuie de notat totusi ca tehnicile de analiza a ADN-ului au devenit astazi de o asemenea sensibilitate, nc t este necesara evitarea oricarei contaminari de catre un ADN uman strain. n cele ce umeaza vom prezenta o sinteza a tehnicilor folosite n cercetarea amprentei genetice n folosul justitiei.

1. GENERALIT I

Doar o mica parte din genom are continut informational (cunoscut) si deci codifica caractere ereditare, zone de ADN infor­mational altern nd cu zone non-informationale. Segmentele de ADN informational, care codifica o proteina specifica au "atasate" segmente non-informationale (minisatelit ADN). n aceste segmente non-informationale se pot detecta multiple variatii individuale (fenomen numit polimorfism), variabilitatea fiind mai accentuata n anumite arii genomice, zone ce sunt denumite arii polimorfe.

Polimorfismele genetice nt lnite n zonele non-informationale pot fi de mai multe tipuri:

- Polimorfism* de secventa (mutatii punctiforme); sunt determinate de nlocuirea unei singure baze azotate, lungimea seg­mentului corespunzator de ADN ram n nd nemodificata. Identificarea polimorfismelor de secventa se efectueaza mai ales n locusul HLA DQ, folosindu-se sonde oligonucleotidice specifice pentru anumite alele, (exista patru variante majore: DQ1, DQ2, DQ3 si DQ4. Alelele DQ 1 si 4 au fiecare c teva variante: DQ1.1, DQ1.2, DQ1.3, DQ4.1, DQ4.2, DQ4.3).

- Pollmorfisme de lungime, care rezulta din insertia sau deletia a unei sau mai multor nucleotide care determina diferente de lungime a secventelor de ADN-non informational (RFLP).

- Polimorfisme de redundanta

n zonele genomice hipervariabile nt lnim blocuri alcatuite din fragmente de ADN-non informational, care se repeta identic, de un numar variabil de ori (4-40 repetitii), unul dupa altui. Acest bloc de repetitii tandemice ale unei secvente ADN ("core" sequence) formate din 11-60 perechi baze (pb), sunt numite VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - Numar Variabil de

Tandemuri Repetate).

Exista o mare diversitate a VNTR at t din punct de vedere al structurii de baza c t si al numarului de repetari tandemice. Exista anumite VNTR cu o anumita structura care sunt distribuite n tot genomul ( n aceeasi structura de baza, variind doar numarul de repetitii tandemice). Exista unele VNTR, care au o secventa unica, care se regasesc numai ntr-un singur loc pe o singura pereche de cromozomi. n cazul acestora, pentru acelasi locus de pe un cromozom exista un locus corespunzator pe cromozomul omolog, blocurile VNTR fiind mostenite independent, transmise dupa legile Mendeliene, astfel nc t pe o pereche de cromozomi omologi VNTR-ul provenit de la mama este diferit de VNTR-ul provenit de la tata, ceea ce permite nu numai iden­tificarea individului dar si a parintilor sai (cele doua zone au identica secventa centrala si difera prin numarul de repetitii ale aces­teia).

Rezulta ca at t compozitia secventei de baza c t si numarul de repetitii n cadrul VNTR dintr-un anumit locus genetic sunt comune tuturor celulelor unui individ, dar compozitia si numarul de repetari tandemice difera foarte mult ntre locusuri hipervari­abile VNTR situate pe cromozomi diferiti sau chiar n locusuri din cadrul aceluiasi cromozom, la acelasi individ.

Nu se cunoaste precis rolul acestor secvente repetitive, dar se banuieste ca ar servi ca semnal recombinant n cadrul geno-mului uman.

Dupa compozitia lor VNTR-urile pot forma familii bogate chimic n guanina, cum sunt marea majoritate a celor descoperite p na acum (astazi se cunosc circa 90 locusuri hipervariabile precum cel din compozitia insulinei, mioglobinei, -globinei, etc.j, sau bogate n adenina-timina (colagen tip III, apolipoproteina B, etc).

Tehnica profilului ADN (DNA profiling), profilul-tiparea- ADN (DNA typing) sau amprenta ADN (DNA fingerprinting) cum este popular cunoscuta îsi propune analiza a mai multor locusuri hipervariabile din genomul uman pentru a obtine o "amprenta" unica (sau aproape unica) pentru fiecare individ.

Pentru identificarea acestor regiuni hipervariabile se folosesc sonde ADN izotopice sau neizotopice: sonda multi-locus (Jeffreys, 1985) care cauta repetitiile tandemice ale unei secvente centrale prezente n mai multe locusuri diferite pe maimulti cromozomi diferiti si sondele mono-locus, care cauta repetitiile tandemice ale unei secvente unice precise care se gaseste numai ntr-un singur locus, n cadrul unei singure perechi de cromozomi omologi.

n investigatia judiciara si medico-legala este utilizata astazi cu prioritate sonda mono-locus (acreditata de Lifecodes Corporation si implicit de FBI), datorita numeroaselor avantaje pe care aceasta tehnica le prezinta, dintre care rapiditatea (automatizare) si usurinta tehnicii sunt cele mai importante.

2. ETAPE ISTORICE N CERCETAREA ADN-ULUI sl A APLICA IILOR SALE MEDICO-LEGALE

-1869 Miescher descopera ADN (premiul Nobel n 1900);

-1944 Avery: ADN-ul poarta informatia genetica

-1953 Watson-Crick descopera structura ADN (premiul Nobel)

-1957 Kornberg: ADN polimerazele;

-1961 Manum & Doty: renaturarea ADN;

- 1962Arber: nucleazeleADN;

-1962 Nathans & Smith: secventionarea ADN;

-1966 Nirenberg, Ochoa, Khorona: codul genetic;

-1967 Gellert: ligazeleADN;

-1970 Enzimele de restrictie

-1972-1973 Boyer, Cohen, Berg: donarea ADN;

-1975 Southern: hibridizarea;

-1975-1977 S nger & Bonell si Maxam & Gilbert: secventializarea rapida a ADN;

-1980 Locusurile hipervariabile (VNTR);

-1980TehologiaRFLP;

-1985 Jeffreys: descopera posibilitatea utilizarii VNTR n identificare;

-1985 Mullis: tehnica PCR;

-1986 primul caz juridic rezolvat prin tehnica profilului ADN si acceptat n instanta n Anglia;

-1987 primul caz juridic rezolvat prin tehnica profilului ADN si acceptat n instanta n SUA.

