BIOTEHNOLOGIA REPRODUCERII ARTIFICIALE LA STURIONI

BIOTEHNOLOGIA REPRODUCERII ARTIFICIALE LA STURIONI

Statia de reproducere artificiala a pestilor, descrisa la cursul de ciprinicultura, ofera conditii favorabile reproducerii tuturor speciilor de pesti, cu modificari tehnice minime care au în vedere particularitatile biologiei reproducerii fiecarei specii. Pentru sturioni, aceste particularitati sunt:

1. Amplasamentul: în apropierea fluviului sau râurilor din care se pescuiesc reproducatorii
2. Dotarea cu viviera fluviala si viviera auto
3. Helesteele de crestere si prematurare au caracteristici tehnice modificate în comparatie cu cele destinate ciprinidelor:
1. forma dreptunghiular – alungita
2. prezenta unui dig submersibil incomplet, pe lungime, amplasat pe linia mediana longitudinala a helesteului
3. adâncimea mai mare de 2,5 m
4. debitul mare de alimentare – 200 mc/ora/ha
5. amplasarea în helesteu a unei pompe de tranzit, de debit mare, care sa creeze un curent de apa circular, perimetral
6. sedimentele constituite din pietris sau nisip
4. Dotarea obligatorie cu anestezice, masa operatorie si trusa chirurgicala, necesare recoltarii icrelor prin metoda chirurgicala
5. Incubatoare de tip Seth-green, Cealikov, Iuscenko, Zug – Weiss modificat Kazanskii, Cetate – Basarabi, Nucet, APPT – Brates 1, etc
6. Debitele de alimentare a incubatoarelor si bazinelor sunt mai mari decât la ciprinide
7. Dotarea cu instalatii de producere a hranei vii (terarii si bazine de pamânt, beton sau fibra de sticla)
8. Realizarea unor helestee destinate dezvoltarii postlarvare si cresterii puilor pâna la greutatea de 3 – 5 g/ex.

Fluxurile tehnologice sunt identice cu cele de la o statie de reproducere artificiala a ciprinidelor, cu exceptia fluxului tehnologic al reproducatorilor care se completeaza cu varianta: pescuit din râu, transportat cu viviere, parcare, prematurare, stimulare hormonala, maturare, recoltare icre sau lapti, parc 333c28d are postovulatorie, lansare în râu (sau helesteu de crestere) sau sacrificare

Stimularea maturarii elementelor sexuale

Stimularea maturarii elementelor sexuale se raelizeaza prin injectii cu hormoni, folosindu-se extracte hipofizare de crap sau sturioni, ori hormoni analogi gonadotropi: LHRH – A, Nerestin – 5A.

Extractele hipofizare se obtin, se prepara si se conserva prin metodele cunoscute.

Hormonii sunt substante chimice extrem de complexe, de tip glicoproteine sau steroizi, cu un puternic caracter de specificitate si, din cauza naturii lor biochimice complexe, nu pot fi obtinuti prin sinteza, ci numai prin extractie si purificare.

LHRH („Luteinizing Hormone Releasing Hormone”) este destinat stimularii hormonale a pestilor, iar varianta A (sau a) (LHRH – A) este creata special pentru sturioni. Se prezinta sub forma unei pulberi liofilizate, ambalata în flacoane a câte 1 mg. Se prepara pentru injectare prin diluare cu apa distilata sterila, în raport 1:2.

Nerestin este un produs rusesc, probabil de tip LHRH, destinat stimularii hormonale a maturarii gonadelor la pesti, iar varianta Nerestin – 5A este creat special pentru sturioni. Produsul se prezinta sub forma lichida, ambalat în flacoane a câte 20 ml. Se pare ca preparatul contine si o mica doza de anestezic.

Produsele folosite pentru inducerea stimularii hormonale a maturarii gonadelor la reproducatorii de sturioni, se prepara conform instructiunilor tehnice cunoscute în cazul extractiilor hipofizare sau conform prescriptiilor producatorului, în cazul hormonilor analogi gonadotropi.

În practica reproducerii artificiale a sturionilor se folosesc pentru stimularea maturarii gonadelor diferite scheme de injectare, cu orare si doze de hormoni diferite, functie de specia reprodusa, starea fiziologica a reproducatorilor, gradul de maturare a gonadelor, tipul hormonului folosit, temperatura apei etc.

