METODE CLASICE DE INVESTIGARE A URMELOR DE SANGE

Fundamentul stiintific al expertizei

Prezenta urmelor de sange la locul faptei sau pe corpuri delicte are o importanta deosebita in procesul judiciar, intrucat li se pot stabilii natura si originea. Fiind vorba de un material foarte complex - biologic - care, chiar si in cantitati mici, pastreaza un numar important de caracteristici un timp indelungat dupa formarea urmelor, de regula sub forma de pete, identificarea criminalistica devine realizabila. In acelasi timp, caracterul biologic al urmelor de sange conditioneaza posibilitatile de examinare multipla de cantitatea lor, vechimea si modul de pastrare. S-au cristalizat o metodologie si o practica de expertiza - rezultat al imbinarii unor metode chimice, fizice, microbiologice, imunologice, citologice etc - care cunosc, insa, mutatii permanente datorita dezvoltarii stiintelor de baza si a metodelor de investigatie.

Examinarea urmelor de sange urmareste aspectul morfologic, caracteristicile fizicesi chimice, cele biologice comune - de specie - precum si determinarea antigenelor si a altor factori de grupe, in scopul identificarii grupei sanguine a persoanei de la care provin.

5.1. CARACTERISTICI GENERALE SI INDIVIDUALE ALE SANGELUI

5.1.1 CARACTERISTICI GENERALE

Sangele este un tesut uman (animal) fluid, cu multiple functii in metabolism, in autoapararea organismului, in coordonarea functiilor vitale. Potrivit acestor functii, in compozitia sangelui exista elemente permanente (proprii) si elemente tranzitionale (vehiculate). Elementele permanente sunt compuse din formatiuni celulare si dintr-o parte lichida, denumita plasma sanguina. Elementele tranzitionale contin factori alimentari, metaboliti, hormoni si altii.

Sub aspectul functiilor, al repartitiei in sistem si al mobilitatii sale, sangele se compune din trei componente: tisular central hematopoetic; circulant; periferic-tisular.

I.           Compartimentul tisular central hematopoetic este alactuit din tesutul meloid (maduva rosie), formator de granulocite, hematii si trombocite, tesutul limfoid in care se realizeaza limfopoeza (geneza limfocitelor) si sistemul reticulo-endotelial cuprinzand celulele organelor hematopoetice ce contribuie la formarea anticorpilor.

II.        Compartimentul circulant este format din elemente celulare si plasma sanguina.

a)     ELEMENTE CELULARE

Eritrocitele (globulele rosii) sunt sunt prezente la om in numar de 4,5-5 milioane/mm³ de sange. Au o membrana cu permeabilitate selectiva (pentru apa, oxigen, lichide si unii ioni metalici). Membrana este foarte activa din punct de vedere biochimic datorita prezentei a numeroase forme de proteine enzimatice si polizaharide, ambele cu redacali liberi.

Protoplasma eritrocitara, ca si molecula de proteina, se comporta antigenic.

LEUCOCITELE (globulele albe) sunt prezente in sangele circulat in numar de 6-8000/ m³. Ca origine si functii, leucocitele se impart in mai multe categorii:

GRANULOCITE neutrofile, lozinofile sau bazofile, cu rol primordial in fagocitare.

LIMFOCITE, cele mai mici leucocite cu marimi si forme variabile ce se acomodeaza la necesitatile de aparare ale organismului. In mod obisnuit ele participa la formarea anticorpilor.

MONOCITE, celule macrofage care participa de asemenea la sintetizarea anticorpilor.

PLASMOCITE, celule care fac parte din limfocite fiind transformate special pentru formarea anticorpilor.

TROMBOCITE sau PLACUTE SANGUINE cu rol primordial in coagularea sangelui. In corpul trombocitelor s-au identificat 12 substante active numite factori trombocitari, din care o parte contribuie la fibrinogeneza (coagulare), iar restul actioneaza in directia mentinerii starii de fluiditate a plasmei sanguine, dispersarii fine a picaturilor de grasime (in kilomicroni) si, in general, a echilibrului electrostatic al sangelui.

b)    PLASMA SANGUINA

Partea fluida, necorpusculara a sangelui este numita plasma. Serul sanguin este partea fluida separata dupa coagularea sangelui, lipsita deci de o cantitate de proteine si ioni. Plasma sanguina este o solutie apoasa, coloidala, in care sunt dispersate si plutesc numeroase substante insolubile in apa, precum si elementele celulare ale sangelui.

Constituientele permanente cele mai importante sunt proteinele plasmatice: fibrinogenul, albumina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, betaglobulina, gamma-globulina. Aceste proteine sunt sintetizate in organismul uman, fiind specifice din punct de vedere imunologic. Compozitia moleculelor de proteina difera de la individ la individ datorita modului specific de combinare a aminoacizilor, fiind determinata de factori genetici individuali (ereditari).

Volumul total al sangelui circulant este de 5 litri; el se gaseste in permanenta miscare in sistemul vasculat si in spatii tisulare, fiind tinut in miscare de cord. Tensiunea arteriala cu valoare cifrica de 120-150 mm Hg reprezinta o presiune de irigare conditionata de cantitatea permanenta de sange, starea tonusului vascular si de situatia electrostatica a sangelui. Aceasta presiune fiind exercitata in permanenta asupra peretelui vascular arterial, in momentul formarii unor discontinuitati vasculare, sangele se extravazeaza cu aceeasi forta, fieintre fibrele tesuturilor invecinate, fie in mediul exterior. In sistemul venos, in schimb, presiunea hidrostatica este minimala sau chiar negativa. In consecinta, lezarea acestor vase provoaca hemoragii lente, fara presiune. 414j93e Aceasta diferenta se recunoaste si in forma urmelor.

III. Compartimentul periferic-tisular se caracterizeaza printr-un ritm de circulatie mai lent. Contine aceleasi elemente ca si compartimentul circulant, insa intr-o alta proportie (mai putine eritrocite, mai multe leucocite si elemente tranzitionale).

Regnul animal, cu toata diversitatea sa biologica aparuta in cursul evolutiei speciilor, a pastrat anumite scheme structurale comune, atat in privinta structurilor de baza, cat si in schema biochimica functionala. Sangele mamiferelor are schema de structura celulara similara. Comuna este, de asemenea, la toate mamiferele, structura biochimica bazata pe proteinele tuturor tesuturilor si organelor.