ETAPE DE LABORATOR sl METODOLOGIA DETERMIN RII PROFILULUI ADN

Tehnologia profilului-tiparii ADN este deosebit de complexa. Ea necesita un laborator performant at t la nivelul echipamen-tului, c t si al calitatii personalului si se efectueaza dupa un protocol standardizat de desfasurare.

3.1. Materialul biologic necesar

Biochimistii si geneticienii au posibilitatea sa foloseasca ADN intact obtinut din produse biologice umane proaspete (frecvent s nge, dar si ficat). n medicina legala acest lucru nu este dec t rareori posibil (filiatie si unele delicte), cel mai adesea materi­alul de lucru fiind reprezentat de produse biologice umane uscate, aflate uneori n stare avansata de putrefactie, frecvent con­taminate cu bacteriisau praf si nu n ultimul r nd n cantitae mica

Pe de alta parte, este demonstrat ca ADN-ul, spre deosebire de majoritatea antigenelor de grup sanguin folosite n identifi­carea serologica, se poate conserva si dupa mai multi ani dupa deces.

3.2. Extractia si purificarea ADN

Se realizeaza prin incubarea probei ntr-o solutie care contine:

- detergent: Sodiumdodecilsulfat - SDS (determina liza nucleilor) +;

- proteinaza K (digestia proteinelor fixate pe ADN) +;

- dithiotreitol - DTT (reducerea gruparilor thiol si a celor sulfurice).

3.3. Clivarea dublului helix al ADN n fragmente

Se realizeaza folosind nuclee de restrictie care actioneaza precum un foarfece molecular, taind ADN-ul la nivelul unor secvente specifice de baze azotate (puncte fixe); ex.: Pst.1 folosita de Lifecodes Corporation este conceputa sa taie ADN ori de c te ori nt lnesc secventa CTGCAG n cuprinsul ntregului dublu helix.

Nucleazele de restrictie sunt fie naturale (produse de bacterii pentru a distruge ADN-ul vital, ex. Hinfl, Alu I, Hae III, Sau III), fie sintetice. De obicei sunt folosite nucleaze de restrictie naturale care recunosc o secventa de patru baze; daca bazele sunt dispuse nt mplator atunci aceste enzime vor taia mereu la 4/4 bp = 256 pb; aceste enzime fiind bacteriene nu au situsuri de di­va re pentru VNTR-ul uman, nc t nucleaza va taia mereu numai de o parte si de alta a ministelitului, dar cu c t mai aproape cu at t mai specific.

Rezulta astfel milioane de fragmente de marimi diferite Fragmente de restrictie cu lungime polimorfa, RFLP (restrictiona frag­ment lenght polymorphisms).

O singura pereche de baze, diferita ntr-o anumita pozitie pe un anume cromozom poate elimina locusul de clivare al nucle-azei de restrictie si sa determine mari diferente n lungimea fragmentelor de restrictie ce rezulta din fragmentarea ADN-ului n cauza la pozitia respectiva

Este esential de nteles ca un VNTR este mai mic dec t un RFLP, iar un RFLP nu e obligatoriu sa contina un VNTR (poate contine insertii, deletii etc, deci nu neaparat repetitii tandemice).

3.4. Desfacerea ADN

Consta n desfacerea dublului helix n doua catene separate, prin tratare la peste 100 grade si n pH de minim 13.

3.5. Separarea fragmentelor

Fragmentele de ADN care au fost taiate pentru a forma RFLPs sunt separate prin electroforeza pulsata (schimbarea peri­odica a polaritatii electrice) n gel de agaroza (polizaharid izolat din plancton). Cu c t fragmentul este mai lung, cu at t migrarea sa este mai greoaie. Toate moleculele ADN poarta ncarcatura negativa si deci vor migra catre polul pozitiv, form ndu-se, n final, un pattern caracteristic. Sensibilitatea procedeului este fparte mare, ceea ce permite separarea fragmentelor de ADN chiar daca difera doar printr-un singur nucleotid.

3.6. Southern Blotting

Aceasta etapa consta n transferul fragmentelor de ADN pe h rtie de nitroceluloza sau pe o membrana de nylon.

Hibridizare (renaturare)

Se aplica sonda ADN (DNA probe) pe membrana de nylon sau de nitroceluloza si se incubeaza mai mult timp la temperatu­ra de 65 C. Sonda consta ntr-un segment de ADN recombinant (ADNc), reprezentat dintr-un fragment de ADN monolant sin­tetic (format din 15 mii nucleotizi), marcat radioactiv (32/P, care prin emiterea de radiatii permite autoradiografia), astfel sintetizat nc t prin complementaritate sa se fixeze (hidridizare) pe un fragment ADN monolant din proba cercetata

Aplicarea n continuare de nucleaze ce distrug tot ADN-ul nehibridizat va duce la obtinerea unor regiuni ADN hibridizate pure.

Lifecodes Corporation foloseste 4 tipuri de sonde ADN: D2S44, D14S1, D17S79 si DXYS14. "D" nseamna ADN, "2,14, XY, etc." defineste cromozomul ce va fi tintit, "S" numarul de aplicatie cu care sonda se fixeaza pe aria cu polimorfism (VNTR-ul tinta

Exista doua tipuri de tehnologie de profil tipare- ADN:

- primul tip de tehnologie foloseste sonde ADN multi-locus (multi-locus probe) ce contin sonde pentru identificarea unui VNTR prezent n multiple locuri din genom. ntruc t secventele repetitive sunt prezente n numar diferit la diferitii indivizi, nucleazele de restrictie vor taia fragmente de lungimi diferite si sonda ADN multi-locus recunosc nd toate benzile derivate din aceste locusuri va produce un pattern ADN caracteristic.

- al doilea tip de tehnologie foloseste sonde ADN mono-locus (mono-locus ADN-probe) care identifica secventa centrala a unui minisatelit VNTR unica (gasita doar ntr-un locus anume, pe o singura pereche de cromozomi omologi), si a devenit dupa cum prezentam la nceput tipul de sonda cu cea mai mare aplicabilitate n practica medico-legala

n mod aparent, rezultatele obtinute prin aceasta metoda sunt mult mai simple dec t n cazul sondelor multi-locus. Exista numeroase tipuri de sonde mono-locus sintetizate disponibile, corespunz nd zonelor hipervariabile identificate n genomul uman, nc t cercetarea amanuntita a acestora poate duce n final la rezultate la fel de valoroase ca n cazul celor multi-locus.

n general folosirea a trei sonde mono-locus este suficienta pentru a obtine o precizie similara folosirii unei sonde multi-locus.

