BIOSENZORI

BIOSENZORI

Diagrama schematica a principalelor componente ale unui biosenzor. Biocatalizatorul (a) converge substratul la produs. Aceatsa reactie este constatata de traductor (b) care o converge intr-un semnal electric. Iesirea din traductor este amplificata (c), prelucrata (d) si prezentata (e).

Producerea de Biosenzori reprezinta, in present, un domeniu cu o extindere rapida, a carei viteza de crestere anuala a fost estimate la 60%. Impulsul major provine din industria producatoare de dispozitive pentru sanatate (de exemplu 6% din populatia Europei de vest este diabetica si trebuie sa beneficieze de disponibilitatea unor biosenzori rapizi, exacti si simpli pentru determinarea glucozei) dar si alte domenii solicita astfel de instrumente, asa cum sunt aprecierea calitatii alimentelor sau monitorizarea mediului inconjurator.

Se estimeaza ca piata mondiala a instrumentelor analitice este in jur de 15.000.000.000 € pe an, din care 30% reprezinta domeniul sanatatii. Este clar ca exista un vast potential al expansiunii acestei piete si din aceasta cel putin 0,1% este reprezentata 929j98j de biosenzori.

Cercetarile si dezvoltarile din acest domeniu sunt vaste si multidisciplinare cuprinzand biochimia, stiinta bioreactoarelor, fizica, chimia, electrochimia, electronica si ingineria de programare (software).

Biocatalizatorul trebuie sa fie inalt specific pentru scopul analizei;

sa fie stabil in conditii de depozitare normale si, cu exceptia benzilor enzimatice de hartie si dipsticks (a se vedea mai tarziu), sa prezinte o buna stabilitate pentru un numar larg de determinari (de exemplu mai mult de 100);

Reactia nu trebuie sa fie afectata de parametric fizici cum sunt agitarea pH sau temperatura. Aceasta ar permite analiza probelor cu un minim de pre-tratament.

Daca reactia implica cofactori sau coenzime, acestea ar trebui, in mod preferabil, sa fie co-imobilizati cu enzima;

Raspunsul trebuie sa fie exact, précis, reproductibil si liniar pe domeniul analitic utilizat, fara dilutie sau concentrare.

Trebuie de asemenea sa fie liber de zgomot electric;

Daca biosenzorul trebuie sa fie utilizat pentru monitorizarea sistemelor invazive in situatii clinice, trebuie sa micut si biocompatibil, sa nu aibe efecte antigenice sau toxice. Daca se vor utiliza in bioreactoare trebuie sa fie sterilizabili. Sterilizarea se realizeaza preferabil prin autoclavare dar nici un biosenzor cu enzime nu poate rezista unui asemenea drastic tratament termic-umed. In ambele cazuri, biosenzorul nu trebuie sa fie predispus spre viciere sau proteoliza;

Biosenzorul complet trebuie sa fie ieftin, mic, portabil si capabil de a fi utilizat chiar de operatori mai putin dotati;

Trebuie sa existe o piata pentru biosensor. Este clar ca exista o mica sansa sa se dezvolte un biosenzor daca alti factori (de exemplu subventii guvernamentale, angajerea continua a unor analisti dotati, sau slaba perceptie a consumatorilor) incurajeaza utilizarea metodelor traditionale si descurajeaza descentralizarea laboratoarelor de testare.

Din punct de vedere al semnalului inregistrat de traductori, exista asa numitele “generatii” de biosenzori:

• prima generatie la care produsul normal al reactiei difuzeaza spre traductor si determina un raspuns electric;
• a doua generatie sunt biosenzorii care implica “mediatori” specifici intre reactie si traductor in scopul de a genera raspunsul ce se valorifica;
• a treia generatie de biosenzori unde reactia insasi determina raspunsul si nu este implicat in mod direct nici un produs sau mediator.