In materialul biologic (materia vie), tendinta de diversificare este totusi mai generala nu numai in marea diversifitate a raselor si individual, ci si in structurile biochimice ale macromoleculelor constituente. Diferentele structurale prezente in celule si in proteinele acelorasi tesuturi constituie baza diferentierii pe specii, rase si indivizi a substantelor biologice.

CARACTERISTICI INDIVIDUALE

Polimorfismul structural al macromoleculelor biologic active este o trasatura tot atat de generala si logica, ca si similitudinea principiului structural. Aceste proprietati, fie la nivel de specie sau rasa, fie la nivel individual, sunt genetic determinate si transmise in cadrul fameliei. In consecinta, aceste propruetati individuale (ale speciei, plus ale individului) sunt permanente, neschimbate esential in cursul vietii individului, fiind cunoscute sub numele de "grupe sanguine".

Aceste configuratii structurale sunt comune la diferite specii de animale, asa incat unele grupe sau sisteme complete de grupe sunt prezente la anumite animale, ami ales la mamiferele superioare. Drept urmare, in practica criminalistica prezenta unor grupe sanguine nu este egala cu originea umana a sangelui.

Vorbind de grupele sanguine, in general, se are in vedere sistemul AB0 descoperit in 1900 de K. Landsteiner. Antigenele din sistemul de grupe AB0 sunt insa cele mai raspandite in regnul animal, fiind prezente chiar la unele microorganisme (grupa A). in cazul omului, aceste proprietati antigenice sunt prezente in toate organele, in unele secretii sau in limfa celulara. Alaturi de factorii de grupe AB0, in fiecare caz este prezenta si antigena H, care diferentiaza sangele uman de cel animal, aceasta existand si la persoane cu grupa 0. Chiar Landsteiner si cercetarile ulterioare au demonstrat faptul ca pe membrana eritrocitului si a altor celule hematice sunt numeroase variatii individuale cu caracter antigenic, constituente ale sistemelor de grupe independente.

Cercetarile, mai ales prin metoda electroforezei pe geloza, au demonstrat prezenta in serul sanguin si a altor tipuri de variabilitate, denumite "grupe serice".

In ultimele decenii, variatiunile structurale au fost descoperite si la proteine-enzime, atat cele fixate pe celule, cat si in cazul numeroaselor enzime din serul sanguin, numite "grupe enzimatice". Notiunea de "grupa sanguina" cuprinde totalitatea sistemelor grupale rezultate din polimorfismele structurale biochimice, indiferent daca ele sunt localizate pe membrana celulelor sanguine, in proteinele plasmatice sau pe celulele ori limfa celulara din diferitele tesuturi si organe.

Pe baza acetei variabilitati infinite, se poate afirma teoretic ca nu exista doua picaturi de sange identice, exceptand cuplurile gemelare monoviteline. In practica criminalistica insa nu se poate realiza aceasta individualizare perfecte, mai ales din motive tehnice, respectiv datorita cantitatilor reduse a urmelor de sange, alterarii lor. Totusi realizarea incadrarii urmelor in cateva sisteme de grupa asigura o comparatie cu constelatia de grupe existente la persoanele suspecte in sensul coincidentei sau eliminarii.

Fiecare sistem de grupa este independent fata de celelalte, atat in privinta caracterului antigenal, cat si sub aspectul transmiterii ereditare. Notiunea de "subgrupa" se utilizeaza exclusiv pentru variantele din cadrul unei grupe. De exemplu, in sistemul AB0, grupa A are subgrupele A₁, A₂, A₃.

5.2. ETAPELE EXAMINARII

Rezultatul examinarii urmelor de sange se bazeaza pe caracterul biologic al acestui material, pe prezenta elementelor structurale in ele si, de asemenea, a unor proprietati de specie si de grupe.cantitatea necesara pentru toate fazele identificarii este de cate 3-10 mg substanta uscata, deci in mod practic in multe cazuri nu se dispune de un material suficient pentru toate examinarile.

5.2.1. EXAMINAREA SEPARATA

Identificarea unei urme de sange impune o discipluna de cercetare pentru evitarea oricarei erori. Expertul biocriminalist trebuie sa respecte o ordine a examinarii care sa-i permita rezolvarea mai multor probleme: examenul preliminar al urmelor si reactiilor immediate ce permir orientarea desfasurarii ulterioare a cercetarilor (reactiile de orientare); examinarea microcristalografica ce confirma prezenta sangelui (reactii de certitudine); examenul imunologic pentru determinarea originii umene a sangelui; examinarea aglutinogenelor si aglutininelor specifice pentru indicarea grupei antropologice careia ii apartine individul care a sangerat.

GENERALITATI. Trebuie insistat asupra pericolului reprezentat de examinarile rapide, incomplete si mai ales organizate defectuos. De exemplu, o reactie imunologica fara examen microcristalografic, chiar pozitiva, nu poate demonstra decat originea umana a unui produ biologic, care poate sa nu aiba nici un caracter medico-legal: secretiile mucoase.

Investigarea grupelor de sange in absenta contextului cristalografic si imunologic, chiar pozitiva, nu permite afirmarea originii umane a urmei, caci exista aglutinide si la alte specii animale. Expertul care va prezenta concluzii ferme plecand de la examene de laborator partiale si insuficiente se expune unor critici justificate. O simpla reactie de colorare pozitiva (o reactie de orientare) nu permite in nici un caz sa se afirme prezenta sangeluiatunci cand celelalte examinari s-au dovedit negative. Expertiza este o informatie juridica data de o persoana cu pregatire complexa. Competenta implica un examen critic al faptelor si o interpretare limitata exclusiv la observatii indiscutabile.

5.2.1.1. Reactii de orientare

La locul faptei, se recomanda efectuarea cercetarii orientative prin prelucrarea unei cantitati mici de sange intr-un geam de ceas[1] si verificarea ei pe baza reactiilor de orientare.

De asemenea, si examenele de laborator nu trebuie efectuate decat asupra unei portiuni din urma de sange, restul urmand sa fie conservat pentru a permite o eventuala contra-expertiza sau chiar o noua expertiza.