Avantajele sondelor mono-locus sunt:

- timp mai scurt necesar analizei;

- utilizeaza cantitati mici de material biologic

- interpretare precisa, obiectiva, care permite formarea unei baze de date computerizate. Dezavantajele sondelor mono-locus:

- Excluderea unei persoane este certa, daca patternul suspectului si cel al probei sunt diferite, aici lucrurile sunt clare si rezul­tatul transant (pentru siguranta se considera ca daca exista doua diferente ntre pattern-uri avem o excludere). Daca nsa pat-tern-urile sunt asemanatoare, suspectul "poate fi vinovat"; aceasta afirmatie trebuie completata cu precizarea probabilitatii acestei posibilitati: "poate fi vinovat ... asa cum mai pot fi nca 100, 100.000 sau 1.000.000 de indivizi din populatia data". Calculele statistice sunt mai complexe ntruc t fiecare banda ADN are asociata o probabilitate diferita de aparitie n populatie.

3.8. Autoradiografie

Excesul de sonda ADN este spalat de pe membrana de nylon care apoi este plasata pe o bucata de film radiologie si expusa mai multe zile, apoi developat. Sondele multi-locus vor produce numeroase benzi ntunecate la nivelul unei coloane albe pentru fiecare individ corespunz nd la numeroase VNTR-uri cercetate pe numerosi cromozomi, n timp ce sondele mono-locus vor pro­duce una sau doua benzi ntunecate la nivelul unei coloane albe la fiecare individ corespunz nd unei singure secvente VNTR provenite depe un singur cromozom omolog (o banda de pe cromozomul matern si una de pe cromozomul patern).

3.9. Tehnica PCR (Plymeraze Chain Reaction)

A doua revolutie care a avut loc n biologia medico-legala a fost inventarea tehnicii PCR (1985). nainte de digestia ADN cu nuclaze de restrictie se efectueaza repicarea minisatelitilor VNTR cu ajutorul unor primeri (oligonucleotizi sintetizati pentru a se potrivi cu secventele centrale ale VNTR-urilor ce se doresc a fi amplificate) n prezenta AND-polimerazei, si n mediu suturat de mononucleotide.

PCR ofera astfel posibilitatea utilizarii unor cantitati foarte mici de material biologic: o singura celula si p singura molecula de ADN fiind suficiente (de asemenea poate detecta si ARN pe care dupa prealabila transcriere n ADN cu revers-transcriptaza l poate folosi pentru amplificare).

Avantajele tehnicii PCR cuplata cu sonde mono-locus:

- viteza mare de lucru: de obicei maxim 24 ore fata de circa o saptam na c t este necesar pentru un profil ADN complet prin celelalte tehnici;

- costul redus per/analiza

- posibilitatea automatizarii metodei;

- posibilitatea de colorare diferita a benzilor de origine materna de cele de origine paterna dintr-o pereche de benzi si usurinta identificarii fragmentelor caracteristice;

- permite analiza materialului biologic chiar atunci c nd este disponibil n cantitati extrem de mici si este foarte vechi: exem­plu oase de sute de ani vechime.

Dezavantaje

- posibilitatea foarte usoara a contaminarii probei biologice de origine necunoscuta prin material genetic strain de aceasta: celule exfoliate de la personalul de laborator, ofiterul de politie etc. (pentru aceasta se iau masuri speciale de securitate a pro­belor printre care n mod obligatoriu pastrarea separata a materialului biologic de la locul faptei cu materialul biologic recoltat de la suspect);

- costul mare al echipamentului: 80.000 lire sterline;

- necesita crearea unor noi baze de date: rezultatele obtinute nu sunt compatibile cu cele prin tehnicile clasice mono si multi-locus. Tehnici PCR de ultima ora sunt tehnica MVR-PCR (Minisatellite variant repeat maping) ce utilizeaza variatia secventiei monoloce ntre alelele locusului hipervariabil reprezentat de minisatelitul MS32 (locus D1S80), ceea ce ofera o nalta putere dis­criminatorie y21 si utilizarea sondelor ADN neizotopice prin tehnologia NICE (Non-lsothopic Chemiluminiscent Enhanced).

3.10. Interpretarea rezultatelor

Jeffreys a demonstrat o banda de distributie statistica de 0.25: astfel probabilitatea ca doi indivizi ne nruditi sa prezinte exact acelasi pattern ADN este de 0.25/36 = 2 x 10/-22.

Se remarca n fig. 2 variatia imensa ntre diferitii indivizi: n aceasta imagine caracteristica satelitilor multi-locus orice unica banda este gasita la 1 din 4 indivizi ne nruditi (25%), doua benzi n 1 din 4 x 4 = 16 indivizi, trei benzi n 1 din 4 x 4 x 4 = 64 indi­vizi, etc. ntruc t un profil ADN uzual contine 11 benzi, probabilitatea ca doi indivizi ne nruditi sa aiba acelasi profil ADN este de 1 la 2,5 milioane indivizi.

Dupa cum a mai fost aratat, nu este ntotdeauna posibil ca profilul ADN sa determine rezultate definitive n medicina legala: uneori materialul care se afla la dispozitia medicului legist duce la obtinerea doar a c torva benzi (posibil si acelea incomplete referitor la compozitia completa a unei secvente VNTR) prin lipsa materialului sau distrugerea n timp a acestuia. n mod uzual, n aceste cazuri bazate pe material biologic alterat sau vechi se poate dispune de 3-4 benzi: pentru 4 benzi probabilitatea ca profilul sa se potriveasca la 2 indivizi ne nruditi este de 1 la 200. n cadrul interpretarii nsa trebuie avut ntotdeauna n consid­eratie cazul n speta si particularitatile sale; de exemplu, o probabilitate ca cea de mai sus poate fi suficienta pentru admisibili­tatea probei n instanta n cazul n care colectivitatea posibila din care face parte criminalul numara mai putin de 200 indivizi!