Nu exista o procedura standardizata a orarului injectarilor si a dozelor aplicate, care sa garanteze obtinerea unor rezultate optimizate la maximum în reproducerea artificiala a sturionilor (a pestilor, în general). Tehnologul care cunoaste la perfectie biologia reproducerii artificiale a speciei cu care lucreaza, mecanismul fiziologic intim si corect al influentei hormonilor administrati, face observatii si determinari permanente asupra factorilor mediali de influenta si este preocupat de ceea ce face la un nivel atât de consistent încât i se induce o stare intuitiva a demersurilor pe care trebuie sa le întreprinda, elaboreaza schema optima de lucru aplicabila eficient fiecarui lot sau chiar fiecarui exemplar în parte.

Schema generala, orientativa, presupune administrarea a doua injectii la femele si a unei singure injectii la mascul. Intervalul între cele doua injectii administrate femelei este de 12 sau 24 de ore. Odata cu a doua injectie administrata femelei, se va realiza si injectarea masculului.

Schema generala privind planificarea injectarilor la sturioni (N. Patriche, 2001, pag. 86 si Marilena Talpes, 1998, pag. 70 modificat M. Cuvinciuc) folosind hipofiza de sturioni, în intervalul de temperatura de 16 - 22 C, este urmatoarea :

1. I₁ –––– 12 ore –––– I₂ –––– 18-26 ore –––– ovulatie
2. I₁ –––– 24 ore –––– I₂ –––– 10-18 ore –––– ovulatie

Din doza totala calculata pentru fiecare femela, 10 – 50% se administreaza la prima injectie si diferenta de 50 – 90% la a doua injectie.

În intervalul de temperatura 18 - 22 C, în mod frecvent, nu mai este necesara a doua injectie la femele si procentul de maturare a ovarului este de 90%.

La masculi, doza calculata este administrata la o singura injectie.

Dozele de substante hormonale stimulatoare sunt:

Observatii:

• Hipofiza de crap nu este recomandata pentru intervalul de temperatura 13 - 16 C sau doza se suplimenteaza cu 50% si se administreaza în 3 (trei) reprize la intervale de 24 si 12 ore.
• Eliminarea produselor seminale are loc în intervalul 396 – 715 grade ore, functie de termica apei si substanta administrata (396 grade ore în cazul folosirii hipofizei de sturioni la temperatura apei de 18 C si 715 grade ore în cazul folosirii hipofizei de crap la temperatura apei de 13 C)
• Dupa 500 grade ore de la prima injectare, controlul femelelor trebuie sa se faca din 30 în 30 de minute
• În mod frecvent, ovulatia femelelor are loc seara sau dimineata, deci la crepuscul. Trebuie avuta în vedere aceasta specificitate, la stabilirea orarului de administrare a injectiilor.

Colectarea produselor seminale

Procedurile de obtinere a ovulelor mature de la femelele de sturioni, în vederea fecundarii artificiale, sunt urmatoarele:

• Prin sacrificarea femelei
• Prin mulgere
• Prin interventie chirurgicala (cezariana)

Procedurile de obtinere a spermei de la masculii de sturioni, în vederea folosirii pentru fecundarea artificiala a ovulelor mature, sunt urmatoarele:

• Prin sacrificarea masculului
• Prin mulgere
• Prin extractie cu sonda

Sacrificarea femelei pentru obtinerea ovulelor mature este metoda folosita în perioada de pionierat în reproducerea artificiala a sturionilor, deoarece numarul reproducatorilor pescuiti din râuri, în scop comercial, era mare, tehnicile privind reproducerea artificiala erau neperformante si se avea în vedere reducerea cheltuielilor ocazionate de parcarea, întretinerea sau cresterea reproducatorilor. În timp, toate aceste conditii s-au schimbat, inclusiv mentalul tehnologilor si metoda mai este utilizata doar în cazul sturionilor de mari dimensiuni si a statiilor de reproducere deservite de personal tehnic neexperimentat.

Procedura de obtinere a ovulelor mature prin sacrificarea femelei presupune parcurgerea a trei etape lucrative: asomarea si desângerarea femelei, sectionarea peretelui abdominal si prelevarea ovulelor mature.