Daca materialul este in cantitate insuficienta pentru a permite cercetari complete, expertul trebuie sa previna magistratul care va decide ce tip de investigatie va avea prioritate.

Aceste reactii se bazeaza pe faptul ca urmele de sange pastreaza un timp indelungat si in mare dispersie (dilutie) activitatea enzimatica de oxidaza. In consecinta, sangele este capabil sa scindeze oxigenul din combinatiile labile (din peroxid de hidrogen, sodiu, etc). oxigenul astfel eliberat, daca este in masa, provoaca efervescenta, fiind capabil sa oxideze diferiti coloranti cu schimbarea culorii. Cele ami uzuale variante de reactie (reactiile se efectueaza pe fragmente separate) sunt:

Reactia cu luminol (a lui Specht) Pulverizand reactivul[3] asupra zonelor suspecte a fi urme de sange, se obtine in caz afirmativ o fluorescenta intensiva. Se utilizeaza, de pilda, pe suprafata soselei, pe dusumelele spalate dupa patare, etc. Se mai foloseste solutia de 3-5% de apa oxigenata, care provoaca efervescenta in conditii similare, daca materialul este ami abundent.

Reactia cu leuco-verde malachit (Medinger) este destul de sensibila: pozitiva pana la o dilutie minima a sangelui de 1/200.000, pozitiva in contact cu sange in descompunere, vechi, dar negativa cu sangele calcinat. Reactia pozitiva cu anumite saruri de fier face ca aceasta proba sa fie contestata. Daca se observa un viraj rapid spre verde, reactia pozitiva; in absenta colorarii sau daca transformarea in verde e prea lenta atunci reactia e negativa. Aceste prime metode sunt utilizate si pentru relevarea la fata locului a urmelor de maini produse prin depunere de sange.[4]

Proba Adler (cu benzidina) este cea mai utilizata si sensibila, reactionand si la dilutia de 1/40.000 a sangelui. In prezenta peroxidazei (sange) apare o coloratie albastru-vernil ca se transforma in brun-gri la 2-3 minute si dispare treptat.

Reactia Guarino[6]. O picatura din aceasta solutie, amestecata cu o cantitate egala de apa oxigenata se aplica peste urmele de sange raclate, obtinandu-se o coloratie galbena. Reactia este mai putin sensibila.

Reactia Kastl - Mayer. Fenoftaleina redusa (incolora) dizolvata - 1g in 50 ml solutie 20% hidroxid de sodiu - in combinatie cu o cantitate egala de apa oxigenata, in contact cu urmele de sange prezinta o coloratie rosie-violacee.

Reactiile de orientare se pot repeta cu numerosi coloranti care provoaca variatii evidente de culoare la oxidare. La toate reactiile, se vor racla cateva fragmente foarte mici din urmele de sange (pe "sticla de ceas") peste care se picura reactivul. Niciodata nu se va efectua reactii direct asupra corpurilor delicte. In cazul in care suprafata unei arme albe nu prezinta urme vizibile de sange - dar se presupune ca ele exista - arma se poate introduce pentru 4-6 ore intr-o eprubeta cu apa distilata, rectia urmand a se efectua cu lichidul de maceratie. Specificitatea relativa a tuturor reactiilor rezulta din posibilitatea reoxidarii colorantilor in prezenta enzimelor oxidative de alta origine, a prezentei fierului trivalent (rugina) si a altor componenti oxidativi. Din acest motiv, pozitivitatea se confirma cu reactii de certitudine.

Reactii de certitudine

Principiul de baza al tuturor acestor reactii este demonstrarea prezentei pigmentului sanguin - hemoglobina.

1. Reactia Taichmann (de formare a cristalelor de clorhemina)

Se racleaza cateva granule fine de urma pe o lama microscopica, peste care se adauga o cantitate similara de NaCl (clorura de sodiu) - pudra si 1-2 picaturi de acid acetic glacial. Se acopera cu o lamela si se incalzeste de 3 ori pana la fierbere. Dupa 5-6 minute de racire, daca urmele sunt de sange, apar cristale brun-inchise, romboidale, alungite, mai ales deasupra granulelor de urme nedizolvate complet.

2. Reactia Gabrielli - Bertrande reproduce aceleasi cristale, fiind mai comoda prin faptul ca reactivul este o solutie stabila.

3. Reactia Takayama[7] este procedura-standard utilizata de laboratoarele F.B.I. pentru a obtine confirmarea prezentei sangelui. Proba se executa pe lama si dupa un contact, intre reactiv si urme, de 2-4 minute apar cristalele rosii, aciforme de hemocromogen. Aceste cristale dispar dupa 50-60 de minute.

Examinarea microspectroscopica

Aceasta este specifica si indispensabila mai ales la urmele mai vechi si alterate.

Urmele recent diluate cu 1-2 picaturi de apa distilata prezinta 2 benzi de absorbtie in zona lungimilor de unda de 589 -577 nm si 556 - 536 nm.

Din urmele ceva mai vechi se incearca formarea de cristale de hemocromogen cu reactivul Takayama sau cu stanil. Hemocromogenul are, de asemenea, doua benzi de absorbtie in zona lungimilor de unda de 564 - 554 si 536 - 532 nm.

Pe materialul raclat din urmele foarte vechi se picura 1-2 picaturi de acid sulfuric concentrat. Spectrul format are 3 benzi de absorbtie in zona lungimilor de unda de 608 - 594, 584 - 574 si 572 - 548 nm.

Cand exista o cantitate suficienta de sange in urma se macereaza cu apa distilata si se introduce in spectrofotometrul universal, examinandu-se la lumina vizibila ultravioleta. In acest aparat absorbtia de unde va aparea sub forma unor curbe inregistrate.

Reactiile sunt influentate negativ de prezenta resturilor uleioase, razaturilor de var, detergentilor, etc., din care motiv la reactiile biologice in special este recomandata purificarea materialului prin cromatografierea preparativa a lui Fiori.