Din acest punct de vedere, denumirea populara de "amprenta ADN" care implicit presupune unicitate nu este ntotdeauna conforma cu realitatea n cazul medicinii legale, motiv pentru care medicii legisti prefera denumirea de profil ADN (ADN profil-ing). n filiatie, acolo unde materialul ADN este ntotdeauna proaspat, denumirea de amprenta ADN este mai potrivita

O alta problema este desigur compararea cu bazele de date. O data ce se emit calcule de probabilitate, acestea presupun compararea cu o baza de date; din acest punct de vedere vor conta:

- marimea bazei de date (cu c t mai mare cu at t mai eficienta este comparatia);

- eterogenitatea ei (cu c t este mai eterogena cu at t mai eficienta comparatia);        .

- probabilitatea de aparitie n populatie a benzii cercetate 3.11 Secventionarea ADN mitocondrial

Este ultimul test ca modernitate si complexitate n identificare.

Portiuni din ADN-ul mitocondrial sunt nalt variabile la indivizi ne nruditi si deci secventionarea nucleotizilor acestuia permite identificarea si consecutiv deosebirea lor.

Aceasta tehnica este deosebit de utila n cazurile n care devine posibil medico-legal extragerea de material biologic provenit din fragmente subtiri de tulpina a firului de par, piele sau os provenite de la cadavre aflate n stare avansata de putrefactie.

n 1994 pentru prima data n Anglia o secventa de 800 baze din ADN-ul mitocondrial a fost extras din produsele biologice ale unui cadavru aflat n putrefactie avansata la circa 3 luni de la deces si care a probat aceeasi secventialitate cu cea a unicei sale rude aflate nca n viata, respectiv sora.

Lifecodes Corporation a fost pionierul tehnologiei ADN n SUA si este considerat cel mai experimentat laborator n acest domeniu. Lifecodes efectueaza cursuri de perfectionare si aprovizoneaza cu reactanti, enzime etc. numeroase laboratoare, inclusiv cel din FBI.

4. UTILIZAREA PROFILULUI ADN N MEDICINA LEGALA

Folosirea actuala a profilului ADN n justitie consta n a demonstra ca, la o serie de locusuri VNTR, profilul suspectului se potriveste cu ADN-ul obtinut de la locul crimei.

Profilul ADN (amprenta ADN) este utilizat n medicina legala n domeniul filiatiei (unde probabil îsi merita numele de ampren­ta genetica si n criminalistica la cererea organelor n drept.

- Expertiza filiatiei

- Stabilirea identitatii urmelor biologice (petelor de s nge, secretie vaginala, sperma, bulb pilos, fragmente de tesut)

- Identificarea speciei pentru diferentierea originii umane/animale

- Identificarea esantioanelor de s nge prelevat pentru alcoolemie

- Identificarea resturilor cadaverice/scheletice

- Identificarea victimelor

- Confirmarea/infirmarea vinovatiei n delicte sexuale

- Confirmarea/infirmarea vinovatiei n omucideri

- Redeschiderea unor cazuri nesolutionate sau verificarea unor condamnari eronate

- Formarea unei banci de amprente genetice a delincventilor. 4.1. n filiatie

Tehnica se bazeaza pe faptul ca alelele fiecarui locus minisatelit sunt mostenite independent dupa sistemul Mendelian, ast­fel nc t pe o pereche de cromozomi omologi, pentru acelasi locus, VNTR-ul provenit de la mama este diferit de VNTR-ul proven­it de la tata, ceea ce permite nu numai identificarea individului dar si a parintilor sai. n plus, tehnica VNTR-PCR permite chiar posibilitatea de colorare a benzilor de origine materna de cele de origine paterna dintr-o pereche de benzi si usurinta identificarii fragmentelor caracteristice.

n criminalistica

4.2.1. Identificarea victimelor Caz istoric

Dec. 1987 Wichita: fostul sot - pornind de la un conflict juridic privind autoritatea paternala asupra copilului - dupa pro­nuntarea divortului ucide pe fosta sotie apoi, o incinereaza. Politia l surprinde tn posesia unei valize contin nd cenusa si unele resturi ce s-au devedit a fi umane, (Prof. William Eckert). Necunosc nd ca sunt necesare 2-2,30 ore la temperatura de 1.500 grade pentru a incinera complet un cadavru, criminalul din graba a efectuat o incinerare incompleta; astfel n cuptorul cremato­riului au fost gasite un inel si pete de s nge, iar printre resturile arse identificate n valiza un fragment de alpinge, un fragment de femur c t si unele parti moi pelviene.

4.2.2. Confirmarea vinovatiei n delictele sexuale

Analiza ADN a fost cel mai frecvent utilizata n cazurile de viol: n acest caz proba medico-legala o reprezinta secretia vagi-nala: aceasta contine mari cantitati de ADN provenind de la nucleii celulari ai femeii, ceea ce tinde sa acopere benzile ADN provenite din nucleul spermatozoizilor.

ntruc t spermatozoizii sunt acoperiti de un nvelis proteic bogat n sulf, ei devin practic impermeabil la substante chimice ce au ca scop distrugerea ADN (detergenti). O data ce ADN-ul femeii a fost ndepartat, ADN-ul spermatic poate fi solubilizat folosind substante chimice ce distrug rezistentul nvelis proteic. Apoi profilul ADN obtinut va fi comparat cu profilul ADN al femeii n cauza pentru a demonstra ca ele sunt diferite si cu cel al suspectului.

Primul caz istoric n Anglia (1986)

n 1983 o fata a fost violata si ucisa n apropierea unui mic oras de l nga Leicester. n 1986 o a doua fata a fost gasita n acelasi loc. Un barbat a fost arestat si acuzat de uciderea celei de-a doua fete dupa propria marturisire. Politia l-a considerat vinovat si de primul delict si a apelat la Jeffreys pentru a efectua profilul ADN. Profilul suspectului nu s-a potrivit cu sperma iden­tificata de la cele doua cadavre: prin urmare a fost exonerat de ambele delicte. Testele au fost apoi reconfirmate prin analize suc­cesive care au dus la aceleasi rezultate. A urmat cea mai mare v natoare de suspecti din istoria politiei britanice (a fost analizata sperma tuturor celor 1.500 barbati locuitori din acea zona), dar initial fara rezultate pozitive. Catre sf rsitul perioadei, n urma unei banale discutii purtata ntr-o institutie, a fost identificat un suspect caruia profilul ADN i s-a potrivit perfect cu cele doua esantioane de sperma de la cele doua cadavre, drept urmare fiind retinut si acuzat de dublu omor.