Asomarea reproducatorilor se realizeaza prin administrarea de anestezice, socuri electrice sau a unei lovituri puternice în zona cefalica.

În primul caz, reproducatorul sacrificat nu poate fi destinat consumului uman si, de aceea, metoda este foarte rar utilizata.

În cazul administrarii socurilor electrice, nu s-au cercetat suficient efectele electronarcozei asupra structurii intime a ovulelor mature si, deci, a procentului de fecundare, a procentului de eclozare si a viabilitatii larvelor pâna la resorbtia sacului vitelin.

Asomarea fizica, prin aplicarea unei puternice lovituri în zona cefalica, nu este etica dar este traditionala si se practica in momentul capturarii în cazul reproducatorilor de mari dimensiuni, obligatoriu in cazul morunului, care altfel nu poate fi ambarcat. Se recomanda in acest caz particular, desângerarea imediata si recoltarea ovulelor mature in cel mai scurt timp.

Dupa asomare, reproducatorul este supus desângerarii imediate, se deschide peretele abdominal si se preleveaza icrele ovulate. Aceasta operatiune trebuie efectuata de un operator cu experienta si icrele sunt colectate în vase de sticla sau plastic dur bine slefuit (lucios), în portii de 200 - 300 g, în straturi foarte subtiri, chiar într-un singur strat, daca este posibil. Nu se recomanda colectarea în acelasi vas a icrelor de la mai multe femele. Lichidul ovarian se scurge din vasele de colectare.

Metoda „mulgerii” femelelor în vederea obtinerii ovulelor mature se practica pentru femelele de dimensiuni relativ mici (pâna la 20 – 30 kg/ex.) si în conformitate cu procedura clasica.

În cazul reproducatorilor salbatici, este obligatorie sedarea usoara cu anestezicele folosite în piscicultura: MS-222, Combelon sau Cloralhidrat.

Maturarea ovulelor are loc în gonada în zone (straturi) învecinate, orientate dorso-ventral si antero-posterior, astfel încât pornind de la porul genital spre extremitati, vom gasi ovule în stadii diferite de maturare, respectiv IVc, IVb, IVa etc.

Stimularea hormonala corecta va induce maturarea completa a 60% din ovare; 30% vor fi în stadiul preovulator si 10% vor fi ovocite imature aflate în stadiul III si II de maturare, care u trebuie, în nici un caz, recuperate.

Ovocitele aflate în stadiul preovulator ajung în stadiul ovulator (fecundabile) în interiorul sau exteriorul femelei, într-un interval de 20 – 40 minute. Obligatoriu, aceste ovocite vor fi colectate separat, în vase largi în care vor fi dispuse într-un singur strat.

Procedeul de obtinere a icrelor ovulate prin mulgerea femelelor este cea mai simpla si nestresanta metoda, dar necesita o buna experienta în stimularea hormonala a maturarii gonadelor si operatori bine calificati pentru toate fazele tehnologice.

Metoda chirurgicala (cezariana) este o metoda moderna, laborioasa, dar aplicata din ce în ce mai frecvent pentru ca asigura în majoritatea cazurilor atât recoltarea unei cantitati mai mari de icre mature, cât si supravietuirea femelei. Aceasta metoda presupune parcurgerea a  3 (trei) etape:

• Anestezierea femelei
• Efectuarea inciziei si prelevarea ovulelor mature
• Reanimarea femelei

Toate aceste proceduri pot fi realizate numai de un operator cu experienta în domeniu. Erorile de dozare a substantelor, necunoasterea reactiei femelelor anesteziate, efectuarea incorecta a inciziei, prelevarea brutala a icrelor ovulate, sutura neglijenta, nesterilizarea instrumentarului si, mai ales, necunoasterea sau nerespectarea procedurilor de reanimare conduc la rezultate proaste: recoltarea ovocitelor nemature, poluarea icrelor ovulate cu sânge, mucus sau fecale, infectarea zonei operatorii sau / si moartea femelei.

Anestezierea se realizeaza cu produsele folosite în piscicultura: MS-222, Combelen sau Cloralhidrat, administrate în dozele recomandate de producator, prin pulverizare asupra branhiilor, îmbaierea femelei sau injectate intramuscular.