In unele conditii devine necesara aprecierea cantitatii totale de sange scurs la fata locului - posibilitatea fiind data de conditiile locului. In cazul uscarii pe o suprafata impermeabila se strange tot materialul, se asigura o uscare perfecta si se cantareste, obtinandu-se astfel direct greutatea partii uscate: cantitatea inmultita cu 5 indica sangele total, 80% fiind greutatea partii volatile. Acelasi principiu se poate utiliza si in cazul cand cantitatea totala este imbibata in materiale textile (imbracaminte, lenjerie de pat, etc), care se usuca complet, apoi se cantaresc. Dupa aceea, se macereaza cat mai bine urmele in apa cu detergent, se usuca din nou textilele, iar diferenta de greutate reprezinta aproximativ partea uscata a urmelor, din care se calculeaza cantitatea totala ca mai sus.

Daca sangele este absorbit in zapada, nisip, etc., trebuie masurata zona de extindere, apoi se ridica probe reprezentative, iar din sangele separat si dozat hemoglobinometric se poate recalcula cantitatea totala.

Pentru examinarea separata a probei de comparatie, se prepara pete de sange pe un suport neabsorbant si pe materiale textile. Aceste pete cunoscute vor fi supuse acelorasi reactii ca si urmele de sange, cu un dublu scop:

pentru verificarea reactivilor folositi, mai ales daca acestia au dat o reactie negativa;

pentru alcatuirea etalonului de comparatie la probele cristaloscopice (Taichmann, Gabrielli - Bertrande, etc) si, mai ales, la metodele spectroscopice si spectrografice.

5.2.2. Examinarea comparativa, demonstratia si formularea concluziei

EXAMINAREA COMPARATIVA

Compararea reactiilor va fi realizata imediat, dupa efectuarea fiecareia in parte, acestea avand o coloratie inconstanta.

La compararea microscopica a cristalelor va fi luata in considerare si vechimea petelor de sange, intrucat, desi cele vechi se dizolva mai lent, iar cristalele adesea vor fi mai mici, culoarea si forma lor trebuie sa fie identice.

Compararea spectroscopica se va realiza in aceleasi conditii de iluminare. Adesea, datorita impuritatilor inerente din urmele de sange vor aparea linii de absorbtie sterse, dar localizarea lor pe lungimi de unda trebuie sa fie identica cu proba martor. La compararea spectrografica, sursa de lumina, pozitia pe filtru, dimensiunile de cuve si hartia de inregistrare vor fi aceleasi. Curbele fiind influentate si de gradul de transparenta al solutiilor, in cazul urmei poate sa apara o absorbtie de baza, care insa nu va impiedica compararea puseurilor caracteristice ale absorbtiei specifice la lungimea de unda respectiva.

DEMONSTRATIA

Se realizeaza in general pe plan vizual. De mentionat faptul ca in cazul urmelor proaspete de sange este suficienta executarea a 1-2 probe orientative si a unei probe specifice. Cele mai complicate, cu aparatura, au loc numai in cazul urmelor alterate si in anumite situatii particulare, de exemplu, cand se au in vedere derivatii toxici ai hemoglobinei.

In cazul urmelor mai vechi si al celor alterate, se efectueaza si unele analize spectrale. Curbele inregistrate se explica si in cazul prezentei unor impuritati.

FORMULAREA CONCLUZIEI

In urma examinarilor de laborator, expertul poate formula urmatoarele concluzii:

~ certa pozitiva. De exemplu: "Urmele de pe pantalonul ridicat de la numitul S.V. sunt de sange uman, apartinand grupei sanguine o(I)";

~ certa negativa. De exemplu: "Urmele de pe camasa ridicata de la numitul O.A. nu sunt de sange uman";

~ de probabilitate. De exemplu: "Urmele de sange descoperite pe manerul cutitului ridicat de la numitul Z.A. sunt de sange uman, care apartine probabil grupei B(III)";

~ de imposibilitate. De exemplu: "Nu se poate stabilii daca urmele in litigiu sunt de sange uman."

5.3. EXPERTIZE CE SE POT EFECTUA

Prin examinarea urmelor de sange se pot efectua expertize biocriminalistice, astfel:

5.3.1. expertiza pentru stabilirea speciei fiintei

a)     Examinarea separata

Principiul de baza al metodelor folosite in aceasta etapa consta in demonstrarea specificitatii de specie a proteinelor din plasma sanguina (sau a plasmei fixate in tesuturi, eventual in secretii cu un continut proteic). Fata de aceste proteine antigen, se produc la diferite animale imunseruri precipitante. Serurile purificate, infiolate, congelate sau liofilizate se pot pastra practic timp nelimitat, iar punandu-le in contact cu proteinele respective, formeaza o reactie de precipitare.

REACTIA DE PRECIPITARE IN EPRUBETA (Uhlenhut - Cistoreici - Wassermann). Reactia este pozitiva cu un antiser daca la limita de jonctiune dintre fragmentele de urme si serul precipitat se formeaza o pelicula fina (inel) de precipitat albicios. Lasand contactul in continuare, a doua zi turbiditatea se generalizeaza, respectiv se depune un precipitat alb pe fundul eprubetei.

S-au propus metode mai precise, vizand intotdeauna fixarea precipitatului la nivelul formarii lui. Dintre acestea este recomandata cea utilizata la noi in tara:

REACTIA HARTMANN TOILLIEZ[8] (de difuziune in gel). Reactia de imunprecipitare este realizata prin difuziunea spontana a proteinelor (antigene) fata de anticorpii din serul precipitant. Proteinele din urme se dizolva si se difuzeaza in geloza in mod circular. Totodata se difuzeaza si anticorpii din serurile de testare, iar la frontul de intalnire a antigenelor cu anticorpii specifici se va produce o linie (sau 2-3 linii) de precipitare. Aceste linii sunt bine si direct vizibile pe un fond negru, dar se pot colora.

In cazul reactiilor de imunprecipitatie, pentru asigurarea unui control riguros se prepara o proba-control cu un ser uman si una cu ser animal, in diluatie cu 1/10 din maceratul unui fragment din suportul urmelor de sange, dintr-un loc unde proba Adler a dat reactie negativa sau nu sunt urme evidentiabile de proteine (secretii) si cu o picatura din serul fiziologic utilizat la dizolvare.