Confirmarea vinovatiei n omoruri Primul caz istoric n SUA(1987)

- Sept. 19,1987 Richmond Virginia; cadavru feminin de 35 ani gasit pe podeaua apartamentului propriu. Diagnostic medico-legal: Asfixie mecanica, viol.

- Oct. 3,1987 Richmond Virginia; cadavru feminin 32 ani gasit n WC-ul dormitorului de lanivelul 2 al propriei case. Asfixie mecanica

Modus operandi: n ambele cazuri criminalul a intrat n casa catar ndu-se pe zidul casei si taind un geam; n cazul primei victime o stranguleaza cu ciorapul str ns de pompa de WC si viol; a fost gasita sperma pe pat. n cazul celei de-a doua victime stranguleaza cu o curea si viol cu perversiuni sexuale (sodomie); sperma a fost gasita pe chilotul victimei. Ambele victime aveau m inile legate la spate.

- Nov. 22,1987 Chesterfield County (la sud de Richmond, n vecinatate); cadavrul unei tinere de 15 ani e gasit n aparta­mentul parintilor.

Modus operandi; criminalul a intrat pe geam pe c nd familia dorwa. Victima a fost strangulata, a fost legata cu m inile la spate si violata

- Dec. 1, 1987 Airlington Conty (Nothem Virginia); cadavrul unei femei de 44 ani a fost gasit n patul din dormitorul de la nivelul 2 al casei sale.

Modus operandi: Strangulata si violata; se identifica sperma pe camasa de noapte, ( n acea perioada profilul ADN era con­siderat un experiment de laborator neadmis n justitie).

S-a nceput cu cercetarea modusului operandi n omorurile prezentate si o ancheta completa despre toate delictele grave n acea zona, a fost identificat un omor n 1984 dar la care autorul era retinut. Au fost identificate n 1983 violuri neurmate de deces: produselor biologice retinute cu acea ocazie li s-a efectuat profilul genetic dovedindu-se ca acesta era comun la toate aceste violuri si identic cu profilul ADN efectuat din sperma identificata n omorul de la Airlington.

Pe parcursul anchetei se desprinde ca suspect un anume Spencer Timothy care a fost nchis n 1983 pentru alte tipuri de delicte dec t cele prezentate p na acum si apoi eliberat n acelasi an.

Ofiterul nsarcinat cu ancheta banuieste ca acesta este autorul violurilor din 1983, a crimei din 1984, c t si a celorlalte crime.

n ian. 20,1988 se decide arestarea lui Spencer initial pentru omorul de la Airlington. Efectueaza profilul ADN lui Spencer care corespunde cu profilul ADN al probei de sperma de la Airlington si apoi verifica pe r nd toate celelalte violuri si crime dovedint similaritatea profilului ADN n toate omorurile inclusiv n cel din 1984; pentru omorul din Chesterfield a fost necesara tehnica PCR (proba biologica era n cantitate redusa n consecinta justitia pune n libertate si repune n drepturi pe detinutul retinut pentru omorul din 1984.

S-a considerat n aceste cazuri ca profilul ADN a fost "semnatura crimei" pentru Spencer.

La apelul de la Curtea Suprema de Justitie Spencer este gasit vinovat pe baza marturiei a doua dintre victimele violate si neucise n 1983.

4.2.4. Redeschiderea unor cazurinesoluponate

ntruc t ADN îsi mentine pentru mult timp integritatea n specimenele uscate, Se pot redeschide cazuri vechi la care se dispune n conservare de probe biologice. ntr-un studiu efectuat n perioada iunie 1995-iunie 1996, Departamentul de Justitie al SUAa analizat cazurile a 26 persoane judecate si condamnate pentru delicte sexuale/delicte sexuale + crima, care au fost exonerate de vina n urma investigarii retroactive ADN. Aceste persoane, condamnate pe nedrept, au efectuat ntre 9 luni si 11 ani din pedeapsa (7 ani n medie). Condamnarea s-a bazat pe identificarea vizuala efectuata de victima/martori si demonstrarea simili­tudinii prin metode non-ADN ntre suspect si urmele biologice gasite la fata locului sau pe corpul victimei.

4.2.5. Formarea bazei de date de amprenta genetica a delincvenplor si criminalilor

La primul delict fiecare delincvent are nregistrate amprentele papilare si amprenta genetica, ce vor folosi n identificarea sa ulterioara ntr-un delict fie anterior n care nu a putut fi acuzat sau care a ramas cu autor neidentificat, fie ntr-unui viitor.

Anglia este prima tara din lume care n 1995 a nfiintat baza nationala de date ADN ce numara astazi circa 0,5 milioane pro­filuri ADN; cercetarea n aceasta baza de date a 3 benzi rezultate prin tehnica sondelor mono-locus nu a permis p na acum nici o suprapunere, ntruc t cercetarea cu o singura sonda ADN genereaza o probabilitate de suprapunere de 1:100, cercetarea cu doua sonde de 1:10.000 si cercetarea cu trei sonde de 1:1.000.000 de indivizi.

Puterea profilului ADN sta tocmai n potentialul sau discriminatoriu: de aici si posibilitatea formarii de baze de date ale delincventilor, ce permite legarea ntre ele a delictelor produse n locuri si momente diferite scutind numeroase eforturi si forte politienesti.

4.2.6. Infirmarea vinovatiei

Circa 30% din suspecti sunt exonerati n Anglia de diverse delicte prin aceasta tehnica

5. ADMISIBILITATEA PROBEI PROFILULUI ADN N JUSTI IE:

Bazele de date

Valoarea si utilitatea n justitie a amprentei genetice ca proba de certitudine a fost intens studiata n ultimii ani si ea se poate exprima prin asezarea standardelor legale ale admisibilitatii n general si a criteriilor admisibilitatii ca proba n instanta a profilu­lui ADN.

Standardele legale ale admisibilitatii au fost definite n SUA cu ocazia procesului Freye contra Stat SUA.