Supradozarea anestezicelor poate determina moartea reproducatorului, iar subdozarea va determina iesirea din narcoza în timpul procedurilor chirurgicale si imposibilitatea continuarii operatiei decât prin asomarea femelei.

Operatia chirurgicala se efectueaza cu o trusa chirurgicala mica, standard, pe o masa operatorie (fig. 3a si 3b), dupa curatarea si dezinfectarea zonei operatorii.

Dezinfectantele recomandate sunt nitrofurazon 4% si septosol 10%.

Incizia se realizeaza pe linia median-ventrala plecând de la 1 – 2 cm de orificiul genital spre partea anterioara si nu va avea lungimea mai mare de 7 – 10 cm la exemplarele medii sau mari si maxim 5 cm la cega.

Icrele ovulate sunt recoltate prin masaj usor antero-posterior si dorso-ventral sau cu ajutorul unei spatule de lemn.

Incizia va fi suturata, zona operatorie dezinfectata si se recomanda administrarea unei injectii intramusculare cu cloramfenicol hemisuccinat de sodiu 4‰, 2 ml/kg corp.

Reanimarea femelei se initiaza prin spalarea branhiilor cu apa curata si bine oxigenata si transferul acesteia într-un bazin acoperit, alimentat cu debit mare de apa bogata în oxigen solvit, amplasat într-o zona linistita a statiei. Femela este supravegheata permanent 24 – 48 ore si apoi transferata în helesteul de crestere (sau eliberata în fluviul de unde a fost pescuita).

Sperma se recolteaza de la reproducatorul mascul fie concomitent cu recoltarea icrelor ovulate de la femele, fie cu câteva ore sau zile înainte. Se recomanda prelevarea si folosirea spermei de la 2 -3 masculi pentru fecundarea fiecarei portii de icre ovulate, cu scopul de a compensa eventuala calitate slaba a spermei unui mascul.

Sperma sturionilor poate fi pastrata la temperatura de 4 C timp de 12 ore, mobilitatea spermatozoizilor mentinându-se la 65% sau un timp nelimitat daca este crioconservata. În acest caz, mobilitatea spermatozoizilor va depinde de componenta mediului de conservare, protectorul utilizat si rigurozitatea respectarii procedurilor de congelare, pastrare si decongelare. Se pot obtine indicatori de mobilitate a spermatozoizilor la nivelul a 85 – 90%.

Prelevarea spermei prin sacrificarea masculului se efectueaza respectând cu rigoare procedurile practicate la recoltarea icrelor ovulate de la femele. Este o procedura aplicata în situatii conjuncturale, când masculii sunt destinati consumului uman si exista conditiile necesare conservarii spermei. Având în vedere usurinta cu care poate fi prelevata sperma, uneori si fara stimulare hormonala si, de cele mai multe ori, fara a pune în pericol viata reproducatorului, urmatoarele doua metode sunt frecvent folosite pentru prelevarea elementelor seminale de la masculii de sturioni.

Prelevarea spermei de la masculi prin „mulgere” se face conform procedurilor clasice: sedat sau nesedat, masculul este imobilizat, sters de apa si mucus si, prin masaj usor antero-posterior si dorso-ventral, sperma va fi prelevata si colectata într-un vas perfect uscat.

Prelevarea spermei cu ajutorul unei sonde este metoda moderna, folosita în majoritatea statiilor de reproducere artificiala. Aceasta procedura, simpla si eficienta, poate fi folosita si în zonele de pescuit cu conditia asigurarii conservarii spermei.

Masculului stimulat hormonal sau nu, dar aflat în stadiul de spermiatie, i se introduce în orificiul uro-genital un tub tygon (perfuzor) cu lungimea de 5 – 10 cm. La aceasta sonda se ataseaza o seringa perfect uscata si se aspira o anume cantitate de sperma, de obicei necesara pentru fecundarea unei portii de ovule. Se folosesc mai multe seringi, pentru a preleva toata cantitatea de sperma matura sau cantitatea necesara.