In cazul cand urmele contin impuritati deosebite (de exemplu: gudroane, saruri de metale grele), se utilizeaza si un control, inlocuindu-se serul precipitant cu un ser normal de iepure.

b)    Examinarea comparativa

Aceasta se realizeaza prin compararea directa a precipitatelor formate dupa reactiile efectuate asupra urmelor de sange si a probelor control. Astfel, prezenta sangelui de om (sau al unei specii de animal) in urme este demonstrata atunci cand se obtine precipitat cu serul anti-om din urme si din serul uman de comparatie, respectiv cand lipseste precipitatul la celelalte metode de comparatie.

c)     Demonstratie

Se poate realiza pe plan vizual in cazul Uhlenhut - Cistoreici - Wassermann, precipitatul format fiind in mediu lichid si se va consemna in protocolul de examinare. In cazul metodei de difuziune in geloza, pelicula colorata, ca si o materializare permanenta a precipitatului format in cursul reactiei, ramane o dovada (proba) materiala sau, ca si in cazul unei pelicule de film se poate copia direct pe hartie fotografica.

d)    Formularea concluziei

- Concluzie pozitiva pentru provenienta de la om sau animal a urmelor de sange se va da cand reactia este pozitiva cu un singur antiser, existand totodata controlul pozitiv si reactie negativa cu restul probelor.

Este posibila prezenta mai multor feluri de sange pe un obiect (de exemplu: pe un cutit de bucatarie, imbracamintea ingrijitorilor de animale etc.) si, in consecinta, va exista imunprecipitat cu mai multe seruri de testare. Metoda de difuziune permite o mai usoara orientare in asemenea situatie (6 probe similare dintr-un fragment de pete).

- Concluzie negativa pentru provenienta de la un om sau de la un anumit soi de animal se va da cand antiserul respectiv nu reactioneaza existand, insa, un precipitat evident cu un alt antiser (alt ser), iar controlul cu serul anti-om (sau animal) in litigiu este pozitiv.

- Concluzie de probabilitate se va da atunci cand exista precipitat fata de un antiser, dar este prezenta orice discordanta cu seria controalelor pozitive si negative.

- Concluzia de imposibilitate se formaza in cazul lipsei generale de reactivitate (material infim, nesolubil, alterat) sau al unor precipitatii nespecifice, generale, datorita anumitor impuritati cu compusi activi din punct de vedere chimic.

5.3.2. Expertiza pentru stabilirea grupelor sanguine

Posibilitatea de identificare a grupelor sanguine in diferite sisteme de grupe din urmele de sange se bazeaza pe principiul general ca antigenele prezente pe membrana eritrocitelor, pe alte gene, in plasma sanguina sau in diferite tesuturi umane, tumori si secretii persista mai indelung in urmele formate din aceste materiale. In mod similar, si anticorpii naturali sau imunoanticorpii persista o vreme, dar acestia sunt mai sensibili la factorii de mediu.

In conditii optime, din urme proaspete si mai groase, se poate lucra cu tehnicile utilizate in cazul sangelui proaspat, mai ales privind grupele A, B, O, Mn, Rh (CDE, ce). Cel mai frecvent insa urmele sunt uscate in momentul examinarii, nefiind prezente eritrocite, caz in care este necesara o metoda particulara pentru evidentierea grupelor.

Reactia aleasa pentru identificarea grupelor din urme va fi deci adaptata intotdeauna la conditiile concrete: vechimea, gradul de uscare, gradul de alterare si suportul urmelor (daca acesta este absorbant sau nu, daca are influenta chimica asupra antigenelor).

Factorii de erori sunt prezenti la fiecare reactie, in sens negativ (neidentificarea unor factori de grupe), datorita cantitatii prea mici sau alterarii antigenelor, dar si in sens pozitiv (demonstrarea urmelor antigene inexistente in realitate la persoana respectiva), din cauza unor antigene nespecifice (microbiene, animaliere) sau a distrugerii anumitor materiale de testare tocmai in cursul procedeelor de lucru.

a) Examinarea separata

Procedee pentru stabilirea grupelor din sistemul ABO

In acest sistem exista in sangele uman in mod natural izoantigene si anticorpi (aglutinide), doi factori la fiecare om, intr-o combinatie care nu permite autoaglutinarea (formarea gramezii de eritrocite).

Pe membrana eritrocitelor se constata prezenta autoaglutinogenelor A, B sau a ambelor sau lipsa lor. La serul sanguin, aglutinele se afla in urmatoarea combinatie: la persoane cu antigena A, in ser se gaseste izoaglutina beta, la cele cu B, izoaglutina alfa, la cele cu O, izoaglutinele alfa si beta, iar la cele cu AB lipsesc aglutinele din ser.

La sangele proaspat, stabilirea grupei se efectueaza pe baza serurilor de testare din grupele A, B, O si a eritrocitelor-teste din grupele A si B. stabilirea grupei se efectueaza prin pinerea in contact a serurilor de testare cu suspensia de eritrocite neidentificate (metoda Beth - Vincent), respectiv cu picaturile de ser neidentificat cu eritrocitele A si B (metoda Simonin)[9]. In criminalistica se utilizeaza ambele procedee simultan.

Trebuie mentionat ca grupa O nu inseamna lipsa totala a antigenului din acest sistem, fiind prezent pe membrana eritrocitelor un antigen comun (antigen H), evidentiabil cu seruri speciale sau cu fitoaglutine.

De asemenea, se impune precizarea ca 80% din populatie poseda proprietatea de secretor, care inseamna ca la fiecare din aceste persoane - in serul sanguin, limfa tisulara, saliva, sperma, etc. - este prezent antigenul (aglutinogena) din grupa sanguina proprie, adica A, B sau AB. Se noteaza caracterul secretor cu "Se", iar caracterul nesecretor cu "se".

In urmele de sange, de regula, eritrocitele sunt distruse si in rare cazuri se poate stabili apartenenta de grupa dupa metodele descrise mai sus. Din acest motiv se utilizeaza metode indirecte.

- Identificarea aglutininelor se poate realiza cu metoda Lattes care se bazeaza pe principiul metodei Simonin. In urmele uscate este prezent serul uscat, in care se afla si factori hemaglutinanti alfa si beta. Redizolvandu-le si punandu-le in contact cu eritrocitele se pot obtine aglutinatii ce se evalueaza ca si la proba Simonin.