Freye v. USA: "Momentul n care un principiu stiintific sau o anume descoperire trece limita dintre experiment si posibilitatea practica de demonstratie este dificil de stabilit. Ea va putea fi folosita n justitie ca marturie expertala n momentul n care a capa­tat accept general n domeniul stiintific din care face parte".

n ceea ce priveste admisibilitatea n justitie a profilului ADN ea recunoaste drept criterii validarea metodei de lucru si a labo­ratorului n care se efectueaza tehnica c t si tipul si marimea bazei de date folosita pentru comparatie.

Standardizarea europeana actuala are ca scop tocmai monoformitate internationala de tehnologie si tehnica ntr-o tehnolo­gie care evolueaza foarte rapid. Grupul European pe Profil ADN (European DNA Profiling Group, EDNAP, 1989) are ca scop tocma standardizarea tehnicii si acreditatrea internationala a laboratoarelor dupa criteriile tehnologice si ale calitatii rezultatelor.

6. VALOAREA sl LIMITELE PROFILULUI ADN N MEDICINA LEGAL sl JUSTI IE

Controverse si critici

n multe tari amprenta ADN a devenit un instrument larg folosit n practica medico-legala, fiind admisa ca proba n justitie; mai mult dec t at t, datorita perceptiei acesteia ca tehnica infailibila, multe cazuri implic nd amprenta ADN sunt aduse n fata Curtii cu putine alte dovezi incriminante.

Entuziasmul initial a fost temperat n ultimul timp de numeroasele controverse si critici, ceea ce a determinat constituirea n mai multe tari a unor comisii stiintifice care sa investigheze criticile aduse amprentei ADN, ca de exemplu cea condusa de National Research Concuil a US National Academy of Sciences, care s-a materializat n 1992 ntr-un raport asupra "Tehnologiei ADN n medicina Legala".

Controversele si criticile aduse amprentei ADN pot fi clasificate n mai multe categorii:

A Principii de baza

Diferitele tipuri de secvente tandemice repetitive de ADN sunt dispersate abundent n genomurile practic tuturor speciilor eukariote. Unii autori considera ca at t timp c t informatiile priviotare ia secventele repetitive de ADN non-uman sunt extrem de sarace, principiului amprentei ADN nu i se poate acorda ncredere mai ales pentru identificare.

B. Tehnici de laborator

Procedurile de laborator sunt puse adesea la ndoiala mai ales deoarece diferite laboratoare pot obtine diferite rezultate c nd analizeaza acelasi esantion.

Cu toate ca analiza VNTR-urilor prin tehnica PCR permite o determinare precisa a lungimii alelelor, aceste secvente repeti-

vive pot avea valori extreme de variabilitate secventiala care pot fi determinate numai prin secventializare sau MVR (analiza vari­antei minisatelitilpr repetitivi).

Variatii flagrante ale independentei alelelor pot apare datorita unor binecunoscute fenomene electroforetice determinate de proprietatile fizice ale locusurilor VNTR.  

Multe exemple includ cazuri n care "artefacte experimentale" sunt invocate pentru a explica elementele neconvenabile care apar n autoradiografii, acele cazuri n care se declara o concordanta ntre ADN-ul suspectului si ADN-ul probei n ciuda prezentei unor benzi neconcordante, ca si cazurile n care s-au realizat mai multe profiluri ADN din care cel mai convingator este prezen­tat ca proba n justitie.

Astfel este cazul deja celebru al lui Andrew Deen care a fost declarat de cur nd nevinovat si achitat dupa ce n 1990 a fost condamnat la 16 ani nchisoare pentru viol, la dosarul sau singura dovada de condamnare a acestuia fiind potrivirea ADN-ului sau cu ADN-ul gasit la locul faptei. Datele ADN ale lui Deen erau bazate mai mult pe alele multi-locus dec t pe alele cu locus unic. Medicii legisti britanici au numarat 10 benzi de identitate (sau potrivire - "matching bands"), calcul nd o probabilitate de potrivire ("match probability) de 1700.000. La apelul final facut n instanta, un medic legist german desemnat pentru reexaminare a sustinut ca dupa parerea sa sunt de fapt doar 6 benzi de potrivire, 4 neutre si 2 discrepante, ceea ce duce n final la o proba­bilitate de potrivire de 1:33, si deci de nevinovatie, ntruc t probabilitatea este foarte mica si alte date nu exista la dosar.

Un alt punct disputat este riscul mare de contaminare a probei cu ADN "strain" (contaminarea se poate produce n orice sta­diu de la prelevare si p na la tehnicile de laborator) care poate interfera puternic rezultatele. Contaminarea poate fi de origine bacteriana si de asemenea, mult mai periculos pentru rezultatul investigatiei, de origine umana. Pentru tehnica PCR riscul de contaminare este mult mai mare dec t n cazul tehnicilor conventionale, astfel cea mai mare calitate a tehnicii PCR (faptul ca necesita numai cantitati foarte mici de ADN) reprezinta cea mai importanta sursa de eroare. O privire elocventa asupra valoriii informative, eficientei discriminatorii si garantiei obiectivitatii amprentei ADN (HLa - DQalfa) n cazurile medico-legale de rutina, o furnizeaza un studiu statistic, din care rezulta ca numai n 70% din cazuri s-a putut realiza amplificarea PCR, din care n numai 42% s-au putut obtine informatii relevante privind excluderea/acuzarea unui suspect (aceasta limitare s-a datorat n principal fap­tului ca materialul biologic supus analizei nu provenea de fapt de la agresor, ci de la victima sau de la alte persoane). Astfel, din 10.060 investigatii ADN efectuate de FBI p na n iunie 1996, 20% au fost neconcludente, 20% au permis excluderea si n 60% din cazuri s-a constatat o potrivire ntre proba si suspect.

Procesarea de laborator si interpretarea profilului ADN, oric t de riguroase ar fi, depind ntr-o masura foarte mare de modul de obtinere a probelor si a informatiilor legate de acestea: de exemplu, n cazul unui delict sexual, daca n fluidul vaginal exista mai multe tipuri genetice de sperma provenite de la 2 sau mai multi indivizi diferiti, cu care femeia a avut contact sexual recent, exista posibilitatea ca investigatia de laborator sa puna n evidenta profilul ADN al altei persoane si nu al violatorului, caz n care suspectul este exonerat pe baza fortei de convingere a amprentei ADN.