Obligatoriu, înainte de a fi folosita pentru fecundarea icrelor, sperma este supusa unui test de calitate prin care se stabileste coeficientul de mobilitate si timpul de fecunditate al spermatozoizilor. Trebuie stiut faptul ca spermatozoizii de sturioni, ca si ai altor pesti, sunt imobili în momentul recoltarii (ejacularii) pâna la contactul cu apa (mediul de activare). În prima perioada, diferita ca timp în functie de temperatura apei, spermatozoidul efectueaza o miscare rapida si rectilinie, timp în care se manifesta capacitatea de fecundare. Urmeaza o perioada cu miscari oscilatorii, dezordonate, cu viteza descrescânda, când spermatozoidul nu mai asigura fecundarea si apoi, oprirea si inactivarea completa.

Testul de calitate a spermei poate fi efectuat dupa metoda descrisa de Billard, 1984 si scara lui Sanques:

• Coeficientul de mobilitate reprezinta raportul dintre spermatozoizii cu miscari rapide si rectilinii în primele 30 de secunde de la activare si spermatozoizii imobili sau cu miscari ondulatorii;
• Timpul de fecunditate este reprezentat de timpul în care cel putin 50% din spermatozoizi prezinta miscari rapide si rectilinii;
• Timpul de încetare a mobilitatii, indica perioada în care fecundarea a luat sfârsit si amestecul de icre si sperma a devenit inactiv

Fecundarea

Ovocitul, aflat în stadiul IV de maturare (fig. 4), este format dintr-o membrana tripla, cu un strat exterior gelatinos si un strat interior fin radiat, iar in interior, o zona plina cu granule mari de vitelus si picaturi mari de grasime numita emisfera vegetala (polul vegetal), un nucleu care contine 4 (patru) seturi de cromozomi (numit si vezicula germinala) situat în centrul polului vegetal si o zona citoplasmatica în care se gasesc granule foarte mici de vitelus si mici sfere de grasime, numit si emisfera animala (pol animal). Imediat sub membrana se afla un strat de mici vezicule, numite granule de pigment, repartizate în marea lor majoritate în zona polului vegetal. Aceasta repartizare, specifica sturionilor, determina o coloratie gri-închis în zona polului vegetal si o pata rotunda mai deschisa la culoare sau chiar albicioasa situata în centrul polului animal si înconjurata de un inel evident întunecat. Ovocitul (icra) este acoperit de un dublu învelis folicular, un strat folicular granulos intern care înconjura intim membrana ovocitului si un strat fibros extern ce contine vase sanguine.

În stadiul IV de maturare, nucleul este supus unui proces de polarizare, pe parcursul caruia migreaza din zona centrala a ovocitului (polul vegetal) spre extremitatea superioara, adica în zona polului animal.

Pe masura ce nucleul migreaza spre polul animal, în acea zona se formeaza micropilii, în numar de 5 – 40 si se slabeste legatura cu învelisul folicular.

În acest stadiu de maturare a ovulelor, glanda hipofiza elibereaza o cantitate mare de hormoni gonadotropi care induc finalizarea rapida a polarizarii nucleului, formarea micropililor, formarea unor vacuole între stratul folicular granulos si startul gelatinos, marirea acestora pâna la separarea celor doua straturi, lizarea învelisului folicular si eliberarea ovulului în cavitatea celomica.

Odata initiat, acest proces se va continua implacabil, fara a mai fi influentat de factori exteriori ovocitelor, chiar de natura hormonala. Ovocitele aflate în stadiul preovulator ajung în stadiul ovulator (fecundabile), în interiorul sau exteriorul femelei, într-un interval de 20 – 40 minute.

Din momentul dezvoltarii vacuolelor de separare a ovulului de stratul folicular, se reduce alimentarea cu oxigen a icrei, iar din momentul lizarii stratului folicular, alimentarea cu oxigen se întrerupe. Stationarea ovulelor mature în cavitatea celomica pe o perioada mai mare de 2 – 3 ore conduce la supramaturarea ovulelor, manifestata prin initierea procesului de închidere a micropililor, ceea ce determina reducerea ratei de fecundare.

Deci, este necesar ca icrele ovulate sa fie prelevate imediat dupa ce ajung în cavitatea celomica si supuse procedurilor fecundarii.

Spermatozoidul de sturion are structura obisnuita, constituita din cap, zona intermediara si flagel.