Practic se racleaza pe o lama microscopica trei portiuni din urme (cam 10 - 20 mg) sau fragmente din suportul textil cu pete bine sfacelate, pana la fierbere.

Se citeste rezultatul la microscop cu o marire de 20 X 10. Evaluarea: prezenta de aglutinine cu eritrocitele din grupa A si B la grupa O; prezenta cu eritrocite B la grupa A, prezenta cu eritrocite A la grupa B, lipsa de aglutinare la grupa AB.

Eritrocitele din grupa O in mod normal nu vor fi aglutinate. Exista insa posibilitatea prezentei unor aglutine nespecifice sau imunoaglutine din sistemul Rh, cand va aparea aglutinatie si cu serul O (Rh pozitiv).

In cazul urmelor proaspete, in general, rezultatele sunt concludente, insa, treptat, se pierde capacitatea de a aglutinare a serului uscat expus intemperiilor, astfel ca este posibila aparitia grupei fals AB in loc de A sau B si fals B in loc de O. din acest motiv s-au recomandat numeroase metode bazate pe principiul demonstrarii aglutinogenelor uscate din cruste, din resturi de tesuturi de tesaturi si din diferite secretii.

- Metoda Holzer[10]. Din urmele de sange impreuna cu suportul in care sunt imbibate se faramiteaza bine o cantitate de 3-5 mg si se introduce intr-o eprubeta Wassermann. Simultan se imbiba si proba martor pe un fragment al suportului care nu contine urme, procedandu-se la fel. Se adauga la ambele cate 3 picaturi (0, 10 ml) ser sanguin de grupa O, adica aglutininele alfa si beta. Dupa un contact al materialului supus examinarii cu serul, timp de 12-16 ore la temperatura camerei (vara in frigider), se executa doua serii de dilutii succesive cu ser fiziologic, dupa care se adauga la o serie suspensie de 2% eritrocite test-A si la cealalta serie de dilutii eritrocite din grupa B, agitandu-se bine.dupa 4 ore se citeste rezultatul. In cazul aglutinatiei se formeaza o pelicula de eritrocite ce se asaza pe toata extinderea godeului. In cazul lipsei de aglutinare, eritrocitele se vor sedimenta intr-o mica gramada pe fundul excavatiei. Se compara titrul (gradul de dilutie) seriei martor cu titrurile obtinute de la urme.

Intrucat grupa O este demonstrata prin lipsa de modificare (reactie nula), trebuie repetata proba cu fitoaglutinina anti-H. in asemenea conditii si grupa sanguina O va aparea bazata pe o absorbtie pozitiva si se poate diferentia fata de reactiile false-negative (de distrugere a aglutinogenului).

- Procedeu pentru determinarea grupelor M.N. In cazul sangelui proaspat, determinarea grupelor MN se efectueaza prin punerea in contact a eritrocitelor ce serul anti-M si anti-N, de preferinta in mediul saliv.

Evaluarea rezultatelor se face ca la metoda glutinarii fata de controlul de comparatie cu minimum doua scari de dilutie.

- Procedeu pentru determinarea grupelor haptoglobinice (Hp). Serul sanguin proaspat este tratat cu o solutie de hemoglobina in proportie de 1/10, pentru formarea complexului de haptoglobina - hemoglobina. Urmeaza hemoliza si inocularea benzilor de hartie in filtru Wattmann 4 in geloza de amidon dupa ce, in prealabil, au fost introduse in ser. In urma electrofirezei si a reactiei de oxidoza cu solutie de benzidina in acid acetic glacial apar benzile tipice Hp benzi din pozitive.

Urma de sange contine haptoglobina uscata, saturata cu hemoglobina. Fiind si o parte de Hp alterata, migrarea electroforetica nu e omogena, astfel ca in fasia desfasurarii liniilor specifice de Hp se vor gasi si resturi de hemoglobina care la reactia de identificare deranjeaza aparitia benzilor. Din acest motiv se recomanda efectuarea a doua migrari, in conditii diferite.

In timp de o luna de la formarea urmei de sange se poate realiza bine grupa Hp cu fiecare procedeu, dupa aceasta perioada insa, orice procedeu da erori destul de frecvente.

Pentru examinarea separata a probei de comparatie, se recolteaza sange de la victima si de la banuiti, fara adaus de anticoagulant.

Se vor stabili grupele sanguine in toate sistemele pentru care exista posibilitatea laboratorului (minimum grupele in sistemul ABO, Mn, Rh (s), Hp) din toate mostrele de sange.

b)    Examinarea comparativa

Identificarea grupei din care face parte urma de sange se realizeaza in aceasta faza, fiind comparata constelatia de grupe din diferite sisteme prezente la persoanele suspecte cu cea gasita in cazul urmelor de sange.

Cand exista o cantitate suficienta din amterialul de urme de sange se vor efectua toate reactiile de grupe. In caz contrar, la alcatuirea planului de expertiza se vor analiza intai grupele din mostrele de sange martor, iar materialul de urme va fi examinat in acele sisteme de grupe unde s-ua evidentiat diferente la persoanele in cauza.

c)     Demonstratia

Se realizeaza prin inregistrarea fazelor de reactie in raportul de expertiza. Se poate vizualiza prin fotografierea placilor cu reactie si obtinerea de diagrame care se vor anexa.

d)    Formularea concluziei

In privinta diagnosticului grupei sanguiene, concluzia pozitiva, cat si cea negativa si bazeaza pe existenta rectiilor calre la analiza.

Concluzia privind provenienta urmelor de sange ramane in fiecare caz o concluzie probabila, care se refera la o constelatie identica de grupe la o persoana si la o urma de sange. Gradul de certitudine sporeste in raport cu examinarea grupelor in mai multe sisteme de grupe.

Concluzia de imposibilitate se formuleaza daca rectiile pentru grupe sunt incerte sau cand sufera influenta impuritatilor din suport, a putrefactiei ori mucegairii urmelor, etc fiind posibila prezenta unor antigene nespecifice (microbiene).

5.3.3. Expertiza pentru stabilirea sexului

Cautarea crometinei sexuale are ca scop identificarea sexului si se poate realiza mai ales in cazul urmelor formate din saliva amestecata cu sange sau cand leucocitele au ramas intacte in urme.