C.  Controverse generate de interpretarea rezultatelor

Excluderea unei persoane (exonerare de suspiciunea de vinovatie a unui suspect) este certa daca pattemul suspectului si cel al probei sunt diferite, aici lucrurile fiind clare si rezultatul transant (pentru siguranta se considera ca daca exista doua diferente ntre pattern-uri avem o excludere). Daca nsa pattern-urile sunt asemanatoare suspectul "poate fi vinovat"; aceasta afirmatie trebuie completata cu precizarea probabilitatii acestei posibilitati: "poate fi vinovat., asa cum mai pot fi nca 1, 100.000 sau 10.000.000 de indivizi". Calculele statistice sunt mai complexe ntruc t fiecare banda ADN are asociata o probabilitate diferita de aparitie ntr-o anumita populatie, grup sau subgrup etnic.

Dupa American Association of Blood Banks, urmatoarele criterii ar trebui ntrunite de expertizele ADN pentru ca acestea sa fie admisibile:

1. Locusurile ADN investigate trebuiesc validate prin studii familiale pentru a demonstra ca acestea se transmit rnendelian si au o anumita rata de mutatii;

2. Localizarea cromozomiala a locusurilor polimorfe trebuie sa fie nregistrata n Yale Gene Library sau recunoscuta de International Human Gene Mapping Workshop;

Locusurile polimorfe trebuie sa fie documentate n literatura

4. Tipul de polimorfism folosit trebuie definit din punct de vedere al caracterului uni/multilocular, sau dialelic/hipervariabil;

5. Esantioanele trebuie sa fie disponibile pentru testari de confirmare n laboratoare independente.

D.  Controverse legate de analiza bazei de date populaponale

Deoarece populatiile umane nu sunt omogene (exist nd diferente semnificative n ceea ce priveste frecventa unor alele VNTR nu numai ntre principalele grupuri rasiale, dar si n cadrul substructurilor acestora), datele acumulate p na n prezent nu permit generalizari fiabile n ceea ce priveste frecventa alelelor n subpopulatii/grupuri etnice, relevante pentru un caz anume. Problema ar fi simplificata daca s-ar cunoaste apriori ca vinovatul si suspectul fac parte din acelasi grup etnic.

Probabilitatile calculate pe baza unor colectari heterogene de date pot deci subestima adevaratele probabilitati cu p na la doua ordine de marime.

n viitor frecventele plafon vor trebui stabilite pe baza unei baze de date mai adecvate, mai bogate, cuprinz nd locusuri relevante de la subpopulatii multiple.

Modul n care probabilitatile asociate cu profilele ADN sunt prezentate cu profilele ADN sunt prezentate n justitie este de asemenea criticat de unii specialisti n genetica populationala, o metoda sugerata pentru a reduce riscul de condamnare a unui suspect, la nivelul actual al cunostintelor n domeniul amprentei AND, consta n exprimarea probabilitatii unei potriviri ca pro­portia n care genotipul multilocus a fost osbservat n populatia generala

E.  ontroverse n ceea ce priveste calculul proba bilitaplor

O problema teoretica importanta, adesea ignorata, este ca probabilitatea ca un individ sa aiba un anume profil ADN este diferita (frecvent mai mica) de probabilitatea ca el sa aiba chiar profilul ADN al suspectului. Ultima dintre aceste probabilitati este cea vitala pentru medicina legala. Diferenta dintre cele doua probabilitati poate fi foarte mare: pentru un profil ADN calculat pe 4 VNTR cu o probabilitate neconditionata de 1/10.000.000, probabilitatea de potrivire conditionata pentru un frate al suspectului va fi de obicei mai mare de 1/100, n timp ce pentru un alt membru al grupului populational din care face parte suspectul poate fi 1/10.000 sau mai mare.

Daca doua profiluri ADN se considera ca se potrivesc, relevanta acestei probe este sustinuta de ceea ce se numeste proba­bilitate de potrivire", adica probabilitatea ca la o persoana ne nrudita aleasa nt mplator dintr-o populatie reprezentativa sa i se potriveasca profilul ADN cu profilul ADN al probei cercetate de la fata locului. Modul de calculare al acestei probabilitati a fost mult dezbatut de catre Lewontin si Hartl) dar putine s-au spus despre corecta sa interpretare. Exista doua aspecte importante si total diferite ntre ele n ceea ce priveste interpretarea profilului ADN; acestea se exprima prin doua ntrebari:

1) care este probabilitatea ca la un individ nevinovat sa aiba loc potrivirea secventelor sale cu ale probei? - adica probabilitatea de potrivire ca o persoana aleasa la nt mplare sa aiba acelasi profil ADN cu proba.

2) care este probabilitatea ca un individ sa fie nevinovat desi secventele sale se potrivesc cu cele ale probei? - adica proba­bilitatea de nevinovatie.

La prima ntrebare raspunsul este dat de probabilitatea de potrivire; a doua ntrebare nsa este cea mai importanta pentru justitie In dubio pro reo. Cele doua ntrebari sunt foarte diferite si cer raspunsuri diferite: frecvent juratii pot gresi d nd raspun­sul la prima ntrebare prin intermediul celei de-a doua (aspect numit sofismul procurorului" - prosecutor's fallacy -) sau invers, fapt ce determina confuzie prin confundarea probabilitatii de potrivire cu cea a probabilitatea de nevinovatie.

Trebuie remarcat ca o mica probabilitate de potrivire, nu poate prin ea nsasi sa determine vinovatia. C nd avem de-a face cu probabilitati de potrivire extrem de mici pare naiv sa se ignore posibilitatea unui rezultat fals pozitiv datorat unei greseli omenesti. O afirmatie bazata pe probabilitati este prin natura ei o afirmatie de cunoastere partiala, de aceea este paradoxal sa transformam aceasta cunoastere ntr-o dovada certa, care poate duce la privarea de libertate sau chiar executia unui individ.

F.  Valoarea metodei

n ciuda acestor controverse, progresele recente n domeniul profilului ADN au transformat acest tip de investigatie ntr-un instrument de investigatie de o importanta deosebita pentru medicina legala datorita unor calitati incontestabile.

- metoda are o specificitate si o capacitate de discriminare net superioara metodelor clasice de identificare serologica

- permite identificarea urmelor biologice chiar daca acestea se gasesc n cantitati infinitezimale (de ordinul a 60 nonagrame la câtiva nucleotizi);

- se poate aplica cu succes chiar atunci c nd urmele biologice sunt foarte vechi si degradate (situatii n care markerii sero-logici obisnuiti sunt inutilizabili).

n administrarea justitiei, aportul profilului ADN l constituie exonerarea de vinovatie al suspectilor si evitarea sau repararea comiterii unor erori judiciare.