Capul are forma mult alungita si este prevazut în partea anterioara cu zona acrozomala, care se prezinta sub forma unui capacel, rotunjit în afara. Interiorul capului este ocupat în cea mai mare parte de nucleu, înconjurat de trei canale nucleare dispuse elicoidal.

Zona intermediara are forma cilindrica.

Flagelul este de 6 – 7 ori mai lung decât capul si membrana externa este prevazuta cu pliuri având rol de propulsare si directionare.

Spermatozoizii devin activi imediat ce vin în contact cu apa. Miscarile lor sunt liniare, ferme si au viteza de circa 100 μ/sec.

În momentul în care spermatozoidul atinge intrarea în micropil, se declanseaza reactia acrozomala, adica, la sturioni, eliberarea unei substante care induce dilatarea micropilului si faciliteaza penetrarea acestuia de catre capul spermatozoidului. Imediat, materialul continut în cele 3 (trei) canale nucleare din capul spermatozoidului este împrastiat în fata si se combina cu citoplasma ovulului, iar flagelul se desprinde, deoarece rolul de propulsor s-a încheiat.

Instantaneu, în ovul se declanseaza reactia corticala care se propaga imediat în toata zona polului animal si, apoi, prin difuzie rapida, în toata zona polului vegetal. Reactia corticala înseamna deschiderea granulelor corticale, varsarea continutului acestora si formarea, din aceste materii, a unei membrane unicelulare aderenta la membrana icrei, care împiedica patrunderea unui alt spermatozoid si care va constitui învelisul viitorului embrion. Toate aceste transformari initiale, dar profunde, ale ovulului fecundat, care pregatesc aparitia unei noi vieti, au loc rapid si se petrec pe parcursul a circa 5 minute.

Dupa penetrarea micropilului, capul spermatozoidului îsi mareste volumul, iar nucleul spermatozoidului capata un aspect veziculos si migreaza spre centrul polului animal, se contopeste cu nucleul ovulului, iar membranele plasmatice ale celor doi gameti se unesc într-o unica membrana a zigotului.

Se initiaza prima diviziune a zigotului si dezvoltarea noului individ începe din acest moment.

În acelasi timp cu transformarile intime, dar profunde care au loc în interiorul ovulului, ca urmare a contactului cu apa, icra se hidrateaza, îsi mareste volumul de circa 1,5 – 2 ori, iar la exteriorul membranei este secretata o substanta bogata în mucoproteine, puternic cleioasa, cu ajutorul careia, în conditii naturale, icra adera la substrat.

Pentru a împiedica formarea de aglomerari de icre, imediat dupa fecundare se efectueaza descleierea icrelor, o operatiune care se realizeaza prin doua metode:

• Metoda chimica: presupune lizarea mucoproteinelor sub actiunea alternativa si repetata a doua preparate: solutie de uree 0,4% si clorura de sodiu 0,3%, respectiv acid tanic 0,1%. Metoda asigura descleierea rapida si eficienta, dar necesita o rigoare deosebita în respectarea concentratiei substantelor chimice;
• Metoda fizica: presupune îndepartarea mucoproteinelor prin spalari repetate cu suspensii de namol, argila, bentonita, calc sau lapte praf degresat.

Incubatia icrelor

Imediat dupa descleiere, icrele fecundate sunt transferate în incubatoare care, în prealabil, au fost umplute la 70% din capacitate.

În mod curent, în statiile de reproducere artificiala din România, pentru incubatia icrelor de sturioni, se folosesc 3 (trei) tipuri de incubatoare:

• Zug – Weiss, modificat, cu capacitate de 8 l; asigura fecundarea a 300g icre. Modificarile constau în diminuarea înaltimii de la 60 cm la 50 cm, montarea unui manson în partea superioara pentru ghidarea larvelor eclozate si racordul la un jgheab de colectare pentru o baterie de 8 – 10 incubatoare;
• Nucet, cu capacitatea de 180 l; asigura fecundarea a 700 – 800 g de icre într-un volum utilizat de 125 l apa.
• APPT – Brates 1, un incubator de tip nou, aflat în curs de omologare, realizat dupa o conceptie a biologului Arkadie Vedrasco de la Statiunea de Cercetari Piscicole Chisinau. Incubatorul este format dintr-o cuva paralelipipedica, prevazuta cu o instalatie de alimentare originala, constituita dintr-un recipient basculant în momentul în care se umple cu apa la un anume nivel. Astfel, periodic, apa de alimentare este deversata în incubator si determina o usoara miscare de rotatie icrelor incubate. Capacitatea de incubatie este de 1 – 2 kg icre fecundate.