Se efectueaza rehidratarea celulelor din urme cu ser fiziologic si se coloreaza special celule, daca nu au fost distruse. Se examineaza la obiectivul H al microscopului in ulei de inversiune. Cromatina sexuala (xx) apare sub forma de apendice, in forma unei "picaturi de lacrima". Trebuie sa fie gasite cel putin 10 celule granulocite poilinucleate cu apendice pentru punerea diagnosticului de sex.

Sangele menstrual difera prin prezenta unui numar mare de celule: rare leucocite, multiple poligonale nucleate, vaginale si in primele zile grupari de celule endometriale. Lipseste totodata cheagul (datorita lipsei fibrinei, un anticoagulant ) si este prezenta fibrinoliza.

Celulele vaginale, avand un continut glucidic mai bogat, se coloreaza mai intens in faza menstruala (pentru colorare se folosesc albastru de 1g, fucsina acida 1g, HCl cca 1g, apa); prezenta gruparilor de celule endometriale, eventual a fragmentelor glandulare, indica originea sangelui; colorarea celulelor este mai acidofila (roscata) in faza de menstruatie.

In cazul urmelor alterate nu se pot pune in evidenta enzimele fibrinolitice provenite din tesutul endometrial descompus deoarece reactia ramane inactiva.

Sangele fetal se recunoaste pe baza diferitei structuri hemoglobinice. Hemoglobina F (fetala) este mai rezistenta fata de baze decat cea a adultului hemoglobina A. proba se efectueaza prin comparatie cu un control A si F, prin tratare cu solutie de NaOH, situatie in care hemoglobina A se transforma in hematoglobina alcanica avand culoare bruna, iar hemoglobina F isi mentine culoarea rosie. Proba este doar orientativa. Mai precisa este mobilitatea variata la electroforeza, hemoglobina fetala avand o migrare mai lenta decat hemoglobina A.

Daca se dovedeste prezenta sangelui fetal, in mod obligatoriu se va proceda la examinarea citologica. La examenul microscopic se pot gasi corpuscule de meconiu si cristale de colesterol, celule epitetiale dermale, eventual distrofiate gras, celulele epiteliale din diferite mucoase, fire de lanugo etc.

5.3.4. Expertiza pentru determinarea intoxicatiilor

Toti pigmentii obtinuti in studiul urmelor de sange sunt derivati ai hemoglobinei. In anumite intoxicatii (oxid de carbon) acesti derivati sunt indicatori ai intoxicatiei fiind pusi in evidenta prin examinarea microscopica.

Oxihemoglobina HbO₂: o picatura de sange proaspat diluat in proportie de 1/100 da un spectru precis, format din doua benzi de absorbtie. Banda vazuta in stanga (spre rosu) este ingusta, inchisa la culoare, intensa si cu marginile calre. Maximul absorbtiei se situeaza intre 5769-5770 Å. Banda din dreapta este mai lata, mai putin intensa si cu contururi sterse. Maximul de absorbtie este de 5404 Å.

Oxihemoglobina redusa Hb (banda lui Stokes): se gaseste in sangele cadvrelor, dar in prezenta aerului se transforma rapid in oxihemoglobina (HbO₂). Spectrul de absorbtie este reprezentat de o singura banda, lata, putin intensa, cu marginile sterse (maxim de absorbtie = 5660 Å). Aceasta este banda lui Stokes. Acesti pigmenti sunt singurii care se observa in mod normal la o persoana in viata sau la un cadavru, in afara oricarei intoxicatii. Studiu spectroscopic se face si asupra altor pigmenti derivati din hemoglobina, fie in scopul diagnosticarii sangelui, fie in cursul investigarii intoxicatiilor.

Carboxihemoglobina: in cursul intoxicatiei acute cu monoxid de carbon (CO) acest gaz se fixeaza pe hemoglobina formand carboxihemoglobina, un pigment impropriu hematozei. Hematoza presupune transformarea sangelui venos in sange arterial prin eliminarea bioxidului de carbon si fixarea oxigenului din aerul inspirat pe hemoglobina sangelui venos din plamani. Carboxihemoglobina se poate identifica usor in sangele unei persoane decedate datorita unei intoxicatii acute netratate. Spectrul carboxihemoglobinei este apropiat de cel al oxihemoglobinei (HbO₂). Cuprinde doua benzi de absorbtie: cea din stanga are maximul absorbtiei la 5709 Å; este cea mai clara si cea mai intensa. Cea din dreapta are maximul la 5308Å. Diagnosticul se bazeaza pe absenta reductiei carboxihemoglobinei (HbCO) sub efectul hidrosulfitului de sodiu sau sulfhidratului de amoniac. In aceleasi conditii oxihemoglobina (HbO₂) s-ar transforma in oxihemoglobina redusa (banda lui Stokes). Din contra, spectrul carboxihemoglobinei nu se transforma deloc.

Examenul in infrarosu duce la aparitia unei nuante rosii-galbui in cazul oxihemoglobinei sau a unei tente de rosu aprins in cazul carboxihemoglobinei.

Pentru a determina valoarea coeficientului de intoxicatie (Q) in cazul intoxicatiilor acute se calculeaza raportul hemoglobina oxicarbonata - hemoglobina totala.