Biosenzori Calorimetrici

Multe reactii catalizate de enzime sunt exoterme, generand caldura (table…). Aceasta poate fi utilizata ca baza pentru masurarea vitezei de reactie si astfel concentratia analitului. Aceasta reprezinta tipul de biosenzor cel mai aplicabil la modul general. Schimbarile de temperatura se determina, in mod obisnuit, prin intermediul termistorilor la intrarea si la iesirea dintr-o mica coloana ce contine un pat cromatografic realizat cu enzima imobilizata si care se afla intr-un mediu cu temperatura constanta (fig…). In asemenea conditii, precis controlate, pana la 80% din caldura generata in reactie poate fi inregistrata ca o schimbare de temperatura in procesul de curgere a probei prin coloana. Schimbarea de temperatura poate fi usor calculata din modificarea entalpiei si cantitatea care a reactionat. Daca 1 mM reactant este complet convertit in produs, intr-o reactie care genereaza 100 kJ/mol atunci fiecare ml de solutie genereaza 0,1 J de caldura. La o eficienta de 80%, aceasta va determina o schimbare in temperatura solutiei cu aproximativ 0,02⁰C. Aceasta este in general schimbarea de temperatura intalnita procesele enzimatice si pentru ca biosenzorul sa fie utilizabil, acesta trebuie sa aibe o rezolutie a temperaturii de 0,0001⁰C.

Tabel…

Productia de caldura (entalpii molare) a reactiilor catalizate de enzime

Fig… Diagrama schematica a unui biosenzor calorimetric. Curentul de proba (a) trece prin cutia exterioara izolata (b) spre schimbatorul de caldura (c) din interiorul unui bloc de aluminiu (d). De acolo, curentul de proba depaseste termistorul de referinta (e) si curge in patul cromatografic al bioreactorului (f, 1ml volum), ce contine biocatalizatorul, unde are loc reactia. Schimbarea de temperature este determinate prin intermediul termistorului (g) si solutia trece la vasul cu reziduuri (h). Sisteme electronice externe (l) determina diferenta in rezistenta, si astfel diferenta de temperatura, dintre termistori.

Termistorii, utilizati sa detecteze schimbul de temperatura, functioneaza prin modificarea rezistentelor lor electrice cu temperatura, si asculta de relatia:

  (2)

sau:

(3)

unde R₁ si R₂ sunt rezistentele termistorilor la temperaturile absolute T₁ si T₂ respectiv, iar B este o caracteristica constanta de temperatura pentru termistor.

Cand schimbul de temperatura este foarte mic, ca in cazul prezent, valoarea B(1/T₁)-(1/T₂) este mult mai mica decat unu si relatia (3) poate fi substantial simplificata folosind aproximatia, cand x<<1 atunci e^x 1 + x [am notat aici x = B(1/T₁)-(1/T₂)]. Relatia (3) devine:

  (4)

Deoarece T₁ T₂ acestea pot fi inlocuite la numitor prin T₁

  (5)

Descresterea relativa in rezistenta electrica (ΔR/R) a termistorului este proportionala cu cresterea temperaturii (ΔT). O constanta de proportionalitate tipica (-B/T₁²) este de

- 4%⁰C^-1. Modificarea rezistentei este convertita intr-o schimbare proportionala de voltaj, folosindu-se o punte Wheatstone balansata, ce incorporeaza un rezistor de precizie, inainte de amplificare.

ADP este analitul ce se determina si se adauga in sistem la un exces de glucoza, fosfoenol piruvat, NADH si oxigen pentru a se asigura maximum de reactie. Patru enzime (hexokinaza, piruvat kinaza, lactate dehidrogenaza si lactate oxidaza) sunt co-imobilizate in patul cromatografic al reactorului. In ciuda unei entalpii pozitive a reactiei piruvat kinazei, procesul global conduce la o crestere de 1000 de ori in senzitivitate, in primul rand datorita ciclului dintre piruvat si lactat.

Limitarea reactiei datorata scazutei solubilitati a oxigenului, poate fi depsita prin inlocuirea lui cu benzochinona, care este redusa la hidrochinona de catre flavo-enzime.

Asemenea sisteme de reactii, insa, au serioase dezavantaje prin faptul ca ele cresc probabilitatea existentei unor interferente in determinarea analitului de interes.

Reactiile implicand generarea de ioni de hidrogen pot fi facute mult mai sensibile prin includerea unei baze care degaja multa caldura la protonare. De exmplu, caldura produsa prin reactia penicilinazei poate fi aprope dublata prin utilizarea Tris(tris-(hidroximetil)aminometan) ca tampon.

In concluzie, principalele abantaje ale biosenzorilor cu termistori sunt aplicabilitatea generala si posibilitatea utilizarii lor in solutii tulburi sau puternic colorate. Cel mai important dezavantaj este dificultatea de a se asigura ca temperatura curentului de proba sa ramana constanta (± 0,01⁰C).