Debitele de alimentare trebuie reglate cu mare rigurozitate în toata perioada de incubatie a icrelor datorita sensibilitatii deosebite a membranei icrelor, a embrionilor si a sacului vitelin al larvelor în perioada imediata eclozarii. În primele 20 – 60 ore de incubatie, de la fecundare pâna la gastrulatie (pentru intervalul de temperatura a apei de 24 - 13 C), debitul de alimentare este de 1 l/min pentru fiecare 100 g icre incubate si se mareste gradual pâna la 2,5 l/min pentru fiecare 100 g incubate, în faza eclozarii.

Determinarea procentului de fecundare

Metoda de determinare rapida si precisa a procentului de fecundare a icrelor de sturioni a fost conceputa de T.A. Detlaff, A.S. Ginsgurg si O.I. Schmalhausen (1993)

Sunt supuse studiului icrele aflate în faza a II-a a diviziunii, stadiul 5 = 4 blastomere, adica la circa 9 ore dupa fecundare la temperatura apei de 13 C, la circa 4 ore dupa fecundare la temperatura apei de 20 C si circa 3,5 ore la temperatura apei de 24 C.

Icrele din incubator se omogenizeaza prin amestec usor cu mâna si se recolteaza aleatoriu circa 150 – 200 boabe. Acestea se transfera într-un vas Petri, acoperite cu apa (tehnologica) si sunt supuse observatiilor cu o lupa sau stereomicroscop. Se numara: icrele polispermatice, icrele activate, icrele normale si icrele nefertilizate. Se calculeaza ponderea fiecarei categorii. Daca icrele polispermatice si cele nefertilizate reprezinta sub 6%, respectiv 10%, procentul de fecundare este considerat foarte bun.

În productia comerciala, realizarea unui procent de fecundare mai mic de 50% poate determina decizia de renuntare la acel lot de reproducatori din considerente economice. Din acest motiv, acuratetea determinarii procentului de fecundare este deosebit de importanta si acest studiu trebuie realizat de operatori cu experienta.

Icrele de sturioni, fecundate, sunt foarte sensibile la atacul fungic sau bacterian, ceea ce obliga la aplicarea unor tratamente preventive în primele 24 de ore de la incubatie si a tratamentelor curative, atunci când este cazul.

Tratamentele preventive se realizeaza cu verde malachit 67 ppm, timp de 30 sec, la 12 si, respectiv, 24 de ore de la fecundare. Verdele de malachit poate fi folosit si în tratamente curative, atunci când este cazul, în aceeasi concentratie si acelasi interval de timp.

Tratamentele curative pot fi realizate si cu violet de gentiana, solutie 1%, 0,2 – 0,3 ml/l apa din incubator, în flux, la intervale de 8 – 12 ore sau cu formalina, 1:500, timp de 15 minute, la intervale de 12 – 24 ore.

Important: tratamentele cu formalina nu se efectueaza în primele 48 de ore de la fecundare si nici în ultimele 24 de ore, înaintea eclozarii.

Recomand tratamentele cu verde malachit.

Eclozarea larvelor

Eclozarea are loc dupa un interval de timp care depinde în mod direct de specie si temperatura apei din incubatoare, astfel:

(dupa A Nicolau, 1973, pag. 62; N Patriche, 1997, pag. 119; M. Talpes, 1998, pag. 91 si M Costache, 2004, pag. 98)