G.  Concluzii

Introducerea tiparii ADN a reprezentat o revolutie n domeniul biologiei moleculare. De la descoperirea amprentelor papilare, profilul ADN reprezinta cea mai mare descoperire n domeniul criminalistic si este indisolubil legata de viitorul medicinii legale. Din controversele actuale rezulta necesitatile evolutive care determina directiile viitoare de dezvoltare a tehnologiei ADN:

/. Crearea unei banci internationala de date ADN pentru uz medico-legal, conectata cu banci de date similare; este nece­sara datorita fluxului de informatii n permanenta crestere si necesitatii de acces n timp real la aceste date.

//. Programe de cercetare coordonate pe plan international. Din motive evidente de eficienta, cercetarile ar trebui sa se desfasoare dupa un program international, concentr ndu-se asupra unor prioritati, ca de exemplu detectia si studiul proprietatilor locusurilor hipervariabile, studii populationale asupra frecventei alelice etc.

///. Ameliorarea tehnicii ADN. Evolutia rapida n tehnologia ADN, nregistrata n ultimul deceniu, ar trebui si trebuie sa se continue catre ameliorarea tehnicilor de extractie, de detectie si filtrare a ADN-ului contaminant, de crestere4 a fiabilitatii tehni­cilor ADN (automatizare, interpretare computerizata etc).

IV. Standardizarea tehnicilor de laborator. Deoarece fiabilitatea tehnicilor ADN a fost pusa la ndoiala datorita diversitatii actuale de procedee si tehnici de laborator, este necesar un efort international ndreptat catre standardizarea procedurilor de laborator.

7. PROBLEME ETICE sl JURIDICE

Cunoasterea patrimoniului genetic va deveni din ce n ce mai profunda si deci va aduce din ce n ce mai multe informatii asupra identificarii individului, asupra predispozitiei sale catre anumite maladii genetice, asupra potentialei manipulari a geno-

mului sau aceste noi cunostinte vor fi redutabile pe plan social, daca foarte repede nu vor fi comitete nationale de etica pentru orice tine de genetica si biotennologie, comitete ce trebuie sa defineasca de o maniera stricta limitele utilizarii sondelor genet­ice.

n medicina legala problemele sunt n principal de trei categorii:

- protectia si respectarea individului; este posibil spre exemplu de a decide alegerea unor regiuni cu nalt polimorfism ADN care nu aduc nici o informatie asupra sanatatii persoanei;

- crearea multifisier central;

- problema filiatiei.

Aceste aspecte sunt diferite de problemele ridicate, spre exemplu, de amprentele digitale care au dat suficient timp de g ndire marelui public, n timp ce rapiditatea aparitiei noilor tehnologii ADN nu lasa suficient timp de ntelegere a ansamblului problemelor specifice stiintelor medico-legale, implic nd riscul de a confunda posibilitatile manipularii fiintei umane si a descifrarii polimorfismului individual, probleme cu mare impact at t n dreptul penal c t si n cel civil.

- se pune astfel problema acceptului la prelevare de probe

n filiatie admiterea incontestabilitatii probei

- introducerea de norme de acreditare pentru laboratoarele specializate, fiecare laborator acreditat trebuind sa asigure prin personal calificat o munca de calitate cu rezultate reproductive.

Numai n astfel de conditii n care rezultatele sunt exacte, fiabile si reproductibile, exista sansa combaterii eficiente a crimi­nalitatii internationale.

Capacitatea amprentei ADN de a stabili" vinovatia sau nevinovatia a capatat atentia si entuziasmul politiei si justitiei. Terminologia si tehnologia sofisticata, futurista a tehnicilor ADN, Ie-a nconjurat cu o aura de infailibilitate ceea ce a determinat existenta multor cazuri implic nd amprenta ADN, care au fost aduse n fata Curtii cu putine alte dovezi incriminante. Pentru moment nici instantele nici magistratii nu sunt pregatiti sa nteleaga pe deplin valoarea dovezilor rezultate din tehnicile ADN, deci nu pot lua decizii corecte bazate pe argumentele controversate aduse de expertii apararii si acuzarii. Aceasta explica ne ncred­erea cu care au nceput sa fie privite dovezile ADN de catre tribunale n ultimul timp. Contrast nd cu procesul obisnuit al pro­gresului stiintific, se observa n prezent tendinta ca medicii legisti sa se cantoneze n pareri inflexibile, rigide datorita unor marturii depuse anterior. Un sistem adversial bazat pe contradictorialitate nu este recomandabil dezvoltarii acestui c mp nou de activi­tate medico-legala si n general progresului stiintific medico-legal (vezi cazul Deen), ntruc t fixeaza rigid legistii ntr-o mentali­tate de asediu ( siege mentality") care i determina sa refuze noi evidente de frica posibilelor lor implicatii penale. Cu toate ca natura interogativa a sistemului adversial poate afecta acuratetea de exprimare, argumentul ca juriul ar fi putut ajunge la acelasi verdict chiar daca dovezile ADN ar fi fost corect prezentate ridica serioase probleme.

Unele din erorile judiciare dovedite n Marea Britanie au implicat cercetatori care au ascuns anumite detalii ale rezultatelor investigatiilor lor. Poate ca la fel de nelinistitoare este si posibilitatea ca juriul sa fi putut ajunge la aceeasi concluzie si fara dova­da ADN. Influentati de publicitatea exagerata facuta amprentei ADN, juratii pot interpreta probabilitatile mici legate de dovezile ADN ca o dovada irefutabila de vinovatie, netin nd seama de alte probe. Cei care prezinta astfel de dovezi trebuie sa se asig­ure ca pericolul de interpretare eronata este explicat cu grija juriului. Problema daca acuzatul este sursa esantionului gasit la fata locului depinde de tehnologia ADN dar si de celelalte dovezi prezente la dosar. Aprecierea acestora este o problema primordiala n consecinta nu este corect ca un expert sa si exprime opinia n ceea ce priveste vinovatia acuzatului. Cu toate ca poate parea natural ca omul de stiinta care efectueaza un test sa si poata exprima opinia daca esantionul gasit la fata locului provine de la acuzat sau nu, aceasta conceptie este totusi eronata