In numeroase cazuri de intoxicare pigmentul sanguin este transformat incomplet in carboxihemoglobina. Examinarea spectroscopica infatiseaza mai intai cele doua benzi cunoscute. Reductia oxihemoglobinei ramase duce la aparitia benzii lui Stokes. Dar, in acelasi timp, banda din stanga, in loc sa dispara in urma reductiei cu sulfhidrat de amoniac, dimpotriva, apare si mai intensa. In concluzie, singura care persista este absorbtia datorata carboxihemoglobinei, iar banda din stanga a acestui pigment este situata putin mai la stanga decat cea a oxihemoglobinei (HbO₂), ceea ce explica separarea clara. Pe baza acestor diferente se poate masura direct coeficientul de intoxicare oxicarbonata. Este suficienta masurarea lungimii de unda in zona maxima de intensitate a benzii din stanga si de a se raporta la tabelul urmator:

Intoxicatiilor mortale le corespunde un coeficient mai mare de doua treimi (0,66). In anumite cazuri, moarte survine cu un coeficient mai mic, situat intre 0,66 si 0,42, iar in mod exceptional, in situatia unei intoxicatii acute netratate, coeficientul poate fi inferior valorii de 0,42, dar neaparat superior cifrei de 0,30. In aceste cazuri, moartea survine datorita unei itoxicatii oxicarbonate asociata cu leziuni pulmonare, cardiace sau cu meningoencefalite secundare. In mod frecvent, intoxicatiile cu monoxid de carbon se combina cu intoxicatii cu alcool sau barbiturice. Descoperirea unui coeficient inferior valorii de 0,30 se explica prin existenta unei intoxicatii acute tratate. Subiectul intoxicat a respirat oxigen timp de mai multe ore, iar cantitatea de CO din sange s-a diminuat considerabil. Daca aceasta explicatie nu poate fi admisa (subiectul decedat nu a primit tratament), un coeficient sub 0,30 nu poate provoca moartea si atunci decesul trebuie atribuit altei cauze.

Methemoglobina: derivat feric corespondent al hemoglobinei reduse feroase; apare spontan in cursul putrefactiei, insa in cantitati reduse, in anumite boli familiale rare (cianoza congenitala), dar mai ales in cazul intoxicatiilor cu nitruti. In situatia intoxicarii acute cu oxidanti puternici (permanganatul de potasiu, clorat de potasiu) hemoglobina este deseori puternic alterata si transformata partial in methemoglobina.

Methemoglobina cianurata: spectrul sau caracteristic cuprinde o banda in zona albastrului la 5390 Å a carei intensitate descreste rapid si dispare in solutiile din ce in ce mai diluate. In acest caz devine vizibila o banda violet ingusta de 4100 Å.

In cazul intoxicatiei cu cianuri si acid cianhidric, cianomethemoglobina nu apar in sange. Culoarea rosie a sangelui si a organelor interne se datoreaza stoparii metabolismului tisular care nu mai reduce oxihemoglobina circulanta. Se gaseste o cantitate redusa de cianohematina in vasele parenchimului gastric. O explicatie ar fi urmatoarea: carbonatii alcalini, impuritati aproape constante din cianuri, degradeaza oxihemoglobina in hematina, pigmentul fixeaza cianurile.

5.3.5. Determinarea aproximativa a vechimii petei

In sangele uman, reactiile de peroxidaza dispar la monocite dupa aproximativ o luna, la neutrofile intre 8 si 12 luni, la eozinofile numai dupa 5 ani. Cand urmele de sange sunt intr-un strat mai gros, reactiile sunt pozitive in ciuda perioadei mari de timp care s-a scurs cu toate ca in straturile superficiale (crusta) numeroase neutrofile nu mai reactioneaza dupa un interval mai mare de un an.

Asadar se poate determina daca urma de sange e relativ proasopata (pana intr-o luna), daca a trecut mai mult de o luna, intre 8 si 12 luni sau chiar mai mult. Conditia prealabila este ca probele biologice sa fie protejate de actiunea unor anumiti factori climatice sau de mediu (umiditate, soare, lipsa aerului, descompunere). In general petele de sange se pastreaza bine pe haine, permitand un examen simplu, mai ales daca nu au fost udate.

5.3.6. Investigarea celulelor tisulare din urmele de sange

Fie ca sangele se gaseste pe arme albe sau pe diverse suprafete de la locul faptei sub forma de pete exista posibilitetea descoperirii de celule apartinand organelor atinse de arma respectiva. Aceasta operatie este una dintre cele mai delicate intrucat presupune dizolvarea urmei de sange fara a altera elementele celulare care se pot gasi in acestea. Pata de sange macerata se examineaza la microscop in urma colorarii cu thiomin a diferitelor resturi celulare.

Studii sistematice au condus la urmatoarele concluzii:

Orice organ lasa urme celulare pe arma care il traverseaza (perforeaza). Deseori e vorba de resturi celulare abia identificabile, dar prin cercetarea atenta si minutioasa se pot izola celule conservate din punct de vedere morfologic, usor de identificat. In situatiile cele mai fericite, in special in cazul ficatului si mai putin in cel al plamanilor, pot fi identificate, prin diferite tehnici de colorare, grupari celulare care indica in unele locuri apartenenta la o grupare organoida. In schimb, muschiul cardiac sau cel scheletic rareori lasa urme fibrilare caracteristice.

Conservabilitatea morfologica a elementelor celulare detasate este atat de mare incat ele pot fi identificate cu claritate atat in probe cu vechime de pana la o saptamana, cat si in urme de sange cu vechime de 1 sau 2 ani. Trebuie facuta aici o observatie de mare importanta: in timp ce aceste celule parenchimoase se pastreaza foarte bine, dintre elementele caracteristice ale sangelui, globulele albe au o rata de conservare scazuta.

Conservabilitatea morfologica nu este insotita si de persistenta aptitudinilor citobiologice astfel incat reactiile de peroxidaza de regula sunt negative.

Natura exacta si originea celulelor detasate nu poate fi afirmata cu precizie decat in cazul celulelor lui Malpighi, gruparilor celulare hepatice sau elementelor caracteristice ale sangelui.

Sangele din creier contine in plus fibre sau celule nervoase, cel provenit din abcese mai are in compozitia sa puroi si tesut celular. Sangele menstrual contine celule epiteliale vaginale si basofite de forma poligonala. Sangele provenit din ficat si splina se caracterizeaza prin predominarea globulelor albe.[12]

Sangele provenit din viol contine celule epiteliale vaginale, elemente vulvare si uneori sperma, iar sangele obstretical este amestecat cu meconiu, resturi placentare, par fetal etc. sangele nazal contine celule epiteliale cu cili vibratili.[13]

In concluzie, elementele celulare antrenate de lama unui obiect taietor - intepator prin traversarea unui tesut se conserva timp indelungat si pot fi identificate, dar numai in anumite cazuri.

Dupa efectuarea expertizei biocriminalistice a urmelor de sange, separat de acestea, se va proceda la efectuarea expertizei destinate obtinerii profilului ADN.[14]