Pe masura ce eclozeaza, larvele sunt antrenate de curentul de apa prin jgheabul de colectare (la incubatoarele Zug – Weiss si APPT – Brates 1) si concentrate într-un bazin de colectare prevazut cu un juvelnic de nital. În aceasta faza tehnologica, reglarea debitului de alimentare (si, deci, evacuare) a incubatorului este de o importanta deosebita. Cresterea debitului de alimentare chiar si cu 0,5 l/min conduce la traumatizarea larvelor, îndeosebi în zona sacului vitelin. De aceea, este necesar sa se micsoreze debitul, dar fara sa diminuam oxigenul solvit sub 6 mg/l (în incubator) si, în acelasi timp, sa antrenam larvele în curentul de apa de evacuare spre colector. Din juvelnic, larvele sunt transferate în bazine de fibra de sticla, cu capacitatea de 240 de litri, la o densitate de 60 – 90 ex./l. Incintele destinate parcarii temporare (4 zile) trebuie sa aiba asigurat un debit de alimentare de 5 – 6 l/min si sa creeze un curent de apa ascendent, eventual circular în plan vertical. Prelevarea larvelor se realizeaza, obligatoriu, împreuna cu un volum de apa, cu castroane de plastic, iar numararea se efectueaza de un operator cu mare experienta. Nu recomand prelevarea larvelor cu paleta sau alt sistem „uscat” (fara apa) din cauza fragilitatii excesive, mai ales a sacului vitelin. Sa nu uitam ca, în momentul eclozarii, embrionul este dezvoltat incomplet: nu are gura, ochi, anus, înotatoare, „tegument” etc. si, de aici, fragilitatea deosebita. Larvele eclozate în incubatoare Nucet îsi vor continua aici dezvoltarea postembrionara larvara) pâna la vârsta de 3 zile. Aceasta procedura determina obtinerea unei supravietuiri mult mai bune, din doua motive:

• Este evitata traumatizarea larvelor prin colectare, concentrare, prelevare si transfer în alte incinte;
• Primele 3 (trei) zile, larvele nu au format sistemul „propulsor” si sacul vitelin reprezinta un lest important. În aceste conditii, ele nu pot înota pe orizontala si executa doar miscari sacadate pe verticala, de la fund spre suprafata apei, urmate de o cadere libera dupa ce se epuizeaza. Acest efort urias necesita un mare consum de energie si deci de hrana din rezerva vitelina. În incubatoarele tip Nucet se realizeaza un curent de apa circular în plan vertical care, în ramura ascendenta, usureaza foarte mult înotul larvelor spre suprafata. Energia economisita este folosita de larve pentru consolidare fiziologica, cu dublu efect pozitiv: dezvoltarea si cresterea mai rapida, respectiv, vitalitate mai buna si, deci, supravietuire mai mare.

Dezvoltarea larvara

La varsta de 96 ore (4 zile) de la eclozare, larvele sunt prelevate (cu apa) si transferate în bazine din fibra de sticla (de tip Ewos, s.a.) cu capacitati de 240 (max. 500) l, la densitati de 60-90 ex/l. În aceste bazine, larvele sunt crescute pâna la stadiul de alevin (8-10 zile de la eclozare) sau, dupa o rarire prealabila, chiar pâna la stadiul de pui (25 – 30 de zile de la eclozare).

La vârsta de 6 zile, larvele formeaza la fundul bazinului o aglomerare aflata într-o dinamica activa, numita roi sau nor.

Imediat ce elimina dopul melanic, larvele se separa de roi si încep sa caute hrana. Daca hrana specifica lipseste, larvele mai dezvoltate manifesta agresivitate marita si devin canibale, consumând larvele mai putin dezvoltate.

Din momentul trecerii la hrana exogena, în bazine este obligatoriu sa asiguram forme zooplanctonice mici, accesibile larvelor de sturioni. În acest scop, se recomanda administrarea zilnica a 100 cm³ zooplancton/m³ apa, înca din ziua a 7-a de la eclozarea larvelor. Zooplanctonul poate proveni din culturi industriale pregatite si realizate pe baza unui program calendaristic riguros sau din helestee, colectat cu metodele cunoscute. Din momentul formarii roiului, se administreaza zilnic Tubifex maruntit, „ad libitum”. La administrarea zoobentosului, se opreste alimentarea cu apa timp de 30 – 40 minute pentru a acorda timpul necesar hranirii larvelor (curentul de apa evacueaza destul de rapid zoobentosul maruntit). Oxigenul nu trebuie sa fie mai mic de 6 mg/l, valoarea optima fiind de 8 mg/l in toata perioada dezvoltarii larvare.